氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用图
【专利摘要】本发明公开了氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中氯福克酚是一种治疗上呼吸道感染药物，其相对于人神经胶质瘤细胞及人正常星形胶质细胞、人胚肾细胞，人神经干细胞，可显著特异性抑制胶质瘤干细胞活性，且经氯福克酚处理后胶质瘤干细胞的自我更新、肿瘤球形成、裸鼠体内成瘤能力也明显降低。体内实验，利用斑马鱼胶质瘤移植瘤模型、裸鼠胶质瘤移植瘤模型，在体验证该药物对胶质瘤的治疗效果。具体而言，本发明发现用于治疗上呼吸道感染药物——氯福克酚可通过靶向性抑制胶质瘤干细胞达到用于制备治疗人神经胶质瘤的药物目的。本发明为人神经胶质瘤的治疗提供了新的治疗药物。
【专利说明】
氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物 的用途。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤是最常见的来源于神经上皮的原发性颅内恶性肿瘤，其恶性程度高、 生长迅速、浸润性强，具有高发病率的特点。虽然目前肿瘤综合治疗技术已取得长足进步， 但因其位于脑部重要位置，且伴随微血管增生，呈现明显的浸润性生长等特点，传统的手 术、放疗都无法彻底根治，而导致其复发率高、病死率高和治愈率低。目前临床上化疗的药 物以烷基化药物为主，但传统烷化剂副作用大，易产生耐药性；新型烷化剂替莫唑胺 (temozo I omi de，TMZ)虽毒副作用小，且长时间用药耐受性好，但TMZ治疗后引起的骨髓增生 异常综合征（my elodysplastic syndrome，MDS)、急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML)以及急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的报 道与日倶增，具体原因也在进一步研究中。因此，寻找新一代治疗神经胶质瘤的有效药物， 改善神经胶质瘤的治疗迫在眉睫。
[0003] 近年来，科学家们结合胶质瘤的发生发展的机理，在其新药探索与开发方面做出 了诸多努力。研究显示，神经胶质瘤的发生发展主要与RTK/RAS/PI3K通路，p53通路，RB通路 中的相应关键分子的异常表达或突变相关。因而近年来的研究都在开发相应的药物分子的 抑制剂用以抵消某种关键分子的作用效果，但都只是在临床前研究结果中表现出强的治疗 前景，在I、Π 期临床结果，或是批准上市后表现得不尽人意或疗效颇微。如EGFR的抑制剂： 吉非替尼和埃罗替尼被证实患者服用后极易产生耐药，而且有疗效的患者非常罕见，并且 病人服用之后无进展生存期皆未有所延长。同时EGFR/Her2抑制剂拉帕替尼，EGFR的单克隆 抗体西妥昔单抗都被证实对胶质瘤的治疗效果颇微;除此以外还有mTOR相关抑制剂:雷帕 霉素、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司，脱乙酰酶(Histone deactyIase，HDAC)抑制剂:伏 立诺他等单独治疗或与替莫唑胺联合治疗都被证实没有或只有极小的作用效果。与此同 时，研究还针对胶质瘤微血管形成丰富的特点，开发了被证实有部分效果的抗血管生成的 分子如贝伐单抗、西地尼布，它们可以快速的减少癌旁水肿，有效的延长了患者的无进展生 存期，但是也无法逆转病程的进展。接受抗血管疗法的患者最终也无法成功治愈，还是无法 改变大多数患者在诊断后数月死亡的现状。总体而言，尽管国内外科学家，药物公司在胶质 瘤的新药探索中付出诸多人力物力，目前都没有找到一种新的，有效的药物分子。由于胶质 瘤复杂的发病机制，目前我们尚不知道在不同发病机理导致的胶质瘤患者中哪个关键分子 需要被抑制。此外，另一些科学家提出，胶质瘤组织内细胞存在异质性，以上探索的药物分 子之所以结果颇微，可能与我们没有针对对胶质瘤的发生、发展起到重要作用的细胞类型 有关。
