具有促进成骨细胞方向性生长和迁移的支架制备方法【专利摘要】本发明公开的具有促进成骨细胞方向性生长和迁移的支架制备方法，步骤如下：将平行排列的医用PLLA熔融纺纤维采用溶剂粘结法制备有序支架，或将医用PLLA切片通过静电纺丝技术制备纳米纤维有序支架，或将有序支架进行胶原和壳聚糖涂层改性制备复合有序支架。该有序支架具有良好的成骨细胞生长、粘附、迁移和增殖效果，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迁移效果，并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA纤维取向分布的方向。该有序支架具有较好的应用前景，可以应用于骨关节炎患者和骨修复等骨组织工程领域。【专利说明】具有促进成骨细胞方向性生长和迁移的支架制备方法
技术领域：
[0001]本发明涉及具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，尤其是能够应用于骨组织工程领域的左旋聚乳酸(PLLA)熔融纺纤维有序支架制备方法。【
背景技术：
】[0002]由创伤、炎症、肿瘤引起的大面积骨缺损是外科整形医生面临的挑战，近年来，组织工程提供了一些很有前途的方法对骨缺损进行修复(CanceddaR,GiannoniP,MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007,28(29):4240-4250.)。人类骨骼对各种创伤具有非凡的再生能力，可以使得骨创伤的部位在形状和大小方面与创伤前一模一样。但是，自发的骨愈合并不是很理想。而固定对骨折愈合具有非常重要的作用。因此，有必要采用现代内固定技术来解决感染、血管质差、营养不良、大量骨或软组织损失的问题(RobertsTT,RosenbaumAJ:Bonegrafts，bonesubstitutesandorthob1logicsThebridgebetweenbasicscienceandclinicaladvancementsinfracturehealing.0rganogenesis2012，8(4):114-124.)D从病人组织获取细胞，通过体外培养，再种植在具有生物降解性的三维支架上。将细胞-支架复合物植入体内，支架被吸收和降解，骨形成细胞会快速生长，从而加快组织愈合，达到修复骨缺损的目的(CiapettiG,Ambros1L，SavarinoL，GranchiD，CenniE，BaldiniN，PaganiS，GuizzardiS，CausaF，GiuntiA:Osteoblastgrowthandfunct1ninporouspolyepsi1n-caprolactonematricesforbonerepair:apreliminarystudy.B1materials2003,24(21):3815-3824.)D[0003]目前的治疗方法包括骨嫁接移植(自体移植、同源或异种移植)和骨修复生物材料(CanceddaRjGiannoniP，MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007，28(29):4240-4250.)。骨嫁接移植方法在临床实践的成功率较高，但也有许多不足之处，比如并发症、创伤后骨折不愈合、宿主骨缺损部分的替代物有限等问题(CanceddaRjGiannoniP，MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007，28(29):4240-4250.MuramatsuK，DoiK，IharaK，ShigetomiM，KawaiS:Recalcitrantposttraumaticnonun1nofthehumerus-23patientsreconstructedwithvascularizedbonegraft.ActaOrthopScand2003，74(I):95-97.)。同种异体骨移植材料主要用来修复较大面积的骨缺损，但经过同种异体骨移植材料修复后的骨缺损失败率在10年期间达到60%，这主要是由于组织材料性能的降解(强力和模量)、骨矿物质密度的减小和微裂隙的增加(WheelerDLjEnnekingWF:Allograftbonedecreasesinstrengthinvivoovertime.ClinOrthopRelatR2005(435):36-42.)。自体骨移植方法会引起捐献者的发病率(LaurieSffSjKabanLB，MullikenJBjMurrayJE:Donor-SiteMorbidityafterHarvestingRibandIliacBone.PlastReconstrSurg1984，73(6):933-938.)，并且发病率及发病的表现程度和捐献的部位、时间等有关(ChenYC,ChenCHjChenPL,HuangIYjShenYS,ChenCM:Donorsitemorbidityafterharvestingofproximaltibiabone.HeadNeck-JSciSpec2006，28(6):496-500.)。在过去的十年中，骨组织工程的主要目标是利用可生物降解材料作为充填大面积骨缺损的移植替代物。这些材料应能提供组织愈合过程的机械强度、骨传导作用，以及新骨形成过程中可控的降解速率(RizziSC，HeathDT,CoombesAGAjBockN，TextorMjDownesS:B1degradablepolymer/hydroxyapatitecomposites:Surfaceanalysisandinitialattachmentofhumanosteoblasts.JB1medMaterRes2001，55(4):475-486.)。[0004]由于与骨的化学成分和机械性能比较相近，羟基磷灰石(Hap)可以单独或者与其它材料复合作为骨修复的材料(MastrogiacomoMjScagl1neS，MartinettiRjDolciniLjBeltrameF，CanceddaRjQuartoR:Roleofscaffoldinternalstructureoninvivoboneformat1ninmacroporouscalciumphosphateb1ceramics.B1materials2006，27(17):3230-3237.)