一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种抗人CD20抗体?DM1偶联物及其制备方法，它包括抗人CD20的单克隆抗体、美登素类细胞毒化合物，该单克隆抗体为利妥昔单抗，该美登素类细胞毒化合物为DM1，单克隆抗体与DM1通过双功能团连接子N?琥珀酸酰亚胺基4?环己烷羧酸酯相连；抗体偶联的DM1的平均数量，即抗体药物偶联效率为3.0?4.0；它利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞上特定抗原的特点，偶联美登素类细胞毒化合物，可实现精准地将抗肿瘤物质递送到肿瘤靶细胞释放，具有制备方法简单，成本低，见效快，药效高等优点。
【专利说明】一种抗人CD20单克隆抗体-DM1偶联物及其制备方法 【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种抗人CD20抗体-DMl偶联物及其制备 方法。 【【背景技术】】
[0002] 利妥昔单抗是一种人鼠嵌合性单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合。 CD20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、前前B细胞、正常浆细胞或其它 正常组织不表达⑶20。95%以上的B细胞性非霍奇金淋巴瘤瘤细胞表达⑶20。抗原抗体结合 后，CD20不会发生内在化，或从细胞膜上脱落进入周围的环境。CD20不以游离抗原的形式在 血浆中循环，因此不可能与抗体竞争性结合。
[0003] 利妥昔单抗现阶段临床上用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤的治疗。先前未 经治疗的⑶20阳性III-IV期滤泡性非霍奇金淋巴瘤，患者应与标准CVP化疗(环磷酰胺、长 春新碱和强的松)8个周期联合治疗。CD20阳性弥漫大B细胞性非霍奇金淋巴瘤(DLBCL)应与 标准CHOP化疗(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松)8个周期联合治疗。
[0004] 美登素生物碱(maytansinoids)是高度细胞毒性的药物。美登素(maytansine)首 先由Kupchan等人从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离出来，它比传统的癌 症化疗剂如甲氨碟呤、柔红霉素和长春新碱的细胞毒性强100至1000倍(美国专利3，896， 111号）。美登素是有丝分裂抑制剂。已报道，用美登素在体内处理L1210细胞，导致细胞的 67%积累在有丝分裂期。据报道，未被处理的对照细胞显示了范围在3.2%至5.8%之间的 有丝分裂指数(Sieber等人.43Bibl.Haematol .495-500( 1976))。用海胆卵和蛤卵进行的实 验表明，美登素通过抑制微管蛋白质(microtubule)--微管蛋白（tubulin)的聚合而干扰 微管的形成，从而抑制有丝分裂(Remillard等人，189Science100 2-1005( 1975))。
[0005] 在体外，已发现P388、L1210和LY5178鼠白血病细胞悬液被美登素抑制，美登素的 剂量是10-3至10-lμg/ml，其中P388细胞系最为敏感。也已显示，美登素是人鼻咽癌细胞的 体外生长的活性抑制剂，并且据报道，人急性淋巴细胞白血病系C.E.M.被低至10-7μg/ml的 浓度所抑制（Wolpert-DeFiIlippes等人，24Biochem.Pharmacol · 1735-1738( 1975))。也已 显示，美登素在体内是活性的。在50倍至100倍的剂量范围内，P388淋巴细胞白血病系统中 的肿瘤生长被抑制，这表明了高的治疗指数;用L1210鼠白血病系统、人Lewis肺癌系统和人 B-16黑素癌系统，也可以显示出显著的抑制活性（Kupchan，33Ped. Proc .2288-2295 (1974))。由于美登木素生物碱是高度细胞毒性的，预期它们在治疗许多疾病如癌症中有 用。此预期尚需实现。美登素的临床试验不是令人满意的，这归因于许多副作用（Issel等 人，5Cancer Treat. Rev. 199-207 (1978))。对中枢神经系统和胃肠症状的不利作用 (adverse effect)是一些患者拒绝进一步治疗的原因（Issel at204)，并且美登素似乎和 周围神经病相关，该周围神经病可能是累积的（Issel at207)。