[0004] 1994年，Lapidot等从白血病患者身上首次分离获得肿瘤干细胞，肿瘤干细胞理论 逐渐被接受。随后Singh等在胶质瘤中分离得到极少数具有自我更新及分化能力的CD133+ 胶质瘤干细胞，且其相对于CD133_的细胞具有更强的体内成瘤能力，仅100个细胞就可在裸 鼠内诱导形成肿瘤。Jian Chen等通过细胞体内示踪技术，从在体的水平，证明了胶质瘤干 细胞的存在。随着研究的深入，胶质瘤干细胞的特点性质，以及与胶质瘤的关系逐渐被揭 示。研究表明胶质瘤干细胞是胶质瘤发生发展的根本原因，且胶质瘤干细胞可通过激活Wnt 信号通路诱导肿瘤血管形成，增强肿瘤的低氧应激以及侵袭能力等。不仅如此，Bao等证实 胶质瘤干细胞也能产生放化疗抗性。然而，目前神经胶质瘤的化疗药物只针对整个肿瘤组 织，病人在接受一段时间的治疗后，肿瘤组织缩小取得一定的效果，但是对化疗产生抵抗的 胶质瘤干细胞可通过增殖和分化进一步形成新的肿瘤组织，从而促使肿瘤复发。由此可见， 胶质瘤干细胞与胶质瘤的发生发展，及放化疗抗性的形成，肿瘤的复发息息相关，是胶质瘤 难以攻克的一个重要因素。因此，我们设想，是否可以通过获得靶向性胶质瘤干细胞的药 物，并结合传统的放化疗，达到最终彻底消灭整个肿瘤组织的目的。
[0005] 近几年，国内外科学家分别在不同肿瘤中报道了几种能靶向肿瘤干细胞的药物， 其中包括一些新的药物分子和已在临床上使用的药物分子。如天然的多酚白藜芦醇，具有 抗菌活性的离子载体盐霉素，衣霉素，灭绦虫活性的药物氯硝柳胺，以及用以治疗糖尿病的 药物二甲双胍及用以治疗肝癌的药物索拉非尼，都利用裸鼠成瘤模型，验证了药物相对于 目前的一线药物TMZ更具抑瘤效果。但是以上药物都无法在保证安全性的前提下，发挥靶向 肿瘤干细胞的功能，因而效果有限。
[0006] 氯福克酚是一种抗菌药物，主要用于治疗有革兰氏阳性菌引起的上呼吸道，耳， 鼻，喉的感染。目前，主要用于法国和意大利，其首先法国在1980年期间批准上市。该要对革 兰氏阳性菌的抑制可能是通过抑制胞壁质的合成、影响能量代谢实现的，但它不影响DNA、 RNA及蛋白的合成。而革兰氏阴性菌对氯福克酚的抵抗可能是由于其不能通过革兰氏阴性 菌外膜的原因。其给药方式为口服及直肠栓剂（1.5g/人，每日，主要给药方式)置肛给药的 方式。临床观察结果显示，该药物的副作用不大，但在该药物使用过程中，部分患者会出现 斑状丘疹或直肠扩张等副作用。目前对于氯福克酚的报道，主要集中于其对革兰氏阳性菌 的抑制，及在上呼吸道感染后的治疗。而在2014年有一篇文献由苏州大学和约翰霍普金斯 医学院合作的文章报道了氯福克酚可以通过诱导细胞内质网应激、抑制细胞蛋白翻译及细 胞周期阻滞等发挥对前列腺癌的抑制作用，如此揭示了氯福克酚的抑瘤作用。
[0007] 本发明发现相对于胶质瘤细胞株、人正常星形胶质细胞株、人胚肾细胞，人神经干 细胞，氯福克酚在细胞水平对实验室分离得到的四株胶质瘤干细胞株具有特异性抑制效 果。在此基础上，本发明从细胞水平验证了氯福克酚可特异性抑制胶质瘤干细胞的自我更 新能力，肿瘤球形成能力;并通过斑马鱼、裸鼠胶质瘤移植模型验证了氯福克酚对胶质瘤的 治疗效果。由此，氯福克酚将很有可能成为神经胶质瘤的治疗提供新的有力治疗药物。
【发明内容】
[0008] 基于上述目的，本发明提供了一种氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的 用途。
[0009] 在一个具体的实施方案中，所述药物通过抑制胶质瘤干细胞的细胞活性以治疗所 述人神经胶质瘤。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述药物通过抑制胶质瘤干细胞的自我更新、肿瘤球 形成，及体内肿瘤形成的能力以治疗所述人神经胶质瘤。
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述药物通过诱导胶质瘤干细胞凋亡以治疗所述人神 经胶质瘤。
[0012] 在一个可选的实施方案中，所述胶质瘤干细胞包括但不限于：U87MG SLC、 U251SLC、GSC2、GSC5。
[0013] 在一个可选的实施方案中，所述药物还通过抑制胶质瘤细胞以治疗所述人神经胶 质瘤。
[0014] 在一个可选的实施方案中，所述胶质瘤细胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。
