一种杂帖类化合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种杂帖类化合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用。具体涉及一种杂帖类化合物及其药物组合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用。该应用中的化合物为首次报道，是一种结构新颖的杂帖类化合物，可以从干燥的蛇床子中提取、分离纯化得到。本研究证实该化合物对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在浓度依赖关系。应用化合物(Ⅰ)治疗以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为一种有前景的治疗方法，可以用来开发成治疗骨破坏性疾病的药物。
【专利说明】
一种杂帖类化合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的蛇床子中分离得到的一种杂帖类化 合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨骼通过破骨细胞(0C)的骨吸收和成骨细胞(0B)的骨形成来保持其动态平衡，0C 是骨吸收的唯一细胞，它的增多或活性增强就会引起一些股破坏性疾病，例如骨质疏松症、 多发性骨髓瘤骨病、类风湿关节炎的骨破坏、肿瘤骨转移导致的骨破坏等。
[0003] 植物蛇床子为一年生草本植物，高30~80cm。茎直立，有分枝，表面有纵沟纹，疏生 细柔毛。叶互生，2~3回羽头细裂，最终裂片线状披针形，先端尖锐;基生叶有长柄，柄基部 扩大成鞘状。复伞形花序顶生或腋生;总苞片8~10,线形;花白色，花柱基短圆锥形，花柱细 长，反折。双悬果宽椭圆形，果棱具翅。花期4~7月，果期6~8月。生于原野、田间、路旁、溪沟 边等潮湿处。
[0004] 中药蛇床子为伞形科(Umbelliferae)蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri (L.) Cuss.的干燥成熟果实。蛇床子性温，味辛苦，有小毒。外用燥湿杀虫止痒，内服温肾壮阳，祛 风燥湿。用于治疗阳痿，宫冷，寒痹腰痛，外治滴虫性阴道炎，手、足癣感染等。国内外关于蛇 床子药理效应的报道很多，涉及免疫、神经、内分泌、心血管、呼吸及生殖等系统，主要表现 为抗炎、抗过敏、中枢抑制、抗心律失常及抗肿瘤等作用。
[0005] 蛇床子主要含香豆素类化合物，此外还有色原酮类和苯并呋喃类化合物。蛇床子 挥发油中，相对含量较高的组分主要有倍半萜类，此外还有酯类和萜醇类化合物。大量研究 证明蛇床子的有效成分为香豆素类化合物，其中含量最高的两种香豆素类化合物为蛇床子 素(Osthole，0st)、欧前古月素（Imperatorin，Imp) 〇
[0006] 因此Ost及Imp经常作为评价不同来源地的蛇床子药材的质量及含蛇床子中成药 的质控指标。由于〇st具有许多重要的药理活性包括抗癌、抗增殖等活性，以及Imp具有抑制 癫痫发作、扩张血管、抑制心肌肥大、抑制肿瘤细胞增殖、抗微生物、影响药物代谢酶活性等 多种药理作用，而受到越来越多的关注。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种从干燥的蛇床子中分离得到的一种杂帖类化合物及含 其的药物组合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用。
[0008] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0009] -种杂帖类化合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用，具有下述结构式的化 合物(I)，
[0010] (I)
[0011] 上述应用中，所述化合物（I)从干燥的蛇床子中分离得到，具体包含以下操作步 骤：（a)将干燥的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体 积，再用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏； (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d) 中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度 洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0014] -种药物组合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用，所述药物组合物含有治 疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0019] 本发明的应用能够治疗以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病，实验表明化合 物（I)对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在浓度依赖关系。应用化合物（I)治疗 以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为一种有前景的治疗方法，可以用来开 发成治疗骨破坏性疾病的药物。
【附图说明】
[0020] 图1为化合物(I)结构式；