[0006] 通过制备抗体-美登素生物碱偶联物可以定向将药物传送至靶细胞位点，从而降 低对正常组织和细胞的毒性，降低美登素生物碱的副作用。CN101087611A报道了用不可切 割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物和用可切割接头连接抗体与美登素生物碱 制备的偶联物相比，两者具有相同的体外和体内抗肿瘤活性，但是前者在血浆清除率和毒 性方面显示了显著的降低。US5208020和US5416064等公开了制备抗体-美登素生物碱偶联 物的方法。CN101087611A也公开了与US5208020、US5416064相同的方式制备抗体-美登素生 物碱偶联物的方法，即先将双功能连接剂与单克隆抗体偶联，纯化获得第一混合物，再与化 学毒素偶联，进行纯化获得偶联物。利用这种方式获得的抗体-药物偶联物纯度低并且不稳 定。例如，CN101087611A实施例中公开的曲妥珠-SMCC-DMl偶联物的纯度只有95%左右，并 且蛋白聚体物的含量占到了4.2%以上，这种高聚物的存在在治疗过程中存在引起较高免 疫源性的风险。
[0007] 抗体-药物偶联物利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞上特定抗原的特点，偶联 小分子化疗药物，可实现精准地将抗肿瘤物质递送到肿瘤靶细胞释放。2013年3月，Roche公 司的ADC药物T-DMl (曲妥珠单抗Tras tuzumab与美登素DMl偶联)获得FDA的认可用于HER2阳 性转移性乳腺癌治疗。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理、使用方便的 一种抗人⑶20抗体-DMl偶联物及其制备方法。
[0009] 本发明所述的一种抗人⑶20抗体-DMl偶联物及其制备方法，它包括抗人⑶20的单 克隆抗体、美登素类细胞毒化合物，该单克隆抗体为利妥昔单抗，该美登素类细胞毒化合物 为DMl，单克隆抗体与DMl通过双功能团连接子N-琥珀酸酰亚胺基4-环己烷羧酸酯相连;抗 体偶联的DMl的平均数量，即抗体药物偶联效率为3.0-4.0;
[0010]其制备方法如下：
[0011] 1)将抗人⑶20抗体pH调节至6.0-7.5;其采用如下步骤：
[0012] 步骤一：直接向抗人CD20抗体中加入磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、碳酸钠缓冲 液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，至pH调节为6.0-7.5;
[0013] 步骤二:使用超滤管将抗体溶液浓缩；
[0014] 步骤三:使用紫外分光光度法测抗体溶液浓度；
[0015] 2)将连接有双功能团连接子的DMl，即DMl-SMCC化合物溶解于有机溶剂中，浓度为 l-10mg/ml;其制备配制DMl-SMCC溶液的方法步骤如下：
[0016] 步骤一:称取DMl-SMCC于玻璃容器中，加入乙醇、异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜，振荡使DMl -SMCC完全溶解；
[0017] 步骤二:使用紫外分光光度法测所配溶液中DMl-SMCC浓度；
[0018] 3)将抗体与DMl-SMCC溶液混合孵育，采用如下的方法步骤：
[0019]步骤一:将DMl-MCC溶液滴加至抗人⑶20抗体中，搅拌均匀；
[0020] 步骤二:置于4-25°C的水浴或者空气浴中孵育2-24小时；
[0021]步骤三:控制DMl-SMCC与抗体的摩尔比为5-12:1;加入缓冲液，使抗体在反应液中 的浓度在l-l〇mg/ml;
[0022] 4)孵育后的反应液通过一步纯化，得到抗体药物偶联物;其方法步骤如下：
[0023]将反应液放入用置换缓冲液预先平衡的分子筛旋转层析柱中，使用离心机，以 1000转/分钟的转速离心2分钟，所得样品即为纯化后的偶联物；