[0015] 在一个可选的实施方案中，所述人神经胶质瘤处于I到IV级。
[0016] 术语的定义
[0017] "胶质瘤干细胞"：存在于胶质瘤组织内存在的一类极少数的具有自我更新能力， 多项分化能力，体内成瘤能力的细胞，它与胶质瘤的发生发展，复发以及胶质瘤对放疗化疗 抗性形成密切相关。
[0018] "MTS方法"：一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测 试剂。MTS是一种新型四唑化合物，PMS是一种电子偶联剂。PMS具有增强的化学稳定性，这使 它可与MTS混合形成稳定的溶液。MTS被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶 解于培养基中。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作 用下完成的。在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。
[0019] "相对细胞存活率"：运用据上MTS方法检测吸光度值后，根据吸光值A计算相对细 胞存活率，相对细胞存活率=(实验组A/对照组A) X 100%。
[0020] "自我更新"：指干细胞(此处特指胶质瘤干细胞)通过对称或者不对称分裂产生至 少一个保留干细胞特性子细胞的过程，自我更新能够维持干细胞具有多分化的潜能，对于 组织特异性干细胞而言，自我更新是维持其终生具有分化潜能的基础。
[0021] "肿瘤球形成能力"：指肿瘤干细胞(此处特指胶质瘤干细胞)在体外含EGF，bFGF的 培养基中培养，会形成肿瘤球的能力。
[0022] 综上，本发明发现临床药物氯福克酚可用于制备治疗人神经胶质瘤的药物，从而 为人神经胶质瘤的治疗提供新的有力药物，具有显著的社会效益和经济效益。
【附图说明】
[0023] 图1:氯福克酚特异性抑制胶质瘤干细胞的细胞活性。MTS(四唑化物)方法检测氯 福克酚在不同浓度（〇.3以]?、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\〇下对四株胶质瘤干细胞株(1]87]\?；31^(：、 1]2513^：、6302、6305)，三株胶质瘤细胞株〇]251、1]871?；、似(从病人肿瘤组织分离得到的原 代胶质瘤细胞））、三种人正常细胞株（人正常星形胶质细胞（HA)、人神经干细胞 (Hlp56NSC)、人胚肾细胞(293ET))作用48小时后细胞存活率，"--"表示Ι(^Ι>10 6μΜ。
[0024] 图2Α和图2Β:氯福克酚特异性抑制胶质瘤干细胞。将带由绿色荧光标记的GSC2-GFP(图2Α)或U87MG SLC-GFP(图2Β)与不带荧光标记的HA 1:1混匀于体系中，而后氯福克酚 分别在1以1、3以1、1(^1、3(^1浓度下作用24小时，而后流式细胞仪分析不同处理组下存活细 胞中GSC2-GFP或U87MG SLC-GFP及HA的比例，并结合共培养模型在不同浓度、不同作用时间 下的细胞存活率，统计分析共培养模型中各细胞成分的相对细胞存活率。
[0025]图3A至图3H:氯福克酚抑制胶质瘤干细胞肿瘤球的生长与维持。96孔细胞培养皿 中每孔加入IOOyL含5000个GSC2的单细胞悬浮液，自然生长4天后，吸去原培养基，每孔加入 含各浓度药物的IOOyL新鲜培养基，并使其药物浓度分别为:ΟμΜ(对照，图3A)、0.03μΜ(图 3B)、0·lμM(图3C)、0·3μM(图3D)、lμM(图3E)、3μM(图3F)、10μM(图3G)、30μM(图3H)，药物作 用时间为48小时，利用体外实验模拟临床上胶质瘤干细胞形成肿瘤后检测氯福克酚的抑制 效果。氯福克酚可显著减小肿瘤球的体积、数量，且低浓度(〇.〇3μΜ、0.1μΜ)6302可长出突 起，呈现明显的分化样特征，高浓度下（1〇μΜ、30μΜ)，可使肿瘤球边缘细胞死亡并直至整个 肿瘤球;图3Α至图3Η为光镜下检测形态改变。
[0026]图4:图3Α至图3Η中实验的数据统计结果。