。除过化学成分和机械性能外，密度、孔的形状、孔径、孔间连通性也是设计骨修复支架的重要参数(Gauthier0，BoulerJM，AguadoEjPiletP，DaculsiG:Macroporousbiphasiccalciumphosphateceramics:1nfluenceofmacroporediameterandmacroporositypercentageonboneingrowth.B1materials1998，19(1-3):133-139.ChangBSjLeeCKjHongKSjYounHJ，RyuHS，ChungSS，ParkKff:Osteoconduct1natporoushydroxyapatitewithvar1usporeconfigurat1ns.B1materials2000，21(12):1291-1298.)D现有的可以应用于骨修复的材料主要有合成高分子、生物陶瓷以及复合材料等(RizziSC，HeathDTjCoombesAGA，BockN，TextorM，DownesS:B1degradablepolymer/hydroxyapatitecomposites:Surfaceanalysisandinitialattachmentofhumanosteoblasts.JB1medMaterRes2001，55(4):475-486.)D其支架制备方法有静电纺PLGAf^CBashurCA，DahlgrenLA，GoldsteinAS:Effectoffiberdiameterandorientat1nonfibroblastmorphologyandproliferat1nonelectrospunpoly(D,L-lactic-co-glycolicacid)meshes.B1materials2006，27(33):5681-5688.)，通过乳化法制备的轻基磷灰石(CDHA)和β-磷酸三^(P-TCPMKastenP，LuginbuhlRjvanGriensvenM，BarkhausenT，KrettekC，BohnerΜ，BoschU:Comparisonofhumanbonemarrowstromalcellsseededoncalcium-deficienthydroxyapatite,beta-tricalciumphosphateanddemineralizedbonematrix.B1materials2003，24(15):2593-2603.),利用气体发泡/粒子滤出法(GF/PL)制备的Poly(D，L-lactic-co-glycolicacid)/nano-hydroxyapatite(PLGA/HA)复合支架(KimSSjParkMS,Jeon0，ChoiCY,KimBS:PoIy(Iactide-co-glycoIide)/hydroxyapatitecompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(8):1399—1409.)，利用微球技术制备的聚合物基接枝支架(BordenMjAttawiaMjKhanY，LaurencinCT:Tissueengineeredmicrosphere-basedmatricesforbonerepair:designandevaluat1n.B1materials2002，23(2):551-559.)，利用相转化和饶铸技术制备的微孑L—大孑LPCL支架(CiapettiG，Ambros1L,SavarinoL,GranchiD，CenniE，BaldiniN，PaganiS，GuizzardiS，CausaF，GiuntiA:Osteoblastgrowthandfunct1ninporouspolyepsilon-caprolactonematricesforbonerepair:apreliminarystudy.B1materials2003，24(21):3815-3824.)，利用粒子滤出法制备的PCL-HA复合支架(YuHYjVandeVordPJjMaoLjMatthewHffjWooleyPHjYangSY:1mprovedtissue-engineeredboneregenerat1nbyendothelialcelImediatedvascularizat1n.B1materials2009，30(4):508-517.)，利用模塑方法制备的β-TCP多孔支架(YuanJjCuiLjZhangWJjLiuW，Ca。YL:Repairofcaninemandibularbonedefectswithbonemarrowstromalcellsandporousbeta-tricalciumphosphate.B1materials2007，28(6):1005-1013.)等。[0005]在骨修复时，有两种类型的骨，即密质骨和松质骨。密质骨形成了长骨头并且承担了人身体的重量(SommerfeldtD，RubinC:B1logyofboneandhowitorchestratestheformandfunct1noftheskeleton.EurSpineJ2001，10(2):S86-S95.)。密质骨内的轻基磷灰石呈现有序结构，这种有序结构导致了密质骨的机械和生物属性，如弹塑性行为、环境阻力和生物兼容性(ZhouH，LeeJ:Nanoscalehydroxyapatiteparticlesforbonetissueengineering.ActaB1mater2011，7(7):2769-2781.)。并且羟基磷灰石的有序结构与I型胶原蛋白的结构高度相关(SasakiN，SudohY:X-raypolefigureanalysisofapatitecrystalsandcollagenmoleculesinbone.Calcifiedtissueinternat1nal1997，60(4):361-367.)DHAp晶体最初沉积在胶原纤维的孔区，并且晶体的长轴与有序排列的胶原纤维呈现平行排列状态(LandisW，SongM，LeithA，McEwenLjMcEwenB:Mineralandorganicmatrixinteract1ninnormallycalcifyingtendonvisualizedinthreedimens1nsbyhigh-voltageelectronmicroscopictomographyandgraphicimagereconstruct1n.Journalofstructuralb1logy1993，110(1):39-54.)0其中适合骨组织工程的支架孔径大小为20-1500μπι(MurphyCM，HaughMG，O’BrienFJ:Theeffectofmeanporesizeoncellattachment,proliferat1nandmigrat1nincollagen-glycosaminoglycanscaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2010，31(3):461-466.)