一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，制备方法及其应用
【专利摘要】本发明提供一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。其制备方法包括载紫杉醇微泡的制备及载siRNA微泡的制备。本发明将其应用于制备抑制宫颈癌的药物上。实验表明超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。
【专利说明】
一种载紫杉醇和/或载S i RNA微泡，制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明提供一种利用超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡联合靶向抑制宫颈癌 的技术方案，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织国际癌症研究署（International Agency forResearch on Cancer，IARC)统计，宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，全球宫颈癌发病率在 女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤的13%。有调查统计，我国的宫颈癌发病率 为12.96/10万，死亡率为4.32/10万，呈明显增长趋势。目前，宫颈癌的传统治疗方式主要有 手术治疗、放疗、化疗等，但这些治疗方法均存在着相对的不足。
[0003] 近年来，有学者通过利用不同的超声物理学参数，不同种类的药物载体如微泡、微 胶粒和脂质体等，以及不同的超声生物学效应(高热、声孔效应等），来验证利用超声给药是 一种新型的有前途的给药方式。超声介导超声微泡作为一种安全有效地给药途径，可以大 力推广。近年，有国外学者采用可降解生物高分子聚合材料，制备的显影效果好、抗压性强 的新型高分子材料超声微泡，可使药物释放时间及降解时间延长，并减少药物毒性及对组 织的损伤，显示出这类新型微泡对肿瘤靶向释药能力及药物治疗作用的优势。
【发明内容】
[0004] 本发明利用超声介导载紫杉醇微泡及载siRNA微泡，进行药物靶向释放，用于治疗 宫颈癌的实验研究。通过自制高分子材料PLGA为外壳，包裹紫杉醇及针对HPV16E6、E7特异 性的siRNA，制备载药、载siRNA微泡，在体外作用于宫颈癌细胞，初步评价超声介导载紫杉 醇及载siRNA微泡联合应用对宫颈癌的协同抑制效果，为进一步临床应用研究提供实验依 据。
[0005] 方法：（1)利用改良型双乳剂挥发法和低温真空干燥技术，自制出载紫杉醇和载 siRNA的PLGA超声微泡。（2)实验将宫颈癌Caski细胞分为四组:空白对照组、载紫杉醇微泡 组、载siRNA微泡组、联合载紫杉醇及载siRNA微泡组。按照最佳参数给予相同频率及时间强 度的超声辐照，48小时后，进行WB检测凋亡蛋白、FCM检测细胞凋亡率及细胞周期的改变，评 价超声介导载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对宫颈癌细胞协同抑制作用的效果。具体如下：
[0006] -种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡;载siRNA 微泡为PLGA包裹s i RNA微泡；载紫杉醇和s i RNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹 siRNA微泡混合物。所述的载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA 微泡的混合物。
[0007] 载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(W〇,聚乳酸羟基乙酸 共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(0)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙 酸共聚物二氯甲烷溶液;混合内水相1和油水相0得到初乳(W/0)，配制质量浓度为3-8%聚 乙烯水溶液作外水相(W2)，将外水相加入到初乳中，均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅 拌3-8min乳化形成复乳(W/0/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭 菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。
[0009] (2)载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质 量浓度为〇. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;将DEPC水重悬siRNA，得 到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸（PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二 氯甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅拌 30-40s，形成乳白色油包水乳液，配制质量浓度为3-8 %的聚乙烯PVA水溶液，为外水相;将 外水相加入到上述siRNA与PLGA乳白色油包水乳液，形成复乳，均质机以lOOOOrpm的转速持 续震荡搅拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末， 得到载siRNA微泡；
[0010] (3)载紫杉醇和SiRNA微泡，经步骤（1)中的载紫杉醇微泡与步骤(2)中的载SiRNA 微泡混合得到。