[0027]图5:氯福克酚抑制胶质瘤干细胞的自我更新能力。将GSC5细胞稀释为25、50、100、 200个/100yL，氯福克酚在1以1、3以11、1(^1、3(^1浓度下处理2周，而后统计无肿瘤球孔百分 比，纵坐标表示无肿瘤球孔百分比的对数值。
[0028]图6A和图6B:氯福克酚对胶质瘤干细胞的作用效果一定程度上是不可逆的。药物 处理GSC2 24小时，48小时后分别撤药物，换上新鲜培养基继续培养48小时后利用MTS的方 法检测各处理组细胞存活率，并比较其与一直用药物处理组的细胞活性改变。"1天"、"2天" 表示药物处理24小时或48小时后MTS检测；"药物继续作用"表示药物处理24小时、48小时后 撤药物，并继续加入相应药物浓度的新鲜培养基培养48小时后MTS检测；"撤去药物"表示药 物处理24小时、48小时后撤药物，并加入不含药物的新鲜培养基继续培养48小时后MTS检 测 。
[0029]图7A和图7B:氯福克酚在30μΜ浓度下，可明显抑制其裸鼠原位肿瘤球形成能力。氯 福克酚在30μΜ浓度下对GSC2预处理时间24小时，而后收集活细胞，取部分细胞台盼蓝染色 后细胞计数，细胞颅内成瘤，IO 5个活细胞/只（5只裸鼠），并设置DMSO对照组（5只裸鼠）， DMSO处理组（图7Α)，及氯福克酚预处理组（图7Β)裸鼠原位成瘤后HE染色结果。
[0030] 图8A和图8B:氯福克酚可显著抑制斑马鱼胶质瘤移植瘤模型的肿瘤生长。48小时 斑马鱼胚胎的卵黄囊内注射3000个带有绿色荧光标记的U87MG SLC-GFP，自然生长48小时 后，氯福克酚1〇μΜ浓度下对其治疗48小时（图8B)，荧光显微镜检测斑马鱼卵黄囊部位绿色 荧光的强弱，用以判断氯福克酚对斑马鱼移植瘤模型的抑瘤效果，图8Α为对照组。
[0031] 图9Α至图9C:氯福克酚可显著抑制斑裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长，且副作用较小。 将GSC2细胞接种于15只5周大的Balb/C裸鼠腋下皮下，接种数目为IO 5个/只，当裸鼠皮下肿 瘤长至约IOOmm3，将其分为DMSO组、及氯福克酚药物给药组，给药剂量为20mg/kg，腹腔注射 给药，给药时间为11天，期间记录两组裸鼠肿瘤的体积（图9A和图9B)及体重（图9C)变化。
[0032] 图10A-1至图10A-5:氯福克酚可诱导胶质瘤干细胞凋亡。氯福克酚在ΟμΜ(对照，图 IOA-1)、ΙμΜ(图 10Α-2)、3μΜ(图 10Α-3)、1 ΟμΜ(图 10Α-4)、30μΜ(图 10Α-5)浓度下处理GSC2 12 小时后，AnnexinV/PI双染，流式分析各处理组内细胞的凋亡情况，图10Α-1至图10Α-5中 (门：P2)发现氯福克酚可明显诱导胶质瘤干细胞的凋亡。
[0033] 图10B-1至图10B-5:氯福克酚可诱导胶质瘤干细胞凋亡。氯福克酚在ΟμΜ(对照，图 10Α-1)、1μΜ(图 10Α-2)、3μΜ(图 10Α-3)、10μΜ(图 10Α-4)、30μΜ(图 10Α-5)浓度下处理 24 小时 后，AnnexinV/PI双染，流式分析各处理组内细胞的凋亡情况，图10Β-1至图10Β-5中（门： P2)发现氯福克酚可明显诱导胶质瘤干细胞的凋亡。
【具体实施方式】
[0034] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0035] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。
[0036] 实施例1:MTS法检测细胞存活率
[0037] (1)按照产品说明书配制以下溶液：
[0038] a、DPBS:依次加入0 · 2gKCl，8 · OgNaCl，0 · 2gKH2P〇4，1 · 15gNa2HP〇4至IL，调pH至 7.35，之后加入0.1 gMgCl2.6H20,充分混匀至溶液清澈后，加入0.133gCaCl2.2H 20后，在此充 分混匀至溶液清澈。用0.2μΜ滤器过滤除菌两次后，分装保存在4°C ;