，45%的孔隙率(Karageorg1uV，KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.),最大应力为5.3MPa或者更大(Karageorg1uV,KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.)。因此，有必要利用有序支架来模拟密质骨内羟基磷灰石的有序结构，并且模拟细胞生长的细胞外基质(ECM)环境。在三维条件下模拟细胞外基质(ECM)并且构建具有一定结构的组织工程支架是研究热点(HubbellJA:Materialsasmorphogeneticguidesintissueengineering.CurrOpinB1tech2003，14(5):551-558.)。可以用许多处理方法来制备具有纳米、微观和宏观尺度的天然或合成纤维支架(StevensMMjGeorgeJH:Exploringandengineeringthecellsurfaceinterface.Science2005，310(5751):1135-1138.BowlinGL:Anewspinonscaffold.MaterToday2004，7(5):64.)。但要模拟复杂的天然细胞外基质仍然比较困难，因为支架的结构和化学性质会影响到细胞反应(SunTjNortonD，RyanA，MacNeilS，HaycockJ:1nvestigat1noffibroblastandkeratinocytecell-scaffoldinteract1nsusinganovel3Dcellculturesystem.JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2007，18(2):321-328.)。通过丝状伪足可以观察粘附细胞与ECM之间的相互作用，因为细胞在起始阶段会前伸，然后形成片状伪足。这主要是由于受体整合素的作用，细胞才会粘附到ECM的配体(DalbyMjChildsS，RiehleMjJohnstoneH，AffrossmanS，CurtisA:Fibroblastreact1ntoislandtopography:changesincytoskeletonandmorphologywithtime.B1materials2003，24(6):927-935.)。如果细胞粘附在合成材料支架上，则可以通过吸附的一层很薄的蛋白质来调控细胞-支架材料之间的相互作用。其中体外细胞行为主要受宏观、微观和纳米尺度的表面化学和形貌影响(StevensMM，GeorgeJH:Exploringandengineeringthecellsurfaceinterface.Science2005，310(5751):1135-1138.)。其中有序支架与ECM中蛋白质和多糖复杂的化学和物理交联网络的取向结构类似，可以指导细胞在空间的生长方向，并且对细胞行为进行调控(XuC，InaiR，KotakiM，RamakrishnaS:Alignedb1degradablenanofibrousstructure:apotentialscaffoldforbloodvesselengineering.B1materials2004，25(5):877-886.)。因此，可以利用有序支架模拟密质骨内ECM的取向结构，并且对成骨细胞在有序支架上的迀移、粘附和增殖进行调控，进而对骨修复效果进行调控。[0006]可以应用于医用的合成高分子有聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯酸(PAA)、聚乙二醇(PEG)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)(KarageorgiouV，KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.RezwanK，ChenQZ,BlakerJJ,BoccacciniAR:B1degradableandb1activeporouspolymer/inorganiccompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(18):3413-3431.)等。相比其它的可生物降解聚合物PGA和PCL，PLA的溶融纺丝更容易实现，并且可以制得粗细均勾和质量较好的纤维(RezwanK，ChenQZ,BlakerJJ,BoccacciniAR:B1degradableandb1activeporouspolymer/inorganiccompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(18):3413-3431.NairLS,LaurencinCT:B1degradablepolymersasb1materials.ProgPolymSci2007，32(8-9):762-798.)。[0007]根据纤维支架制备方法可以看出，这些纤维形成的支架主要为无序支架。而有序支架的概念是在1991年提出，当时Rizvi(RizviAHjffassermanAJjZazanisGjSilverFH:Evaluat1nofPeripheral-NerveRegenerat1ninthePresenceofLongitudinallyAlignedCollagen-Fibers.CellMater1991，I(4):279-289.)将平行有序排列的小直径胶原纤维放置在硅胶管上，胶原纤维便形成10mm间距的有序支架。实验结果表明成纤维细胞和雪旺细胞可以沿着胶原纤维有序排列的方向进行迀移。