[0021] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0023]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0024] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0025]制备方法：（a)将干燥的蛇床子(8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(25LX3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(351g)和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用 75%乙醇洗脱8个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（133g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(8个柱体积）、65:1 (8个柱体积）、30:1 (6个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 25:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(17g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(31mg)。
[0026] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 359.1112，结合核磁特征可得分子式为 CuftioO?，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-2 (6 · 43，s)，H-5 (3.26，d，J=15.1)，H-5(2.65，d，J=15.1)，H-8(2.37，m)，H-8(2.25，m)，H-9(1.91，dd，J = 12.7,7.3)，H-9(1.35，m)，H-ll(3.81，s)，H-15(1.21，s)，H-16(1.29，s)a-OH(12.87，s)，4-OH(8 · 75，s)，6-OH(4 · 73，s)，3-0CH3(3 · 85，s);核磁共振碳谱数据(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 158.5(C3-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C，3-C)，138.7(C，4-C)，30.9(CH2,5-C)，89.8(C，6-C)，202.7(C，7-C)，24.6(CH2,8-C)，31.4(CH2,9-C)，64.3(C，10-C)，73.9(CH，11-C)，199.3 (C，12-C)，114.2(C，13-C)，122.6(C，14-C)，21.3(CH3，15-C)，16.7(CH 3，16-C)，56.1(CH3,3-〇CH3);碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有羟基基团（3442CHT 1);此外该化合 物在373和294nm有紫外吸收，说明含有多共辄结构。13C NMR谱和HSQC谱显示有17个碳信号， 分别为三个甲基(包括一个甲氧基），三个亚甲基，两个次甲基(一个烯烃碳，一个含氧碳）以 及九个季碳(两个羰基碳，两个烯烃碳，两个含氧季碳，三个烯烃含氧季碳）。另外，一个烯烃 质子信号 5册.43(1!1，8，!1-2)，以及六个烯碳信号5(：158.5((：，1-〇,99.0(〇1，2-〇，154.2((：， 3-C)，138.7(C，4-C)，114.2(C，13-C)和 122.6(C，14-C)，表明该化合物含有一个五取代的苯 环结构。HMBC谱中，羟基质子0H12.87，s，l-〇H)与C-1，C-2，C-13以及SC199.3(s，12-C)的相 关性表明羰基碳(C-12)与苯环C-13位相连，该化合物在373和294nm的紫外吸收也验证了这 一结论。HMBC谱中，羟基质子3!18.75(1!1，8,4-〇!〇与3(：138.7((：，4-〇，154.2((：，3-〇和122.6 (C，14-C);甲氧基质子SH3.85(s，3-0CH 3)与C-3;以及H-2与C-3的相关性表明羟基和甲氧基 分别位于C-4和C-3位上。去除苯环和甲氧基的七个碳，剩余的10个碳原子形成了一个十元 环单萜结构。此外，两个含氧碳信号SC64.3(C，10-C)和73.9(CH，11-C)表明存在一个10,11-环氧基团。HMBC谱中，!1-110!13.79,8)与(：-12和(：-1〇 ;!13-160!11.28,8)与(：-1〇和(：-16(3 C16.0)的相关性验证了上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类 型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与 实验值基本一致(图2)。
[0027]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0028] -、材料和仪器
[0029] SD雄性大鼠（4周龄)购于河北医科大学动物实验中心，清洁级，体重150g。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98Ha，25(0H) 2D3购于英国普利茅斯生物研究实验室。α-ΜΕΜ培养基购于美国GIBCOBRL。Soluble RANKL购于英国Peprotec Science。抗酒石酸酸性 磷酸酶(TRAP)试剂盒购于美国Sigma公司。葡聚糖凝胶购于上海如吉科技发展有限公司。标 准胎牛血清购于山东银香伟业生物有限公司。注射用青霉素钠购于华北制药有限公司。注 射用硫酸链霉素购于深圳华药南方制药有限公司。丙酮、甲醛溶液购于石家庄市有机化工 厂。异氟烷购于鲁南贝特制药有限公司。二甲基亚砜购于天津市光复精细化工研究所。
