一种含酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用
【专利摘要】本发明的目的是提供一种含酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物及其在抗肿瘤转移中的应用，其所述的药物组合物包含以物质的量比为10:1?10的熊果酸和厄洛替尼，两者联用可以起到协同抗肿瘤转移的效果。其联用对恶性肿瘤细胞的迁移、侵袭等具有显著的抑制作用。
【专利说明】
一种含酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物及其在制备抗肿瘤转 移药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物组合物，属于药物组合物领域，具体的属于抗肿瘤转移的药 物组合物领域。
【背景技术】
[0002] 熊果酸即3β_羟基-熊果-12-稀_28_酸（30-hydroxy-urs-12-en-28-〇ic acid，简 称UA)，又名乌索酸、属于a-香树脂醇（a-amyrin)型五环三萜类化合物，其相对分子量为 456.68，分子式为C 3qH48O3，结构如式I所示是自然界中分布较广的天然活性化合物，主要以 游离或糖苷的形式存在，其广泛分布于枇杷叶、熊果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中， 也是许多传统中药的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病 毒、抗氧化等其中以抗癌活性最为显著，不仅对多种致癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细 胞在体内、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。近年来国 内外对UA的抗肿瘤研究日趋深入，并发现其在肿瘤预防、治疗以及防止晚期复发转移等方 面有着独特的优势及潜在的应用前景。专利N201510097801.9公开了一种含有熊果酸和环 磷酰胺的药物组合物，所述组合物既可以增强单组分的抗肿瘤药效，也能降低其对正常组 织的毒性，从而提高肿瘤治疗的效果，在肿瘤治疗领域具有很大的应用前景。专利 N03150714.X公开了熊果酸对人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人淋巴瘤细胞、人成淋巴细胞白 血病和人急性成淋巴细胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有细胞毒效 应。
[0003] 厄洛替尼(Erlotinb，简称E1)，结构如式Π所示，是近年来才上市的治疗晚期非 小细胞肺癌药物，在国际及国内肺癌指引中厄洛替尼均被列为晚期非小细胞肺癌二线治疗 药物之一，它是通过口服治疗非小细胞肺癌的靶向药物。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑 制剂（the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)是重要的靶向治疗药物之一，是以EGFR为靶点的小分子药物，通过竞争性结合受体的 ATP或底物结合区域，从源头阻断其信号传导而发挥作用。厄洛替尼作为EGFR小分子酪氨酸 激酶抑制剂，因其有口服简便、副作用小、易于被患者接受而临床应用广泛。结构如图2所 示。专利N201510360703.X公开了苦鬼臼毒和厄洛替尼联合用药用药肺癌的治疗，两者联合 使用后会产生协同抗肺癌作用；专利N 200680041064.X公开了将N-辛二酰苯胺异羟肟酸和 厄洛替尼联合使用用于肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症的治疗。
[0004] 以不同癌细胞系作为研究对象，通过将熊果酸和厄洛替尼联合用药，对不同癌细 胞系进行体外抗癌活性测试，结果表明，熊果酸和厄洛替尼的联合使用对恶性肿瘤细胞，特 别是对非小细胞肺癌的增殖迀移、侵袭等具有显著的抑制作用，呈浓度和时间依赖性的抑 制非小细胞肺癌的增殖。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种含酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物及其在制备抗肿瘤 转移药物中的应用，通过将酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果 酸进行联合用药，考察其联合用药后对癌细胞的抗转移作用，其可望获得较为安全可靠的 抑制肿瘤转移的新型候选药物。
[0006] 一种含酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物及其在抗肿瘤转移中的应用，其所述的药 物组合物包含以物质的量比为10:1-10的熊果酸和厄洛替尼，两者联用可以起到协同抗肿 瘤转移的效果。
【附图说明】
[0007] 图1.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24h对A549细胞增殖的抑制结果； 图2.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对H1975细胞增殖的抑制结果； 图3.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对H1299细胞增殖的抑制结果； 图4.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞侵袭能力的抑制结果； 图5.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞侵袭的抑制率； 图6.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h后对A549细胞迀移能力的抑制结果； 图7.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对A549细胞迀移的抑制率； 图8.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用48 h后对A549细胞迀移能力的抑制结果； 图9.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用48 h对A549细胞迀移的抑制率； 图10.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用72 h后对A549细胞迀移能力的抑制结 果； 图11.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用72 h对A549细胞迀移的抑制率； 图12.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用于A549细胞对EGFR蛋白表达水平的影 响； 图13.熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用于H1975细胞对EGFR蛋白表达水平的影 响。