同时，这种有序排列的纤维可以提高组织再生效果，并且有序支架可以控制和引导细胞的生长方向。[0008]生物材料的表面改性是制备仿生材料的一种常用方法，其中生物材料与生物活性分子的结合是一种简单的改性方法。利用长链蛋白如纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)和层粘连蛋白(LN)和支架结合可以促进细胞粘附和增殖(HumphriesMJ,AkiyamaSKjKomoriyaAjOldenK，YamadaKM:1dentificat1nofanalternativelysplicedsiteinhumanplasmafibronectinthatmediatescelltype-specificadhes1n.TheJournalofcellb1logy1986,103(6):2637-2647.)^而其它的改性方法有等离子体处理(提高支架表面亲水性和细胞粘附)(YangJjBeiJjWangS:Enhancedcellaffinityofpoly(D，L-1actide)bycombiningplasmatreatmentwithcollagenanchorage.B1materials2002，23(12):2607-2614.)、表面涂层(促进细胞铺展、粘附和生长)(HeW，MaZ,YongT，TeoWE,RamakrishnaS:Fabricat1nofcollagen-coatedb1degradablepolymernanofibermeshanditspotentialforendothelialcellsgrowth.B1materials2005，26(36):7606-7615.)和表面接枝(提高细胞铺展和增殖)(MaZ,KotakiM，YongT，HeW，RamakrishnaS:Surfaceengineeringofelectrospunpolyethyleneterephthalate(PET)nanofiberstowardsdevelopmentofanewmaterialforbloodvesselengineering.B1materials2005，26(15):2527-2536.)等。而表面涂层有很多种类，比如热喷涂、溅射镀膜、脉冲激光沉积、动态混合涂层、浸渍涂层、溶胶-凝胶、电泳沉积、热等静压和溶液沉积等(SunLjBerndtCC，GrossKAjKucukA:Materialfundamentalsandclinicalperformanceofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatings:areview.JB1meclMaterRes2001，58(5):570-592.YangY，KimK-HjOngJL:Areviewoncalciumphosphatecoatingsproducedusingasputteringprocess——analternativetoplasmaspraying.B1materials2005，26(3):327-337.)。其中浸渍涂层是一种容易实现的方法，其实验过程是先配制一定浓度的浸渍液，然后将材料浸渍其中一定时间，再将其取出在一定温度条件下干燥，可以得到浸渍涂层的材料。在使用涂层方法改变材料的化学性质时，需要考虑涂层效果的稳定性(SunL,BerndtCC,GrossKA,KucukA:Materialfundamentalsandclinicalperformanceofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatings:areview.JB1medMaterRes2001，58(5):570-592.)，即不会发生浸渍液与材料分离现象，不会使涂层效果减弱。在浸渍涂层支架时，胶原和壳聚糖是两种常用的浸渍液。其中胶原蛋白是许多组织ECM的主要成分，并且其纤维结构有助于细胞粘附(ElsdaleT,BardJ:Collagensubstrataforstudiesoncellbehav1r.TheJournalofcellb1logy1972，54(3):626-637.)。而壳聚糖具有较好的生物降解和生物兼容性，沿着壳聚糖链的氨基和羟基能够形成稳定的共价键，在生物医学领域有广泛应用(Cust0d1C，CerqueiraΜ,MarquesA，ReisR，ManoJ:Cellselectivechitosanmicroparticlesasinjectablecellcarriersfortissueregenerat1n.B1materials2015，43:23-31.)oFu(FuX，XuMjLiuJ，QiY，LiS，WangH:Regulat1nofmigratoryactivityofhumankeratinocytesbytopographyofmultiscalecollagen-containingnanofibrousmatrices.B1materials2014，35(5):1496—1506.)禾Ij用浸溃涂层方法制备了胶原涂层支架，并且在其上种植角质细胞，实验结果表明胶原涂层支架可以提高细胞的迁移、增殖和粘附cXheng【l】(ChengZYjTeohSH:Surfacemodificat1nofultrathinpoly(epsilon-caprolactone)filmsusingaeryIicacidandcollagen.B1materials2004，25(11):1991-2001.)的研究结果表明胶原涂层后的PCL膜具有较小的接触角，并且细胞粘附和增殖效果得到提高。而(LinC-CjFuS-JjLinY-C，Yang1-K,GuY:Chitosan-coatedelectrospunPLAfibersforrapidmineralizat1nofcalciumphosphate.1ntJB1lMacromol2014，68:39—47.)和(MehrNG,LiXjChenG，FavisBD,HoemannCD:PoresizeandLbLchitosancoatinginfluencemesenchymalstemcellinvitrofibrosisandb1mineralizat1nin3Dporouspoly(epsi1n-caprolactone)scaffolds.JB1medMaterResA2014.)