[0011] 本发明将所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。 该应用是超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞的抑制。具体方法为:配 制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载 紫杉醇微泡溶液与浓度为l〇ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液，将实验分为四组:空白对 照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡及载siRNA微泡组，四组不同处理溶 液加入宫颈癌Caski细胞中，用频率为1.5W/cm 2的超声基因转染仪辐照35s，将处理后的四 组24孔板放置C02细胞培养箱中，48h小时后，完成超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对 宫颈癌Caski细胞。
[0012] 结果：（1)通过改良型双乳剂挥发法和真空冷冻干燥技术，制备出载紫杉醇和载 siRNA的PLGA超声微泡，形态规则呈球形，粒径分布均匀，包封率达到89.58%，载药率达到 11.86%，达到进一步实验的要求。（2)与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组宫颈癌Caski细 胞增殖受到一定程度抑制，载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖有一定抑制，联合载紫杉 醇及载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖的抑制作用更加明显；载紫杉醇组及载siRNA组 的Ba X、CaspaSe3促凋亡蛋白的表达均上调，联合组的上调幅度更大(p〈0.05)，载紫杉醇组 及载siRNA组的Bcl2抑凋亡蛋白下调，联合组的下调幅度更大(p〈0.05);流式细胞仪检测空 白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合组的细胞凋亡率分别为：（8.39 土 0·24)%、（21·56±2·20)%、（11·00±0·14)%、（27·9±0·76)%，与空白对照组相比，载紫 杉醇组与载siRNA组的凋亡率均增高，联合组的凋亡率最高(ρ〈0.05);流式细胞仪检测细胞 周期的变化显示，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组阻滞在G2/M期细胞数目增加，其 中联合组的阻滞在G2/M期细胞数目明显高于其余三组(p〈0.05)。自制PLGA超声微泡，其形 态、粒径分布、包封率、载药率达到实验要求。体外实验表明，超声介导载紫杉醇及载siRNA 微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski 细胞增殖的效果更好。本实验研究结果为临床上探索宫颈癌治疗提供了一种新的思路。
【附图说明】
[0013] 图1为PLGA载紫杉醇微泡的扫描电镜图。
[0014] 图2为PLGA载siRNA微泡的扫描电镜图。
[0015] 图3为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载s iRNA微泡组及载紫
[0016] 杉醇微泡联合载SiRNA微泡组的细胞凋亡率（与空白对照组相比，*p〈0.05，**p〈 0.01)。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，PS为载SiRNA微泡组及 载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
[0017] 图4为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇 微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载 s iRNA微泡组，PS为载s iRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载s iRNA微泡组。
[0018] 图5为流式细胞仪分析空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇 微泡联合载siRNA微泡组对细胞周期的影响。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为 载s iRNA微泡组，PS为载s iRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载s iRNA微泡组。
[0019] 图6为如8七6111131〇1:1:;[1^检测1^1、0&8口&863、13(312的蛋白表达水平（吨〈0.05，林卩〈 0.01)。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载SiRNA微泡组，P+S为载SiRNA微泡组 及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。
[0020] 图7为紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对Bax、CaspaSe3、 Be 12的蛋白表达水平的影响。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022]实验瘤株人宫颈癌Caski细胞：由三峡大学医学院肿瘤微循环与免疫治疗实验室 保存。
[0023] 主要仪器及试剂仪器：数显高速均质机（上海）、冷冻干燥仪（PLPHA2-4LSC，德 国）、扫描电镜(JSM-7500F、日本）、UGT1025超声基因转染治疗仪(重庆医科大学超声影像学 研究所研制）、几_1177型激光粒度分布测试仪(成都精新粉体测试设备公司）。试剂:紫杉醇 原料(成都曼斯特）、siRNA合成(江苏吉玛基因股份有限公司）
[0024] PLGA载紫杉醇微泡制备称取40mg紫杉醇溶于lml聚乙二醇400作为内水相(I)， 取适量聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于10ml二氯甲烷作为油水相(0)，配置质量浓度为 0.2g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;混合1和0得到初乳(W/0)，配制质量浓度 为3-8 %聚乙烯溶液作外水相(W2) 10ml，加入初乳中，均质机乳化形成复乳(W/0/W)，磁力搅 拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。