【具体实施方式】
[0008] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0009] 实施例1 熊果酸和厄洛替尼单独使用及联合使用24 h对不同肺癌细胞系的增殖抑制作用:采用 标准MTT比色法测定了熊果酸和厄洛替尼不同联合比例对不同肺癌细胞系的增殖抑制活 性，结果如图1_3所不。
[0010] 如图1-3所示，当熊果酸（10 μΜ)和厄洛替尼（1-10 μΜ)在低浓度范围内联合用药 24 h后，对癌细胞无明显增殖抑制作用且对正常细胞的毒副作用小。因此后续选择将安全 有效的低剂量浓度(无明显细胞杀伤作用）的熊果酸和厄洛替尼联用，继续研究其对肺癌细 胞侵袭及转移的抑制能力，以探索其在抗肿瘤转移领域应用的潜力。
[0011] 实施例2 熊果酸和厄洛替尼单独使用以及联合使用对A549细胞株侵袭能力的影响 A549细胞先加无血清无酚红培养基饥饿过夜，消化、离心收集的细胞用含不同药物浓 度的空白培养基悬浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 yL含不同药物浓度的细胞悬浮 液(约5 X IO5/孔），下室加500 yL含10%小牛血清的培养基，药物作用24 h，取出小室，用4% 的多聚甲醛固定20 min，用棉签擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3次，用0.1 %结晶紫染色40 min，用PBS洗3次，将小室的底膜取下，封片保存，倒置显微镜下随机5个视野下拍照，统计迀 移的细胞数，结果如图4、5所示。
[0012] 实验结果如图4、5所示，熊果酸和厄洛替尼单独使用以及联合使用24 h后对A549 细胞株侵袭能力的检测，结果表明，空白对照组、UA(浓度在10 μΜ条件下）和厄洛替尼(浓 度在10-40 μΜ条件下)单独使用组，穿过微孔滤膜的细胞数明显高于熊果酸和厄洛替尼(浓 度在1-8 μΜ条件下)联合用药组;两者联用细胞侵袭能力明显受到了抑制，可以减少厄洛替 尼的给药剂量。
[0013] 实施例3 熊果酸和厄洛替尼单独使用以及联合使用对Α549细胞株迀移能力的影响 取对数生长期的细胞(约3 X IO6/孔)接种于该板中，置于37°C，5% CO2的培养箱中培 养24 h，待细胞接近融合后，用白色枪头在孔板的1/4、1/2、3/4处垂直的划三条平行线，用 PBS清洗细胞3次，在荧光显微镜下拍划痕宽带，记录下所拍图片的坐标轴。加入含不同药物 浓度的培养基，置于37°C，5% CO2的培养箱中培养24、48、72 h在同一部位再次拍照，测定 迀移距离，对比各组两次拍照的迀移距离，结果如图6-11所示。
[0014] 实验结果如图6-11所示，熊果酸和厄洛替尼单独使用以及联合使用24、48、72 h后 对A549细胞株细胞迀移抑制率检测，结果表明：在0 h，给药干预组与空白对照组对比迀移 距离无明显影响，经给药24 h后，空白对照组细胞发生了很明显的迀移，划痕宽带变窄；当 UA浓度为10 μΜ的时候，细胞也明显的发生了迀移;厄洛替尼在高浓度（多20 μΜ)的条件下， 细胞的迀移能力受到了抑制，划痕愈合速度减慢;但当两者联合使用后，在厄洛替尼在多4 μΜ的情况下，划痕宽带明显比单用厄洛替尼多20 μΜ来的宽，且呈浓度依赖性的抑制细胞的 迀移能力。经给药48 h后，空白对照组细胞的划痕已经闭合；当UA浓度为10 μΜ的时候，细胞 很明显的发生了迀移，划痕宽度变得很窄;厄洛替尼在多20 μΜ的条件下能明显的抑制细胞 的迀移能力;但当两者联合使用后，在厄洛替尼在3 μΜ的条件下，就能较明显的抑制细胞的 迀移能力，随着厄洛替尼药物浓度的增大，细胞的迀移能力也会变小。经给药72 h后，空白 对照组、UA浓度为10 μΜ及厄洛替尼在10 μΜ的条件下，细胞的划痕都已经趋于闭合;但当两 者联合使用后，在厄洛替尼在1 μΜ的条件下，就能较明显的抑制细胞的迀移能力。因此两者 联合用药，能呈浓度依赖性和时间依赖性的抑制细胞的迀移能力，划痕宽度与空白对照组 相比差异明显且具有统计学意义(Ρ〈〇.01)。
[0015] 实施例4 熊果酸和厄洛替尼单独使用以及联合使用对Α549、Η1975细胞EGFR蛋白表达水平的影 响 将细胞接种至6孔板，待细胞达80 %以上加不同药物干预细胞24 h后，弃去培养液，用 预冷的PBS漂洗细胞2次，向6孔板中的每孔加入新鲜配制的细胞裂解液R I PA (radioimmunopre-cipitation assay) 200 yL[l mL RIPA中加入 10 yL蛋白酶抑制剂、10 UL磷酸酶抑制剂和5 yL苯甲基横酰氣(phenylmethanesulfonyIfIuoride，PMSF)]，冰上放 置30 min，每5 min摇晃一次，12000Xg 4°C离心15 min，取上清液，制备总蛋白；采用二喹 啉甲酸(bicincho-ninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以β-actin水平作 为等量蛋白质上样，取20 yg蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 电泳，然后将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙稀(p〇lyvinylidene, PVDF)膜上，室温下用 含5%脱脂奶粉的TBST封闭I h，加入一抗4°C反应过夜，次日用TBST室温下洗膜3次（10 min/次），再加入HRP标记的二抗（1:5000稀释)在室温下孵育I h，用TBST在室温下再次洗膜 3次（10 min/次），最后电化学发光显影。采用图像分析软件Image J对条带进行灰度值分 析，结果如图12、13所示。
[0016] 实验结果如图12、13所示，空白对照组不影响A549和H1975细胞EGFR蛋白水平的表 达；当UA浓度为10 μΜ和厄洛替尼在20 μΜ的条件下，对A549和H1975细胞EGFR蛋白水平的表 达水平的影响不大;但当两者联合给药(厄洛替尼在4 μΜ条件下），就能起到协同增效的作 用，能够明显的抑制EGFR蛋白表达水平，通过下调EGFR蛋白的表达水平进而抑制癌细胞的 增殖、抑制细胞的转移。
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤转移活性的药物组合物，其特征在于包含物质的量比为?ο: 1-10的 熊果酸和厄洛替尼。2. 如权利要求1所述的药物组合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
【文档编号】A61K31/517GK105963305SQ201610519494
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】邵敬伟, 郑桂容, 江凯
【申请人】福州大学