的研究结果表明壳聚糖涂层支架也可以促进细胞迀移、粘附和增殖。[0009]目前，有序支架的制备方法主要有静电纺丝法、单向热拉伸法、熔融沉积法、纤维打结法、脉冲热封机热压法、紫外光固化粘合剂法。利用不同的接收装置和接收方法制备有序支架的静电纺丝方法，在某种程度上具有一些优势，比如广泛的医用高分子材料、简单的制备过程、纳米尺度的纤维直径和较高的孔隙率。但这种支架的力学性能较差，支架中有序纤维根数无法知道，纤维与纤维之间的粘合效果较差，并且国内没有规模化制备静电纺纳米纤维的宽幅设备。利用静电纺丝方法制备有序支架现在也只是小量实验阶段，无法满足产业化实际应用要求。单向热拉伸方法在拉伸过程中很容易造成纤维的断裂，并且拉力的不均匀性会引起支架表面的不平整。熔融沉积法是借助计算机辅助技术来实现纤维的有序排列，操作过程比较复杂，成本较高。纤维打结法、脉冲热封机热压法和紫外光固化粘合剂法在制备有序支架过程中，很难控制有序支架中纤维的根数和形成较大尺寸的支架。【
发明内容】[0010]本发明的目的是针对现有技术存在的不足，而提供一种具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法。[0011]本发明的具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，有以下五种技术解决方案。[0012]方案一:具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸(PLLA)熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)采用以下a)?c)中任一方法，将步骤I)的平行排列的医用聚左旋乳酸熔融纺有序纤维束制备成有序支架:a)搅拌下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的四氢呋喃溶液，将配制的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5s，在45°C下真空干燥；b)搅拌下，将聚乙醇酸(PGA)溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚乙醇酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚乙醇酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥；c)搅拌下，将聚己内酯(PCL)溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚己内酯的四氢呋喃溶液，将配制的聚己内酯的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥。[0013]方案二:具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸(PLLA)熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发。[0014]方案三:具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸(PLLA)熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸切片溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的左旋聚乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的左旋聚乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，得到有序支架；3)搅拌下，将乙酸溶解在去离子水中，配制体积浓度为2%的乙酸水溶液，将胶原溶解到乙酸水溶液中，配制质量浓度为0.5%的胶原乙酸溶液，将步骤2)的有序支架完全浸没在胶原乙酸溶液中3h，取出，放在通风橱中，使乙酸完全挥发，在37°C条件下干燥。[0015]方案四:具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸(PLLA)熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸切片溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，得到有序支架；3)搅拌下，将乙酸溶解在去离子水中，配制体积浓度为2%的乙酸水溶液，将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，配制质量浓度为1%的壳聚糖乙酸溶液，将步骤2)的有序支架完全浸没在壳聚糖乙酸溶液中3h，取出，放在通风橱中使乙酸完全挥发，在37°C条件下干燥。[0016]方案五:具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:将聚左旋乳酸(PLLA)切片溶解于三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂中，混合溶剂中三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的体积比为9:1，搅拌至完全溶解配制质量浓度为8%的纺丝液，采用静电纺丝法制备支架，控制静电纺丝设备中纺丝电压为12kv，注射针头流量为0.8mL/h，接收辊转速为1000转/分，接收距离为20cm，纺丝时间为5h，纺丝时环境温度为23°C，湿度为64%，所用注射管的体积为20mL，注射针头内径为6mm，注射针头长度为10cm0[0017]本发明的有益效果在于:本发明方法工艺简单，制备的具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架具有良好的生长、粘附、迀移和增殖性能，成骨细胞在本发明制备的有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果，并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA纤维取向分布的方向。