一种鸡疫苗用免疫增强剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种鸡疫苗用免疫增强剂，是鸡基因工程细胞因子复合物，包括重组鸡干扰素α、重组鸡干扰素γ和重组鸡IL?2按合适比例配伍组合而成。本发明的鸡疫苗用免疫增强剂在疫苗使用中添加，添加量为疫苗的1~30%，能有效地提高疫苗的细胞免疫应答与体液免疫应答水平，使用范围包括鸡灭活疫苗、基因工程疫苗和减毒活疫苗。
【专利说明】
一种鸡疫苗用免疫増强剂
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体来说涉及一种鸡疫苗用免疫增强剂。
【背景技术】
[0002] 疫苗免疫一般是防治畜禽传染病最重要最简单，也是最有效的手段之一，并且疫 苗免疫的效果会对免疫工作及后续的患病产生直接的影响。如果一些动物在免疫疫苗后， 没有超过免疫时间段就出现了传染病，那么此次免疫就未成功。有疫苗本身的质量问题，也 有免疫操作不当等问题，免疫失败是有多方面因素所造成的。但科学有效的进行免疫，以及 将疫苗的效果达到最佳状态，增强疫苗的免疫功能至关重要。
[0003] 自1925年Ramon首先发现在疫苗中加入某种其他物质(琼脂、金属盐、卵磷脂和皂 甙)可以提高抗原的特异性免疫应答以来，如今各种不同的物质被用作免疫佐剂或免疫增 强剂。免疫佐剂或免疫增强剂就是指先于抗原或与抗原同时应用，能改变或增强机体对该 抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原 性的物质。对于许多种传染病，由于没有合适的免疫佐剂而影响了菌苗、毒苗、重组蛋白、多 肽和DNA疫苗等的发展。因此，传染病的防控除了研发出高效低毒的疫苗外，免疫佐剂的研 发也起着至关重要的作用。
[0004] 理想化的疫苗免疫增强剂的特点是在促进保护性免疫应答上与疫苗原有相加作 用;能有效地激发较强的细胞免疫应答、黏膜免疫等;安全，毒副作用小;佐剂的结构和成分 以及生物学特性稳定，易于在体内降解和清除；适应性广、易于存贮。目前市场上鸡用疫苗 免疫佐剂主要为油乳剂，存在注射局部脓肿、结节、溃殇的形成而导致急性或慢性炎症反应 等问题，且诱导机体细胞免疫应答效果不确定。
[0005] 二十多年来，各国学者在将细胞因子作为疫苗佐剂方面，作了许多深入的探索，并 得到很多振奋人心的结果:细胞因子能在不同程度上增加常规疫苗，包括灭活苗、弱毒苗、 亚单位疫苗，以及核酸疫苗的免疫效应:①可显著加强疫苗的抗体阳转率;②可明显提高机 体内的中和抗体滴度;③缩短了抗体的产生时间；④增强细胞免疫应答。在人干扰素应用 中，干扰素已常规做为狂犬病病毒疫苗免疫佐剂并得到广泛使用:在狂犬病毒免疫应答过 程中，患者体内不但有体液免疫参加，而且有细胞的介导免疫应答参与。当狂犬病病毒进入 机体以后，除主要侵害神经系统外，对淋巴组织也有较明显的影响，尤其是T淋巴细胞，而对 B淋巴细胞影响较小。这与一些中和抗体水平不低的狂犬病患者未能免于死亡的现象相吻 合。因此，在紧急防治狂犬病时，不仅要考虑提高特异性中和抗体水平，而且要设法改善特 异性细胞免疫应答功能。卫生部从1993至1996年期间，将干扰素-α做为佐剂与狂犬病疫苗 联合应用做了大量临床试验:对13000多例狂犬病疫苗的预防注射增加了1剂IFN-α，均未发 现疫苗免疫失败病例。在4起狂犬集中咬伤事件中，33例首针注射疫苗时增加1剂IFN-a，无 一失败病例，而常规注射疫苗的10例中有4例发病死亡。从此，人注射狂犬病疫苗时，首针注 射同时增加1剂IFN-a做为佐剂。
[0006] 在兽医领域，细胞因子做为疫苗免疫佐剂的应用已逐渐受到重视，本发明研制的 一种新型鸡疫苗用免疫增强剂，是鸡基因工程细胞因子复合物。鸡基因工程细胞因子复合 物配方为重组鸡干扰素 α 30%~80%、重组鸡干扰素 γ 10%~40%、重组鸡IL-2 10%~40%。在疫 苗使用中添加，添加量为疫苗的1~30%，能有效地提高鸡疫苗的细胞免疫应答与体液免疫应 答水平;使用范围包括鸡灭活疫苗、基因工程疫苗和减毒活疫苗。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种新型鸡疫苗用免疫增强剂，利用鸡基因工程细胞因子 复合物来作为疫苗免疫佐剂，该免疫增强剂适用范围广，能有效地提高体内细胞免疫应答 水平。具体来说，本发明采用了以下技术方案。
[0008] -种鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强剂由鸡基因工程 细胞因子复合物按合适比例配伍组合而成，所述鸡基因工程细胞因子复合物包括重组鸡干 扰素 α、重组鸡干扰素 γ和重组鸡IL-2,该三种鸡基因工程细胞因子在复合物中的比例按重 量计为重组鸡干扰素 α 30%~80%、重组鸡干扰素 γ 10%~40%、重组鸡IL-2 10%~40%。