[0039] b、PMS溶液的配制：使用DPBS配制0.92mg/mL的PMS溶液，用0.2μΜ滤器过滤除菌两 次后，分装于用锡泊纸包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0040] c、MTS溶液的配制:按照Img MTS粉末用0.5mL DPBS来溶解的比例配制，轻轻混匀， 约15min，至MTS完全溶解。测量pH，使其保存在6.0-6.5之间。用0.2μΜ滤器过滤除菌两次后， 分装于用锡泊纸包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0041 ] d、MTS/PMS溶液的配制：分别融化MTS和PMS，37°C孵育15min，之后按照4 · 2mg MTS 粉末溶于2. ImL DPBS中，使用时加入0.1 mL PMS的比例来配制。
[0042] (2)对于氯福克酚对胶质瘤干细胞细胞活性的影响检测，实验用96孔细胞培养板 用100ug/mL多聚赖氨酸包被过夜，次日生理盐水洗两遍，晾干后待用。将细胞消化后重悬为 单细胞悬液，细胞计数，铺于96孔细胞培养板内（U87MG SLC(5000个/孔）、U251SLC(10000 个/孔）、GSC2(10000个/孔）、GSC5(10000个/孔）），生长过夜。次日加入氯福克酚(购自美国 MicroSource公司），其化学式如式I所不，氯福克酸化学分子式为C21H26CI2O,结构简式为 <：1。1。。（<：1)。。。1(：。2。。（。。。20)(：((：)((：)(：(：((：)((：)(：，其系统名称为2-[(2,4-dichlorophenyl )methyl ]_4_(2，4，4_trimethylpentan-2-yl )phenol。并设置如下浓度梯 度:0.3μΜ、ΙμΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ，每个药物浓度3个复孔，作用48小时。
[0043]
[0044] (3)对于三株胶质瘤细胞株(U251 (购自美国ATCC)、U87MG(购自美国ATCC)、Ν3(从 病人肿瘤组织分离得到的原代胶质瘤细胞，获赠于天坛医院江涛老师实验室））、三种人正 常细胞株(人正常星形胶质细胞(ΗΑ，购自美国ATCC)、人神经干细胞(Hlp56NSC，本实验室建 立的细胞株）、人胚肾细胞(293ET，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心））则无需 包被实验用96孔细胞进行包被。其细胞铺板浓度均为:5000个/孔。其它操作如上。
[0045] (4)氯福克酚作用48小时后，根据需要配制相应体积的MTS/PMS检测液，然后按照 检测液:培养基=1:5的比例加入无血清培养基。最终每孔体系120yL，37°C，5%C02孵育2小 时。根据MTS还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱，在吸收峰490nm读取数据。并减去630nm 所读取的数据，用以减去细胞碎片等造成的噪音值，以及其它非特异性吸光度值。
[0046] (5)根据吸光值A计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组A/对照组）X 100%。计算 IC50值，并绘制剂量反应曲线。
[0047] 结果见图1，氯福克酚特异性抑制胶质瘤干细胞的细胞活性。
[0048]实施例2:真核细胞慢病毒感染
[0049] 具体步骤如下：
[0050] (1)感染前将GSC2、U87MG SLC、HA细胞消化为单细胞悬液，计数后以相应密度（1-3 X IO5个/mL)接种于6孔细胞培养板内，体系为2mL，让GSC2、U87MG SLC自然生长2小时，HA细 胞自然生长直至细胞贴壁(大约4小时）；
[0051] (2)分别往GSC2细胞培养基中加入带有绿色荧光的含LV3载体(带嘌呤霉素筛选标 记），往U87MG SLC细胞培养基中加入带有绿色荧光的含pLenti6载体带杀稻瘟素 (Blasticidin)筛选标记，购自Promega公司）的慢病毒2yL，往HA细胞培养基中加入带有红 色荧光的慢病毒(不带筛选标记)2yL，充分混匀，过夜培养；
[0052] (3)次日上午，移去含病毒培养基，各加入新鲜培养基2mL，让其自然生长；
[0053] (4)48小时~72小时，荧光显微镜下观察细胞，检测是否有相应荧光表达，以确定 是否感染成功；