该有序支架具有较好的应用前景，可以应用骨关节炎患者和骨修复等骨组织工程领域。【附图说明】[0018]图1是成骨细胞在实施例1PLLA-PLGA有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果O[0019]图2是成骨细胞在实施例2PLLA-PGA有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0020]图3是成骨细胞在实施例3PLLA-PCL有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0021]图4是成骨细胞培养在实施例1、2、3制备的有序支架上培养Id、3d、5d后的增殖结果比较。[0022]图5是成骨细胞在实施例4PLLA-PLLA熔融纺纤维有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0023]图6是成骨细胞在实施例5PLLA静电纺纳米纤维有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0024]图7是成骨细胞培养在实施例4、5制备的有序支架上培养ld、3d后的增殖结果比较。[0025]图8是成骨细胞在实施例6胶原涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0026]图9是成骨细胞在实施例7壳聚糖涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上的方向性生长、粘附和迀移结果。[0027]图10是成骨细胞培养在实施例6、7制备的有序支架上培养ld、3d后的增殖结果及与实施例5的结果比较。【具体实施方式】[0028]以下结合实施例进一步说明本发明。[0029]实施例1:将具有光滑表面、圆形横截面、直径0.16mm、熔点170.69°C的医用PLLA熔融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将0.5gPLGA切片(购自山东省医疗器械研究所中试厂，分子量为30万，熔点为54.33°C)溶解于1mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PLGA/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)。把PLGA/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLLA有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发，在60°C的烘箱中烘干20min，再将其浸没在液氮中淬火5min。淬火结束后，放在通风橱中干燥30min，去除冷凝的水蒸气。并且将其放置在四氢呋喃中Is，然后在真空烘箱中45°C下干燥24h，得到具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的PLLA-PLGA有序支架。[0030]图1是成骨细胞在本例制得的PLLA-PLGA有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0031]成骨细胞在本例制得的PLLA-PLGA有序支架上培养ld、3d、5d后的增殖效果见图4，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0032]实施例2:将具有光滑表面、圆形横截面、直径0.16mm、熔点170.69°C的医用PLLA熔融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将0.5gPGA切片(购自山东省医疗器械研究所中试厂，分子量为30万，熔点为209.22°C)溶解于1mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PGA/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)。把PGA/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLLA有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发，在60°C的烘箱中烘干20min，再将其浸没在液氮中淬火5min。淬火结束后，放在通风橱中干燥30min，去除冷凝的水蒸气。并且将其放置在四氢呋喃中IS，在45°C下真空干燥24h，得到具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的PLLA-PGA有序支架。[0033]图2是成骨细胞在本例制得的PLLA-PGA有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0034]成骨细胞在本例制得的PLLA-PGA有序支架上培养ld、3d、5d后的增殖效果见图4，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0035]实施例3:将具有光滑表面、圆形横截面、直径0.16mm、熔点170.69°C的医用PLLA熔融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将0.5gPCL切片(购自山东省医疗器械研究所中试厂，分子量为30万，熔点为59.77°C)溶解于1mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PCL/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)。把PCL/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLLA有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发。在60°C的烘箱中烘干20min，再将其浸没在液氮中淬火5min。淬火结束后，在通风橱中干燥30min，去除冷凝的水蒸气。