[0009] 优选地，所述鸡疫苗用免疫增强剂在疫苗制剂中的用量，按所述细胞因子复合物 中三种重组细胞因子的总量与疫苗的重量计，细胞因子复合物中三种重组细胞因子总重量 为疫苗重量的1~30%。
[0010] 在以上方案中，所述鸡疫苗用免疫增强剂中的重组鸡干扰素 α係如序列表中的序 列1所述。
[0011] 进一步，所述鸡疫苗用免疫增强剂中的重组鸡干扰素 γ係如序列表中的序列2所 述。
[0012]另外，所述鸡疫苗用免疫增强剂中的重组鸡IL-2係如序列表中的序列3所述。
[0013] 进一步，所述鸡疫苗用免疫增强剂是制备成水溶性制剂。
[0014] 优选地，所述鸡疫苗用免疫增强剂是可以水复原的冻干剂，所述冻干剂中除三种 重组细胞因子外，还包含适量冻干保护剂，所述冻干保护剂包含脱脂奶粉、葡萄糖和血清白 蛋白。
[0015] 本发明的目的在于提供一种新型鸡疫苗用免疫增强剂，是鸡基因工程细胞因子复 合物，配方为重组鸡干扰素 α 30%~80%、重组鸡干扰素 γ 10%~40%、重组鸡IL-2 10%~40%。本 发明的积极意义在于： 1.可提高鸡疫苗的体液免疫应答水平:本免疫增强剂在鸡疫苗使用中添加，添加量为 疫苗的1~30%，免疫鸡翅静脉采血检测发现疫苗保护期中和抗体水平可提高2~4倍，中和抗 体产生窗口期缩短30~50%，体液免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗可提高1~3倍。
[0016] 2.可提高鸡疫苗的细胞免疫应答水平:本免疫增强剂在鸡疫苗使用中添加，添加 量为疫苗的1~30%，细胞免疫应答标志物⑶3+数以及⑶47⑶8+Τ淋巴细胞比例较单独应用疫 苗提尚。
[0017] 3.安全性好，可制备成水溶性，解决了目前市场上鸡用疫苗免疫佐剂存在注射局 部脓肿、结节、溃殇的形成而导致急性或慢性炎症反应等问题。
[0018] 4.体内无残留，本免疫增强剂均为重组细胞因子蛋白质，正常鸡体内亦含有，使用 无任何残留无副作用。
【附图说明】
[0019] 图1新型鸡疫苗用免疫增强剂提高鸡新城疫疫苗免疫鸡中和抗体水平； 图2新型鸡疫苗用免疫增强剂提高鸡新城疫疫苗免疫鸡IL-4分泌水平。
【具体实施方式】
[0020] 本发明公开了一种新型鸡疫苗用免疫增强剂，该免疫增强剂由鸡基因工程细胞因 子复合物按合适比例配伍组合而成，在鸡免疫的时候作为免疫佐剂与疫苗制剂配伍使用。
[0021] 在上述鸡疫苗用免疫增强剂中，鸡基因工程细胞因子复合物为重组鸡干扰素 α 30%~80%、重组鸡干扰素 γ 10%~40%、重组鸡IL-2 10%~40%，所述免疫增强剂在疫苗使用中 添加，添加量为疫苗的1~30%。该鸡疫苗用免疫增强剂能有效地提高鸡疫苗的体液免疫应答 与细胞免疫应答水平，能够提高鸡疫苗的体液免疫应答水平，包括疫苗保护期中和抗体水 平较单独应用疫苗可提高2~4倍，中和抗体产生窗口期较单独应用疫苗可缩短30~50%，体液 免疫应答标志物IL-4分泌量较单独应用疫苗可提高1~3倍，并且还能够提高鸡疫苗的细胞 免疫应答水平，细胞免疫应答标志物CD3+数以及CD4+/CD8+T淋巴细胞比例较单独应用疫苗 提尚。
[0022]下面将结合具体实施例来进一步对本发明进行说明。
[0023] 1.新型鸡疫苗用免疫增强剂的研制 1.1重组鸡干扰素 α、重组鸡干扰素 γ、重组鸡IL-2的制备 首先进行重组鸡干扰素 α、重组鸡干扰素 γ和重组鸡IL-2的生产:构建含如序列表中所 述的序列1重组鸡干扰素 α目的基因、序列2重组鸡干扰素 γ目的基因和序列3重组鸡IL-2目 的基因的工程大肠杆菌，然后进行工程菌发酵，收获期收获菌液，破碎，离心菌液取含目的 蛋白的上清，进行蛋白纯化，进行中间品检验，或者一定浓度的目的蛋白溶液。
[0024] 1.2重组细胞因子复合物的制备 将经过检验的上述蛋白溶液的浓度进行调整，分别配制lmg/ml的重组鸡干扰素 α溶液、 lmg/ml的重组鸡干扰素 γ溶液和lmg/ml的重组鸡IL-2溶液，根据需要的比例按比例混合， 混合后重组鸡干扰素 α占30%~80%、重组鸡干扰素 γ占10%~40%、重组鸡IL-2占10%~40%。在一 个优选实施例中，混合比例为重组鸡干扰素 α溶液:重组鸡干扰素 γ溶液:重组鸡IL-2溶液= 2 ： 1.5 ： 1 〇
[0025] 1.3 冻干 对于如上所述获得的复合物，进行冻干以获得冻干的免疫增强剂制剂。向如上所述获 得复合物溶液中，加入终浓度含5 %脱脂奶粉、5 %GS(葡萄糖)和10 %血清白蛋白作为冻干 保护剂（以上浓度均为重量/体积比mg/100ml)，混匀后，置于冻干机冻干。冻干缩减体积的 制剂进行灌装，每支2ml，内含2mg的重组鸡干扰素 α、2mg重组鸡干扰素 γ、2mg重组鸡IL-2。
[0026] 2、鸡疫苗用免疫增强剂提高鸡新城疫病毒灭活疫苗免疫效果 2.1实验动物分组 将30只20日龄健康肉仔鸡，随机分为3组，每组10只：（1)新型鸡疫苗用免疫增强剂+鸡 新城疫疫苗组；（2)单独鸡新城疫疫苗对照组；（3)正常鸡对照组。