[0030] BB5060/BB16二氧化碳培养箱（上海Heraeus公司），VD-650型桌上式细胞培养超净 操作台（苏州净化设备有限公司），BFX5-320型低速离心机（中国上海泸南科学仪器联营 厂），XD-1019810倒置显微镜(江南公司），CX-21光学显微镜（日本OLYMPUS)，微量加样器(法 国GILSON)，2510型变频振荡仪(上海新波生物技术有限公司），GF-300型电子天(Japan A&D Company，limited)，725型超低温冰箱(Forma Scientific · Inc)。未提到的材料和仪器均为 常规仪器。未提到的溶液配制均采用本领域常规溶液配制方法配制即可。
[0031] 药液配制及葡聚糖凝胶柱的制备：
[0032] 1、α-ΜΕΜ培养液的制备：
[0033] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超纯水800ml，完全溶解；
[0034] (2)加碳酸氢钠3.02g待完全溶解后加盐酸测PH达7.2;
[0035] (3)再次加超纯净水至1000ml;
[0036] (4)加抗生素(青霉素及链霉素）；
[0037] (5)滤过灭菌(0 · 22微米微孔滤膜过滤）
[0038] (6)500ml灭菌瓶分装，4°C储藏备用。
[0039] 2、la，25(0H)2D3 储存液的分装
[0040] (1)取la，25(0H)2D3原液50微升（50微升一支），加入无水乙醇1150微升，使总量至 1200微升（即24倍稀释）
[0041 ] (2)以100微升/只分装于12支灭菌试管内，-30 °C冰箱内储存备用；
[0042] (3)应用前再次稀释1000倍，使最终浓度为IX 10_8M。
[0043] 3、Soluble RANKL储存液分装
[0044] (1)取1^疆17东干粉一支(10微克）；
[0045] (2)0.1M tris-HCl buffer 5〇微升溶解RANKL;
[0046] (3)以5微升/只分装于10支灭菌冷冻管内，_30°C冰箱内储存备用；
[0047] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培养液495微升溶解（即稀释100倍）；添 加前再次稀释100倍，使终浓度为20ng/ml。
[0048] 4、0· 1M tris-HCl buffer的制备
[0049] (l)tris-HCl 12.llg(0.1M)；
[0050] (2)超纯水800ml(添加溶解后，调节pH至8.2);
[0051 ] (3)加超纯水至1000ml备用。
[0052] 5、化合物（I)储存液的制备
[0053] (1)储存液的浓度：lmg/ml及 100ug/ml。
[0054] (2)储存液的配制：称取化合物（I)lmg放于灭菌冷冻管内，加入二甲基亚砜lml完 全溶解，配成lmg/ml的储存液。从lmg/ml的储存液中取出100微升放于另一支灭菌冷冻管 内，加入二甲基亚砜900微升即配成100微克/毫升的储存液，储存于4°C恒温冰箱，使用时间 不超过两周。lmg/ml的储存液冷冻保存。
[0055] 6、TRAP固定液的制备
[0056]在染色之前，按产品说明书配制。首先取无菌20ml试管一支，按以下顺序依次加入 试剂:丙酮6.5ml、枸橡酸2.5ml、甲醛0.8ml，充分混勾，计9.8ml，现配现用。
[0057] 7、TRAP染色液的制备
[0058]同样是在染色之前配制，按产品说明制备，现配现用。
[0059] 8、葡聚糖凝胶柱的制备
[0060] (1)消毒后50ml注射器一个，除去内芯；
[0061] (2)注射筒与注射头交接处置消毒后的脱脂棉球一个；
[0062] (3)固定架固定针筒，针头处接关闭状的三通；
[0063] (4)将灭菌的葡聚糖凝胶混匀，抽取30ml注入针筒内，打开三通，缓慢过滤沉淀，待 凝胶沉淀液面至15ml时为止;关闭三通，放入4°C恒温冰箱过夜；
[0064] (5)实验前1小时用含有15 %胎牛血清的a-MEM培养液50ml缓慢注入凝胶柱内，打 开三通，自然过滤洗涤凝胶柱后待用。
[0065]二、试验方法 [0066] 1、全骨髓细胞培养
[0067] 1.1全骨髓细胞提取
[0068]实验开始前30分钟将标准胎牛血清放入37 °C水浴箱内解冻;取50mL无菌离心管一 个，装入40mL不含胎牛血清的a-MEM培养液，以备冲洗全骨髓细胞用。
[0069] (1)选4周龄SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用异氟烷吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，无菌条件下取大鼠两侧胫骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用10mL注射器抽取 不含血清的a-MEM培养液，换用25号针头后自骨髓腔内冲出骨髓细胞至50mL无菌离心管内； (4)将所提取的细胞悬液充分吹打，待没有团块后，将盛有细胞的离心管与平衡管一起放入 离心机内离心，调整转速(2000转/分），离心5分钟;离心过程中配制含有15%胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液50mL(7.5mL胎牛血清加入42.5mLa-MEM培养液中）备用；（5)离心结束后弃去上清 液，加入含15 %胎牛血清的a-MEM培养液20mL，充分吹打混匀，形成细胞悬液，此液简称为细 胞原液。
[0070] 1.2细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数）