[0024]或将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的透析膜中，封口。将透析膜放入置换 缓冲液中，搅拌;24小时后，将置换后的反应液取出，即为纯化后的偶联物；
[0025]或将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的超滤管中，以6000转/分钟的转速离 心5分钟，然后向超滤管中补加置换缓冲液，再进行离心操作；如此重复5次，取出超滤管中 样品，即为纯化后偶联物。
[0026] 进一步地，抗体pH调节范围为6 · 0-7 · 5，优选7 · 0-7 · 2。
[0027] 进一步地，抗体在反应液中的浓度为2-15mg/ml，优选5-10mg/ml。
[0028] 进一步地，配制DMl-SMCC溶液的浓度为l-10mg/ml，优选2mg/ml。
[0029] 进一步地，DMl-SMCC相对于抗体加入的摩尔比为5-12:1，优选7:1。
[0030] 进一步地，反应液孵育所设温度范围为4-25°C，优选25°C。
[0031]进一步地，反应液孵育时间为2-24小时，优选3小时。
[0032]采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明所述的一种抗人⑶20抗体-DMl偶联 物及其制备方法，它利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞上特定抗原的特点，偶联美登素 类细胞毒化合物，可实现精准地将抗肿瘤物质递送到肿瘤靶细胞释放，具有制备方法简单， 成本低，见效快，药效高等优点。 【【附图说明】】
[0033]此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，但 并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
[0034]图1是本发明结构示意图； 【【具体实施方式】】
[0035]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说 明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
[0036]如图1所示，本【具体实施方式】所述的一种抗人CD20抗体-DMl偶联物及其制备方法， 它包括抗人CD20的单克隆抗体、美登素类细胞毒化合物，该单克隆抗体为利妥昔单抗，该 美登素类细胞毒化合物为DMl，单克隆抗体与DMl通过双功能团连接子N-琥珀酸酰亚胺基4-环己烷羧酸酯相连;抗体偶联的DMl的平均数量，即抗体药物偶联效率为3.0-4.0;
[0037]其制备的详细方案如下：
[0038] 1)调节抗体原液pH:
[0039] 抗人CD20抗体使用透析、超滤、分子筛层析方法将缓冲液完全置换为预配的pH为 6.0~7.5的磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、碳酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3- (N-吗啉基)丙磺酸缓冲液。确定pH为6.0~7.0。使用超滤管将抗体溶液浓缩。使用紫外分光光 度计测抗体溶液浓度。直接向抗人CD20抗体中加入磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、碳酸钠缓 冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，至pH调节为6.0~7.5。使用 超滤管将抗体溶液浓缩。使用紫外分光光度法测抗体溶液浓度。
[0040] 2)配制DMl-SMCC 溶液：
[00411 称取DMl-SMCC于玻璃容器中，加入乙醇、异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基 乙酰胺、二甲亚砜，振荡使DMl -SMCC完全溶解。使用紫外分光光度法测所配溶液中DMl -SMCC 浓度。
[0042] 3)将抗体与DMl-SMCC溶液混合孵育：
[0043] 将DMl-SMCC溶液缓慢加入抗体溶液中，边加边搅拌。控制DMl-SMCC与抗体的摩尔 比为5~12:1。加入缓冲液，使抗体在反应液中的浓度在1~10mg/ml。将反应液置于4~25 °C 的水浴或空气浴中，反应2~24小时。