[0027] 2.2样品采集 免疫后1~6周，每周每只翅静脉采血lml，3000r/min离心去上清分离血清检测血清中中 和抗体水平和细胞因子IL-4分泌水平，分离外周血单个核细胞检测T淋巴细胞亚群。
[0028] 2.3结果 2.3.1中和抗体水平检测结果 新型鸡疫苗用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组较单独鸡新城疫疫苗组中和抗体水平产生 至少提前7d，窗口期缩短50%。新型鸡疫苗用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组达到平台期中和 抗体水平是单独鸡新城疫疫苗组3.5倍，且平台期维持时间较单独鸡新城疫疫苗组长，新型 鸡疫苗用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组到第35d中和抗体水平未出现降低，而单独鸡新城疫 疫苗组到第28d后可观察到中和抗体水平开始降低（图1)。
[0029] 2.3.2 IL-4分泌水平检测结果 采用ELISA试剂盒(购自Biorbyt公司)检测血清中IL-4水平。新型鸡疫苗用免疫增强剂 +鸡新城疫疫苗组鸡IL-4分泌水平在第7天、第10天时达到单独鸡新城疫疫苗组的两倍，新 型鸡疫苗用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组第14、21天IL-4分泌水平亦高于单独疫苗组（图 2) 〇
[0030] 2.3.3 T淋巴细胞亚群检测结果 接种疫苗后第28d采血进行流式细胞检测(试剂盒购自Lifespan公司）。本发明鸡疫苗 用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组的CD4+T淋巴细胞含量以及CD4+/CD8+均高于单独鸡新城疫 疫苗组，提示本发明鸡疫苗用免疫增强剂+鸡新城疫疫苗组细胞免疫水平较单独鸡新城疫 疫苗组强(表1)。
[0031] 表1新型鸡疫苗用免疫增强剂提高鸡新城疫疫苗免疫鸡外周血CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴细胞亚群检测结果。
L0032」上面结合具体实施例和附图对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不 限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离 本发明宗旨的前提下做出各种变化。
[0033] 序列表说明： 序列1:重组鸡干扰素 α;序列2:重组鸡干扰素 γ ;序列3:重组鸡IL-2。
[0034] 序列表 〈110>安徽九川生物科技有限公司 〈120> -种鸡疫苗用免疫增强剂 <130> 2016 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 531 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc accttctctc acgacagcct ccagctcctc 60 cgggacatgg ctcccacact accccagctg tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc 120 aacgacacca tcctggacac cagcaacacc cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc 180 cttcagcacc tcttcacaat cctcagcagc cccagcactc cagcccactg gaacgacagc 240 caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg 300 gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga tggcctcgca accttcacct caccatcaaa 360 aaacacttca gctgcctcca caccttcctc caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg 420 gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac 480 acgcgcacta agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg a 531 <210> 2 <211> 495 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 atgacttgcc agacttacaa cttgtttgtt ctgtctgtca