[0071] (1)取以上提取的细胞悬液25yL放入试管内，然后加入5%醋酸475yL，即形成20倍 稀释的细胞悬液;将试管放在振荡器上，振荡20秒钟，目的是去除红细胞；（2)计算细胞数： 取振荡后细胞悬液滴入细胞计数盘，勿超过边缘，盖玻片覆盖，倒置显微镜下计算细胞数， 计数盘4个大格内所有细胞均计入。本实验计算细胞数为537个，根据公式(细胞数/4) X20 \104〇6 118/11^推算细胞原液的浓度，本实验计算如下（537/4)\20\ 104 = 26.85 \ 106cellS/mL即本实验细胞原液浓度为26.85\106(^11 8/11^，而我们需要的目的浓度是2\ 106cellS/mL，所以细胞原液需要稀释。（3)稀释倍数计算如下:稀释倍数=原液浓度/目的 浓度;本实验稀释倍数=26.85 X 106cells/mL/2 X 106cells/mL= 13.425，即原液需要稀释 13.425倍才能达到需要的目的浓度。本实验需要2\10%118/1^的细胞悬液4〇1!^，简称为 目的量。（4)达到目的浓度所需原液的量，计算如下:达到目的浓度所需原液的量=目的量/ 稀释倍数。本实验计算如下：达到目的浓度所需原液的量= 40mL/13.425￥2.98mL。即取 26 · 85 X 106cells/mL的细胞原液2 · 98mL放入灭菌的50mL离心管内，然后加入37 · 02mL(40-2.98)含15%胎牛血清的€1-|^培养液即可配成2\106〇6118/1^的细胞悬液4〇1^，然后加入 la，25 (OH)2D3储存液40yL，操作过程应避光，即la，25(OH)2D 3终浓度为1 X 10-8M;再加入4yL soluble RANKL储存液，即soluble RANKL终浓度为20ng/mL;加液过程在超净工作台上操 作，至此，所需2 X 106cel ls/mL的细胞悬液目的量配置完成。
[0072] 1.3培养细胞、加药
[0073] (1)细胞接种：取4行6列24孔培养板一块，每孔加入2X106cell S/mL的细胞悬液 O.SmLaxiOkellshU)加入化合物（I):取100yg/mL化合物（I)分装液一支于培养板的第 2列分别加入2.5yL，每加一孔均需换一个吸头;第3列每孔加入5yL;第4列每孔加入10yL。加 完第4孔后，将此液放入4 °C恒温冰箱保存，取lmg/mL化合物(I)储存液一支。第5列每孔加入 lmg/mL化合物（I)储存液2.5yL;第6列每孔加入5yL。加完后剩余药液放入4°C恒温冰箱保 存。第一列不加药物，作为对照组。至此在24孔培养板中化合物（I)每行都有6个浓度，分别 为0、0.5、1、2、5、10yg/mL，每个浓度每列4孔(η = 4)，第一列为对照组。（3)培养细胞:加完药 后，将培养板放入C02培养箱内，在37°C、5 %C02及饱和湿度条件下，培养7天。培养至第4天时 换培养液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的a-MEM培养液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-MEM培养液中），内含10yL青霉素8yL链霉素(80万u青霉素，100万链霉素分别用2mL灭 菌蒸馏水溶解），加入4yL soluble RANKL储存液，然后取1<1，25(0!〇2〇3储存液4(^加入。从 培养箱内取出培养板后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，每孔吸出旧培养液300此，加入 新培养液400yL，每吸出一列更换一次吸头，每加一孔更换一次吸头。换液完成后，将培养板 继续放入C0 2培养箱内，在37°C、5 %C02及饱和湿度条件下，再培养3天。
[0074] 2、破骨前驱细胞(P0C)培养
[0075] 2.1全骨髓细胞的提取:如同以上所述方法，制备全骨髓细胞悬液1.5mL。
[0076] 2.2非附着骨髓细胞的提取
[0077] (1)把用培养液冲洗过的凝胶柱，固定在固定架上；（2)缓慢向凝胶柱内注入全骨 髓细胞1.5mL，打开三通，缓慢过滤；待1.5mL全骨髓细胞渗入凝胶柱内后，再缓慢注入含 15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液1 OmL。（ 3)收集含有非附着骨髓细胞的培养液共计12-15mL，此 液称为非附着骨髓细胞原液。
[0078] 2.3细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数)及达到目的浓度所需原液的量
[0079] 如同以上所述方法，计算细胞数，稀释倍数，达到目的浓度所需原液的量。本实验 计算细胞数为337个，推算细胞原液的浓度为16.85\10 6(^118/1111;稀释倍数为8.425，即细 胞原液需稀释8.425倍才能达到需要的目的浓(2\10 6(^118/!111);达到目的浓度所需原液 的量4〇1111/8.425￥4.751111，即取4.751111细胞原液放入灭菌的5〇1111离心管内，然后加入 35.251111(40-4.75)含15%胎牛血清的€[-]册]\1培养液即可配成2\10 6〇6118/1111的目的细胞悬 液40ml，然后加入la，25(0H)2D3储存液40ul，操作过程应避光，即la，25(0H) 2D3终浓度为IX 10-8M;加入soluble RANKL储存液4ul，即soluble RANKL终浓度为20ng/ml;加液过程均在超 净工作台上操作，至此，未附着骨髓细胞悬液目的量配置完成。
[0080] 2.4培养细胞及加药如同前述。
[00811 3、倒置显微镜下观察
[0082] 3.1倒置显微镜的调节
[0083] (1)将显微镜合轴；
[0084] (2)将视野光圈开大至与聚光器光阑边缘一致；