并且将其放置在四氢呋喃中IS，在45°C下真空干燥24h，得到具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的PLLA-PCL有序支架。[0036]图3是成骨细胞在本例制得的PLLA-PCL有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0037]成骨细胞在本例制得的PLLA-PCL有序支架上培养ld、3d、5d后的增殖效果见图4，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0038]实施例4:将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι、熔点170.69°C的医用PLLA恪融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将IgPLLA切片(购自济南岱罡生物工程有限公司，分子量为30万，熔点为176.9°C)溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PLLA/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)ο把PLLA/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLA有序纤维束的正反面各两次，把湿的有序支架放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发，得到干燥后的具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的PLLA-PLLA有序支架。[0039]图5是成骨细胞在本例制得的PLLA-PLLA有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0040]成骨细胞在本例制得的PLLA-PLLA有序支架上培养1、3、5d后的增殖效果见图4，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0041]实施例5:将0.8g的PLLA切片溶解于10mL三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂中，混合溶剂中三氯甲烷和DMF的体积比为9:1，搅拌至完全溶解制备质量浓度8%的纺丝液。利用静电纺丝设备，并控制纺丝电压为12kv，注射针头流量为0.8mL/h，接收辊转速为1000转/分，接收距离为20cm，纺丝时间为5h，纺丝时环境温度为23°C，湿度为64%。所用注射管的体积为20mL，注射针头内径为6mm，注射针头长度为10cm的条件制备具有光滑表面和圆形横截面，纤维直径为510nmPLLA纳米纤维有序支架。[0042]图6是成骨细胞在本例制得的PLLA纳米纤维有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0043]成骨细胞在本例制得的PLLA纳米纤维有序支架上培养ld、3d后的增殖效果见图7，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0044]实施例6:将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι、熔点170.69V的医用PLLA熔融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将IgPLLA切片(购自济南岱罡生物工程有限公司，分子量为30万，熔点为176.9°C)溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PLLA/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)ο把PLLA/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLA有序纤维束的正反面各两次，把湿的有序支架放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发，得到干燥后的有序支架。[0045]然后将有序支架进行胶原涂层改性。首先将乙酸溶解在去离子水中，配制体积浓度为2%的100mL乙酸溶液。称取0.5g胶原溶解在上述乙酸溶液中，直至胶原完全溶解，制备质量浓度0.5%的胶原乙酸溶液。将制备好的有序支架放入玻璃器皿中，并倒入胶原溶液使支架完全浸没在胶原溶液中3h。浸泡结束后，将有序支架从玻璃器皿中取出，放在通风橱中24h，再将其放在37°C的电热鼓风干燥箱中3h使其完全干燥，得到胶原涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架。[0046]图8是成骨细胞在本例制得的胶原涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0047]成骨细胞在本例制得的胶原涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上培养ld、3d后的增殖效果见图10，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。[0048]实施例7:将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30μπι、熔点170.69V的医用PLLA熔融纺纤维进行平行排列成为有序纤维束;将IgPLLA切片(购自济南岱罡生物工程有限公司，分子量为30万，熔点为176.9°C)溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌直到完全溶解形成均匀PLLA/四氢呋喃溶液(体积浓度为5%)ο把PLLA/四氢呋喃溶液均匀刷涂在PLA有序纤维束的正反面各两次，把湿的有序支架放在通风橱中24h，使四氢呋喃完全挥发，得到干燥后的有序支架。[0049]然后将有序支架进行壳聚糖涂层改性。首先将乙酸溶解在去离子水中，配制得到体积浓度为2%的乙酸溶液。称取0.5g壳聚糖溶解在50mL体积浓度为2%的乙酸溶液中，直至壳聚糖完全溶解，制备质量浓度I%的壳聚糖乙酸溶液。