tcatgattta ttatggacat 60 actgcaagta gtctaaatct tgttcaactt caagatgata tagacaaact gaaagctgac 120 tttaactcaa gtcattcaga tgtagctgac ggtggaccta ttattgtaga gaaactgaag 180 aactggacag agagaaatga gaaaaggatc atactgagcc agattgtttc gatgtacttg 240 gaaatgcttg aaaacactga caagtcaaag ccgcacatca aacacatatc tgaggagctc 300 tatactctga aaaacaacct tcctgatggc gtgaagaagg tgaaagatat catggacctg 360 gccaagctcc cgatgaacga cttgagaatc cagcgcaaag ccgcgaatga actcttcagc 420 atcttacaga agctggtgga tcctccgagt ttcaaaagga aaaggagcca gtctcagagg 480 agatgcaatt gctaa 495 <210> 3 <211> 432 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 3 atgatgtgca aagtactgat ctttggctgt atttcggtag caatgctaat gactacagct 60 tatggagcat ctctatcatc agcaaaaagg aaacctcttc aaacattaat aaaggattta 120 gaaatattgg aaaatatcaa gaacaagatt catctcgagc tctacacccc aactgagacc 180 caggagtgca cccagcaaac tctgcagtgt tacctgggag aagtggttac tctgaagaaa 240 gaaactgaag atgacactga aattaaagaa gaatttgtaa ctgctattca aaatatcgaa 300 aagaacctca agagtcttac gggtctaaat cacaccggaa gtgaatgcaa gatctgtgga 360 gctaacaaca agaaaaaatt tcctgatttt ctccatgaac tgaccaactt tgtgagatat 420 ctgcaaaaat aa 432
【主权项】
1. 一种鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强剂由鸡基因工程细 胞因子复合物按合适比例配伍组合而成，所述鸡基因工程细胞因子复合物包括重组鸡干扰 素 α、重组鸡干扰素 γ和重组鸡IL-2,该三种鸡基因工程细胞因子在复合物中的比例按重量 计为重组鸡干扰素 α 30%~80%、重组鸡干扰素 γ 10%~40%、重组鸡IL-2 10%~40%。2. 如权利要求1所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强剂在 疫苗制剂中的用量，按所述细胞因子复合物与疫苗的重量计，细胞因子复合物重量为疫苗 重量的1~30%。3. 如权利要求1或2所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强 剂中的重组鸡干扰素 α係如序列表中的序列1所述。4. 如权利要求1或2所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强 剂中的重组鸡干扰素 γ係如序列表中的序列2所述。5. 如权利要求1或2所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强 剂中的重组鸡IL-2係如序列表中的序列3所述。6. 如权利要求1所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强剂是 制备成水溶性制剂。7. 如权利要求6所述的鸡疫苗用免疫增强剂，其特征在于，所述鸡疫苗用免疫增强剂的 制剂是可以水复原的冻干剂，所述冻干剂中除三种重组细胞因子外，还包含适量冻干保护 剂，所述冻干保护剂包含脱脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白。
【文档编号】A61K39/39GK105944096SQ201610293284
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王明丽, 赵俊, 赵雨, 査映丽, 符修乐, 周炜, 戚仕梅, 李树启, 高耀辉, 赖鹏飞, 汪良青, 马腾飞, 王利利, 甘霖
【申请人】安徽九川生物科技有限公司