[0085] (3)将与物镜放大倍数一致的相板放入聚光器中；
[0086] (4)把调中目镜换到目镜筒中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰；
[0087] (5)调节聚光器上的相环调中旋钮，使两个圆环图像重叠成同心圆状态；
[0088] (6)用普通目镜换下调中目镜。
[0089] 3.2 TRAP染色
[0090] (1)培养7天后，将培养板从培养箱内取出，弃去培养液；（2)加入固定液0.4mL/孔， 固定1分钟；（3)弃去固定液，蒸馏水冲洗四次；（4)加入染色液3-4滴/孔，用锡纸包裹培养 板；（5)在37°C、5 % C02及饱和湿度条件下孵育30分钟后，取出培养板，弃去染色液，蒸馏水 冲洗四次，自然干燥。
[0091] 3.3观察
[0092] 培养7天后将培养板从培养箱内取出，弃去培养液之前，在倒置显微镜下观察不同 药物浓度下细胞的生长状况及形态，决定是否染色。染色后带染色液倒置显微镜下观察染 色效果。
[0093] 4、光镜观察
[0094]带染色液倒置显微镜下观察后，弃去染色液，蒸馏水洗4次，自然干燥，普通光镜下 观察计算破骨细胞数。
[0095] 5、统计学分析
[0096] 使用SPSS16.0统计学软件进行分析。数据处理采用mean土SD表示，对不同药物浓 度相同处理时间，各组与对照组之间比较，化合物（I)对破骨细胞形成及分化的影响，得出 的数据资料分析采用方差分析，从而得出药效和药物浓度的变化关系。
[0097]三、结果及结论
[0098] 在全骨髓细胞培养系中，0.5、1、2yg/mL组与对照组比较，TRAP染色阳性细胞(3核 以上)数仅为对照组的49.04%、28.85 %、5.77 %，经统计学分析，加药组对破骨细胞的形成 有抑制作用，当药物浓度为lyg/mL时与对照组相比，对破骨细胞形成有显著抑制作用（P< 〇.〇1)。见表1。
[0099] 在破骨前驱细胞培养系中，0.5、1、2、5yg/mL组与对照组相比，TRAP染色阳性细胞 (单核或2核)数仅为对照组的85 · 11 %、65 · 79%、37 · 83 %、2 · 21 %，经统计学分析，加药组对 破骨前驱细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为2yg/mL时与对照组相比，对破骨前驱细胞 形成有显著抑制作用(P<〇.01)。见表2。
[0100] 结论，本研究结果表明化合物（I)对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在 浓度依赖关系。应用化合物（I)治疗以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为 一种有前景的治疗方法。
[0101] 表1全骨髓细胞培养系中TRAP染色阳性细胞(3核以上)数
[0102]
[0103 ]表2破骨前驱细胞培养系中TRAP染色阳性细胞(单核或2核)数
[0104] L0105J 实施例3
[0106] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0107] 实施例4
[0108] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0109] 实施例5
[0110] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0111] 实施例6
[0112] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0113] 实施例7
[0114] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0115] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种杂帖类化合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用，其特征在于，具有下述 结构式的化合物(I)，(I)2. 权利要求1所述的应用，其特征在于所述化合物（I)从干燥的蛇床子中分离得到，具 体包含以下操作步骤：（a)将干燥的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液， 浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用 10 %乙醇洗脱6个柱体积，再用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得 75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为 90 :1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（(1)步骤((3)中组分4 用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70% 的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。4. 根据2权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度 为 80 %。5. -种药物组合物在制备治疗骨破坏性疾病药物中的应用，其特征在于：其中含有治 疗有效量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K31/336GK105997980SQ201610392034
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】武晓丹
【申请人】武晓丹