[0044] 4)反应液一步纯化：
[0045]将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的透析膜中，封口。将透析膜放入置换缓 冲液中，搅拌。24小时后，将置换后的反应液取出，即为纯化后的偶联物。
[0046]将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的超滤管中，以6000转/分钟的转速离心 5分钟，然后向超滤管中补加置换缓冲液，再进行离心操作。如此重复5次，取出超滤管中样 品，即为纯化后偶联物。
[0047] 将反应液放入用置换缓冲液预先平衡的分子筛旋转层析柱中，使用离心机，以 1000转/分钟的转速离心2分钟。所得样品即为纯化后的偶联物。
[0048] 使用IOmM醋酸钠缓冲液将反应液pH调节至4.0~4.5，使用lml/min流速在阳离子 交换层析柱上样，载量5mg/ml。上样完毕后，用pH4.0的IOmM醋酸钠缓冲液清洗3~5个柱体 积。再用IOmM醋酸钠和IM氯化钠缓冲液将偶联物洗脱收集。将收集的偶联物用透析的方法 置换缓冲液。
[0049] 5)抗体药物偶联物浓度检测：
[0050] 取偶联物，用水、磷酸钠缓冲液稀释至0.5~1.0mg/ml，用紫外分光光度法测量在 280nm和252nm处的吸光度。利用利妥昔单抗的吸光系数e280nm = 242291M 1CITl 1?￡ 252nm = 910841^01^和DMl的消光系数e28Qnm=5700M-1CHf 1，￡25-=267901^0^1 通过下述方程组计 算偶联物的浓度：
[0051] ① OD28〇 = ￡28〇(Ab) · 1 · cAb+￡28〇(DMl) · 1 · cDMi
[0052] ②OD252 = ￡252(Ab) · I · cAb+￡252(DMl) · I · cDMi
[0053] ③c = CAb · MffAb
[0054] 6)抗体药物偶联物高聚体含量检测：
[0055]仪器型号：安捷伦1260;
[0056] 色谱柱型号：TSK G3000SWxl;
[0057] 流动相:200mM磷酸钠，250mM氯化钾和15%异丙醇，pH 7.0;
[0058] 流速:0.8ml/min;
[0059] 检测波长：280nm;
[0060] 进样量：50ug;
[0061 ] 终止时间：25分钟。
[0062] 7)抗体药物偶联物偶联效率检测-UV法：
[0063]取偶联物，用水、磷酸钠缓冲液稀释至0.5~1.0 mg/ml，用紫外分光光度法测量在 280nm和252nm处的吸光度。利用利妥昔单抗的吸光系数e28Qnm= 2422911^(^1，e 252nm = 910841^0^1 和 DMl 的消光系数 e28Qnm=5700M-1Cnf1425-=267901^0^ 1 通过下述公式计算 偶联物的偶联效率(DAR):
[0064] ① OD28〇 = e28〇(Ab) · I · cAb+￡28〇(DMl) · I · cDMi
[0065] ②OD252 = e252(Ab) · I · cAb+￡252(DMl) · I · cDMi
[0066] ?
[0067] 8)抗体药物偶联物高聚体含量检测-SEC法：
[0068] 仪器型号：安捷伦1260;
[0069] 色谱柱型号：TSK G3000SWxl;
[0070] 流动相:200mM磷酸钠，250mM氯化钾和15%异丙醇，pH 7.0;
[0071] 流速:0.8ml/min;
[0072] 检测波长：280nm 和 252nm
[0073] 进样量:50ug;
[0074] 终止时间：25分钟。
[0075]以280nm下主峰的峰面积为Al，252nm下主峰的峰面积为A2。利用利妥昔单抗的吸 光系数 ￡28〇1?=242291]?-1。111-1，￡2521? = 91084]?-1。111-1和011的消光系数￡28〇1? = 57001-1。111-1， ￡252^1=267901^0^1通过下述公式计算偶联物的偶联效率：
[0076] ① A28〇 = ￡28〇(Ab) · 1 · cAb+￡28〇(DMl) · 1 · cDMi
[0077] ②A252 = ￡252(Ab) · I · cAb+￡252(DMl) · I · cDMi
[0078] ?