[0025] PLGA载siRNA微泡制备将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒灭菌后放置于0.1 %焦 碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;将lml的DEPC水重悬10D的siRNA，得到已 溶解的siRNA溶液;称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于6ml二氯甲烷中，配置浓度为0.2g/ml的 聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;将已溶解的s iRNA溶液lml加入到上述混合好的二氯 甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，超声均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅 拌30-40s，形成乳白色油包水乳液;配制质量浓度为3-8 %PVA溶液10ml，为外水相;将外水 相加入到上述siRNA与PLGA混合液中，形成复乳，超声均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅 拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末。
[0026]微泡相关物理特性的检测描电镜观察微泡形态，粒径分布仪检测微泡粒径大小 和分布，紫外分光光度计分析紫杉醇浓度，计算：载药量=(微泡中紫杉醇质量/微泡总质 量)X100 %、包封率=(微泡中紫杉醇质量/投入紫杉醇总质量)X100 %。
[0027] 实验分组及处理观察24孔板内铺的细胞，待细胞贴壁良好，长到70%左右时，进 行分组处理。根据前期实验摸索及参考国内外文献，提前配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微 泡溶液，浓度为l〇ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ ml的载s iRNA微泡溶液的混合液。将实验分为四组:空白对照组，载紫杉醇微泡组、载s iRNA 微泡组，载紫杉醇微泡组联合载siRNA微泡组，四组不同处理溶液加入细胞中，用频率为 1.5W/cm2的超声基因转染仪辐照35s。将处理后的四组24孔板放置⑶ 2细胞培养箱中，48h小 时后，通过Western Blot及流式细胞仪等检测相关参数。
[0028] Western Blot检测Caspase3、Bax、Bcl_2蛋白的表达提取细胞总蛋白，BCA方法进 行蛋白定量，加入同体积蛋白上样缓冲液，沸水浴5min。取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳， 转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭lh，加入兔抗人Bax抗体（1:800)、兔抗人Caspase3抗体（1: 800)、兔抗人Bcl-2抗体（1:800)，4°C过夜，分别加入HRP标记的羊抗兔IgG(l :50000)，显色 液显色，以β-actin为内参，凝胶成像系统拍照。蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度/内参灰 度。
[0029]流式检测细胞凋亡使用没有EDTA的0.25 %胰酶对细胞进行消化，终止消化后，收 集细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加 PBS重悬。以1500rpm，5min的条件，用PBS将细胞润洗 2次。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测，流式细胞仪上机检测。
[0030] 流式检测细胞周期使用没有m)TA的0.25 %胰酶对细胞进行消化，终止消化后，收 集细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加 PBS重悬。以1 OOOrpm，5min的条件离心，去上清液，重 悬细胞，缓慢加入预冷的80 %无水乙醇，使无水乙醇的终浓度为70 %。4 °C固定4小时以上。 以lOOOrpm，5min的条件离心，预冷PBS润洗2次。加入100ul的RNase (50ug/ml)，37°C水浴处 理30min。加入400ul PI(50ug/ml)，4°C避光染色30min，流式细胞仪上机检测。
[0031] 统计学方法数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，结果用S±s表示，各组之间 的比较使用单因素方差分析，P〈〇.05为差别具有统计学意义。
[0032]自制高分子PLGA超声微泡的形态观察
[0033]制备出的PLGA载紫杉醇微泡及载siRNA微泡经冷冻干燥后外观为白色粉末状，在 扫描电镜下分别观察载紫杉醇微泡，见图1，与载siRNA微泡，见图2。扫描电镜下可见微泡形 态呈规则的圆球形，表面光滑，微泡的大小分布均一。
[0034]通过粒径分布仪的数据计算出载紫杉醇微泡的粒径大小约1.91 ±0.96um，载 siRNA微泡的粒径大小约1.98±0.99um。通过紫外分光光度计的检测，计算得出PLGA超声微 泡的包封率为89.58 %，载药率为11.86 %。
[0035]流式细胞术分析联合微泡对细胞凋亡的影响
[0036] 通过流式细胞仪，用荧光标记试剂Annexin V-FITC/PI检测实验各组的凋亡率:空 白对照组的细胞凋亡率为（8.39 ± 0.24) %，载紫杉醇微泡组的细胞凋亡率为（21.56 土 2.20)%，载siRNA组微泡组的细胞凋亡率为（11.00 ±0.14) %，联合组的细胞凋亡率为 (27.9 ±0.76) %，经过统计学软件分析，与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡 组与联合组的凋亡率均有统计学意义，（P〈〇.01)，其中，联合组凋亡率最高，分别是单纯载 紫杉醇微泡组及单纯载siRNA微泡的1.3倍、2.5倍，见图3、图4。图3为流式细胞仪检测空白 对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡 率(与空白对照组相比，*P〈0.05，#p〈0.01)。