其中壳聚糖的DAC>85%，80目，购自济南海得贝海洋生物工程有限公司。将制备好的有序支架放入玻璃器皿中，并倒入壳聚糖乙酸溶液使支架完全浸没在壳聚糖乙酸溶液中3h。浸泡结束后，将有序支架从玻璃器皿中取出，放在通风橱中24h，再将其放在37°C的电热鼓风干燥箱中3h使其完全干燥，得到壳聚糖涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架。[0050]图9是成骨细胞在本例制得的壳聚糖涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上的生长、粘附、迀移和增殖结果，由图可见，成骨细胞在有序支架上呈现方向性的生长、粘附和迀移效果。并且成骨细胞的生长方向沿着有序支架中PLLA熔融纺纤维取向分布的方向。[0051]成骨细胞在本例制得的壳聚糖涂层聚左旋乳酸熔融纺纤维有序支架上培养ld、3d后的增殖效果见图10，该支架具有良好的细胞相容性，没有毒性，可以促进细胞的生长和增殖。【主权项】1.具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30ym-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)采用以下a)?c)中任一方法，将步骤I)的平行排列的医用聚左旋乳酸熔融纺有序纤维束制备成有序支架:a)搅拌下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的四氢呋喃溶液，将配制的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5s，在45°C下真空干燥；b)搅拌下，将聚乙醇酸溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚乙醇酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚乙醇酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥；c)搅拌下，将聚己内酯溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚己内酯的四氢呋喃溶液。将配制的聚己内酯的四氢呋喃溶液均匀刷涂在平行排列的医用聚左旋乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后将其放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，在60°C下烘干，再将其浸没在液氮中淬火5min，淬火结束后，放在通风橱中干燥，去除冷凝的水蒸气，然后将其放置在四氢呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥。2.具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30ym-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发。3.具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:1)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30ym-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸切片溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的左旋聚乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的左旋聚乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，得到有序支架；3)搅拌下，将乙酸溶解在去离子水中，配制体积浓度为2%的乙酸水溶液，将胶原溶解到乙酸水溶液中，配制质量浓度为0.5%的胶原乙酸溶液，将步骤2)的有序支架完全浸没在胶原乙酸溶液中3h，取出，放在通风橱中，使乙酸完全挥发，在37°C条件下干燥。4.具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:I)将具有光滑表面、圆形横截面、直径70.30ym-0.16mm、熔点170.69°C的医用聚左旋乳酸熔融纺纤维平行排列成为有序纤维束；2)搅拌下，将聚左旋乳酸切片溶解在四氢呋喃溶液中，配制体积浓度为5%的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液，将配制的聚左旋乳酸的四氢呋喃溶液均匀刷涂在步骤I)的平行排列的医用左旋聚乳酸有序纤维束的正反面各两次，然后放在通风橱中，使四氢呋喃完全挥发，得到有序支架；3)搅拌下，将乙酸溶解在去离子水中，配制体积浓度为2%的乙酸水溶液，将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，配制质量浓度为1%的壳聚糖乙酸溶液，将步骤2)的有序支架完全浸没在壳聚糖乙酸溶液中3h，取出，放在通风橱中使乙酸完全挥发，在37°C条件下干燥。5.具有促进成骨细胞方向性生长和迀移的支架制备方法，其特征是包括如下步骤:将聚左旋乳酸切片溶解于三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的混合溶剂中，混合溶剂中三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的体积比为9:1，搅拌至完全溶解配制质量浓度为8%的纺丝液，采用静电纺丝法制备支架，控制静电纺丝设备中纺丝电压为12kv，注射针头流量为0.8mL/h，接收棍转速为1000转/分，接收距离为20cm，纺丝时间为5h，纺丝时环境温度为23°C，湿度为64%。所用注射管的体积为20mL，注射针头内径为6mm，注射针头长度为10cm。【文档编号】A61L27/18GK105944145SQ201610435977【公开日】2016年9月21日【申请日】2016年6月16日【发明人】冯建永【申请人】浙江理工大学