[0079] 本发明以具体实施例来进一步说明，实施例如下：
[0080] 调节抗体pH:取Zeba? Spin desalting column，型号87770,按照使用说明，用 pH7.050mM磷酸钠缓冲液平衡处理。平衡之后，向其中加入I lmg/ml的抗体溶液Iml，1000 rpm 离心2分钟。将所得溶液检测体积和浓度，浓度为8.5mg/ml，体积为820ul。
[0081 ] 配制DMl-SMCC溶液:在安全罩中，用玻璃容器称取1.2mg的DMl-SMCC粉末，用移液 枪加入120ul DMF溶剂，涡旋振荡使粉末完全溶解。将所配溶液检测浓度，浓度为9.8mg/ml。 [0082] 反应液混合后孵育：取800ul抗体溶液，向其中加入35ul DMl-SMCC溶液，再补加 204ul DMF溶剂和356ul磷酸钠缓冲液，用移液枪吹打均匀。将上述反应液置于15°C恒温箱 中，反应6小时。
[0083] 反应液纯化：取Zeba? Spin desalting column，型号87770，按照使用说明，用 pH5.0组氨酸缓冲液平衡处理。平衡之后将反应液加入其中，1000 rpm离心2分钟。所得溶液 即为纯化后的偶联物。
[0084] 紫外分光光度法测偶联物浓度和偶联效率:取纯化后偶联物，用组氨酸缓冲液稀 释4倍。用M5e型酶标仪测其在280nm和252nm处吸收值。分别为A28Qr?=0.179，A252r? = 0.132。 利用利妥昔单抗的吸光系数ε28〇Γ?=242291Μ-1Cnf 1J 25^=910841^011-1和DMl的消光系数 ￡28011111=5 7 001^01^825211111=26 7 901^0^1通过公式计算偶联物的浓度和偶联效率分别为：
[0085]
[0086] SEC_HPLC法测高聚体含量:设置高效液相色谱仪参数如下：
[0089]偶联物所含高聚体含量为：1.2%。
[0090]以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的特征及 原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
【主权项】
1. 一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于：它包括抗人CD20的单克 隆抗体、美登素类细胞毒化合物，该单克隆抗体为利妥昔单抗，该美登素类细胞毒化合物为 DM1，单克隆抗体与DM1通过双功能团连接子N-琥珀酸酰亚胺基4-环己烷羧酸酯相连;抗体 偶联的DM1的平均数量，即抗体药物偶联效率为3.0-4.0; 其制备方法如下： 1) 将抗人CD20抗体pH调节至6.0-7.5;其采用如下步骤： 步骤一:直接向抗人CD20抗体中加入磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、碳酸钠缓冲液、三 羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，至pH调节为6.0-7.5; 步骤二:使用超滤管将抗体溶液浓缩； 步骤三:使用紫外分光光度法测抗体溶液浓度； 2) 将连接有双功能团连接子的DM1，即DM1-SMCC化合物溶解于有机溶剂中，浓度为1-10mg/ml;其制备配制DM1-SMCC溶液的方法步骤如下： 步骤一:称取DM1-SMCC于玻璃容器中，加入乙醇、异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲 基乙酰胺、二甲亚砜，振荡使DM1-SMCC完全溶解； 步骤二:使用紫外分光光度法测所配溶液中DM1-SMCC浓度； 3) 将抗体与DM1-SMCC溶液混合孵育，采用如下的方法步骤： 步骤一:将DM1-MCC溶液滴加至抗人CD20抗体中，搅拌均匀； 步骤二:置于4-25 °C的水浴或者空气浴中孵育2-24小时； 步骤三:控制DM1-SMCC与抗体的摩尔比为5-12:1;加入缓冲液，使抗体在反应液中的浓 度在l-10mg/ml; 4) 孵育后的反应液通过一步纯化，得到抗体药物偶联物;其方法步骤如下： 将反应液放入用置换缓冲液预先平衡的分子筛旋转层析柱中，使用离心机，以1000转/ 分钟的转速离心2分钟，所得样品即为纯化后的偶联物； 或将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的透析膜中，封口。将透析膜放入置换缓冲 液中，搅拌;24小时后，将置换后的反应液取出，即为纯化后的偶联物； 或将反应液放入截留分子量为10kDa、30kDa的超滤管中，以6000转/分钟的转速离心5 分钟，然后向超滤管中补加置换缓冲液，再进行离心操作；如此重复5次，取出超滤管中样 品，即为纯化后偶联物。2. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于:抗 体pH调节范围为6.0-7.5，优选7.0-7.2。3. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于:抗 体在反应液中的浓度为2_15mg/ml，优选5-10mg/ml。4. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于:配 制DM1-SMCC溶液的浓度为l-10mg/ml，优选2mg/ml。5. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于： DM1-SMCC相对于抗体加入的摩尔比为5-12:1，优选7:1。6. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于:反 应液孵育所设温度范围为4_25°C，优选25°C。7. 根据权利要求1所述的一种抗人CD20抗体-DM1偶联物及其制备方法，其特征在于:反 应液孵育时间为2-24小时，优选3小时。
【文档编号】A61P35/00GK105963711SQ201610458434
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】林帅, 靳维维, 戴明舒, 李浩强
【申请人】杭州皓阳生物技术有限公司