[0037] 图4为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇 微泡联合载s iRNA微泡组的细胞凋亡率。
[0038] 流式细胞术分析联合微泡对细胞周期的影响
[0039]结果显示，图5为流式细胞仪分析空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及 载紫杉醇微泡联合载s iRNA微泡组对细胞周期的影响。结果表明载紫杉醇微泡组、载s iRNA 微泡组，联合组阻滞在G2/M期的细胞数目增加，其中联合组阻滞在G2/M期细胞数目明显高 于其余三组。
[0040] Western Blotting检测Bax、Caspase3、Bcl2三种凋亡蛋白的表达 [0041 ] 结果显示，图6为Western Blotting检测1^1、〇38口&863、13(312的蛋白表达水平（*卩〈 0.05，**p〈0.01)。图7为紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对Bax、 Caspa Se3、Be 12的蛋白表达水平的影响。载紫杉醇微泡组、载s iRNA微泡组，联合微泡组，三 组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达均上调，但联合组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达 更加明显(P〈〇.01)。载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组Bcl2抑凋亡蛋白的表达均下 调，但联合组的Bcl2抑凋亡蛋白的下调更加明显(p〈0.01)。
【主权项】
1. 一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微 泡;载s i RNA微泡为PLGA包裹s i RNA微泡;载紫杉醇和s i RNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与 PLGA包裹s iRNA微泡混合物。2. 权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇和siRNA微泡 为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。3. 权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(WD，聚乳酸羟基乙酸共聚物 (PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(0)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚 物二氯甲烷溶液;混合内水相1和油水相0得到初乳(W/0)，配制质量浓度为3-8%聚乙烯水 溶液作外水相(W 2)，将外水相加入到初乳中，均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅拌3-8min乳化形成复乳(W/0/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微 泡粉末，即为载紫杉醇微泡。 (2) 载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质量浓 度为〇. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;将DEPC水重悬siRNA，得到已 溶解的siRNA溶液;称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml 的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二氯甲烷 聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅拌30-40s， 形成乳白色油包水乳液，配制质量浓度为3-8 %的聚乙烯PVA水溶液，为外水相;将外水相加 入到上述siRNA与PLGA乳白色油包水乳液，形成复乳，均质机以lOOOOrpm的转速持续震荡搅 拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，得到载 siRNA微泡； (3) 载紫杉醇和siRNA微泡，经步骤（1)中的载紫杉醇微泡与步骤(2)中的载siRNA微泡 混合得到。4. 权利要求1-3任一项所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡在制备抑制宫颈癌的药物上 的应用。5. 权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用是超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡 对宫颈癌Caski细胞的抑制。6. 权利要求4所述的应用，其特征在于，超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌 Caski细胞的方法为:配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微 泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液，将 实验分为四组:空白对照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡及载siRNA微 泡组，四组不同处理溶液加入宫颈癌Caski细胞中，用频率为1.5W/cm 2的超声基因转染仪辐 照35s，将处理后的四组24孔板放置C02细胞培养箱中，48h小时后，完成超声介导载紫杉醇 和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞。
【文档编号】A61K31/337GK105997938SQ201610560044
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】赵云, 苏子涵, 刘朝奇, 于娇娇, 胡兵
【申请人】三峡大学