[0054] (5)确定有荧光表达后，用相应浓度的杀稻瘟素筛选稳定表达绿色荧光的U87MG SLC细胞，用相应浓度的嘌呤霉素筛选稳定表达绿色荧光的GSC2细胞，并通过挑选单克隆的 方法筛选稳定表达红色荧光的HA细胞。
[0055]实施例3:流式细胞分析
[0056] 预先用lOOyg/mL的多聚赖氨酸包被6孔及96孔细胞培养板，37°C过夜，生理盐水洗 两遍，晾干。将稳定表达绿色荧光的GSC2-GFP细胞及稳定表达红色荧光的HA细胞，消化为单 细胞，新鲜培养基重悬，细胞计数，均稀释为5 X IO4个/mL，两种细胞1:1充分混匀，分为五 管，分别加入氯福克酚，混匀，使其浓度分别为ΟμΜ、1μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ。分别加入6孔细胞 培养板(2mL)及96孔细胞培养板（100yL，每组3个复孔），分别待其作用24小时，MTS方法检测 96孔细胞培养板中各处理组细胞活性，并分别收集6孔细胞培养板中细胞，PBS洗两遍，各用 IOOyL重悬细胞，流式分析各处理组活细胞中GSC2-GFP、HA-RFP所占比例。并结合共培养模 型经药物处理后细胞活性变化，统计分析共培养模型中各细胞成分的相对细胞存活率。共 培养模型--U87MG SLC-GFP+HA-RFP的操作如上；
[0057]结果见图2A、图2B，相对于人正常星形胶质细胞，氯福克酚可特异性的抑制共培养 模型中胶质瘤干细胞的细胞活性。
[0058]实施例4:肿瘤球形成实验
[0059] 96孔细胞培养皿包被后每孔加入IOOyL含5000个GSC2单细胞悬浮液，自然生长4天 后，吸去原培养基，每孔加入各浓度氯福克酚的IOOyL新鲜培养基，药物浓度分别为:0.03μ Μ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ，药物作用时间为处理48小时后镜下观察各处理组肿 瘤球的形态变化，并同时统计各处理组肿瘤球数目；
[0060]结果见图3Α至图3Η和图4,利用该体外实验模拟临床上胶质瘤干细胞形成肿瘤后 检测氯福克酚的抑制效果，发现氯福克酚可显著减小肿瘤球的体积、数量，且低浓度(0.03μ M、0. lyM)GSC2可长出突起，呈现明显的分化样特征，高浓度下（10μΜ、30μΜ)，可使肿瘤球边 缘细胞死亡并直至整个肿瘤球。
[0061]实施例5:有限稀释实验 [0062] 步骤如下：
[0063] (1)将悬浮培养的GSC5肿瘤球细胞收集到15mL离心管中，加入0.5mL ACCUTASE酶 (购自sigma公司）37°C消化5mins，将细胞吹成单细胞，离心去上清；
[0064] (2)加入新鲜的Neurobasal培养基(购自gibco公司），并取部分细胞台盼蓝染色后 细胞计数；
[0065] (3)计算所需细胞液的体积，设置细胞浓度梯度，200，100，50，25个/孔，每种浓度 设置10个重复孔。设置DMSO对照组，及氯福克酚ΟμΜ、1μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ药物处理组；
[0066] (4)将细胞接种于96孔板中，IOOyL/孔，37°C，5%C02，孵箱中培养，2周后统计无肿 瘤球孔的比例；
[0067] 结果见图5,氯福克酚在1μΜ、3μΜ、10μΜ浓度下可显著抑制胶质瘤干细胞克隆形成， 即能明显抑制胶质瘤干细胞的自我更新能力。
[0068]实施例6:回复试验(Recovery assay)
[0069] (1)用100ug/mL多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板
[0070] (2 )ACCUTASE酶将GSC5消化为单细胞，新鲜Neurobasal培养基重悬，将细胞铺于预 先包被的96孔细胞培养板，过夜；
[0071] (3)加入氯福克酚，使其浓度为0.03以]?、0.1以]\1、0.3以]\1、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1，每个浓 度9个复孔；
[0072] (4)作用24小时后，往每个浓度的3个复孔中加入20yL MTS/PMS混合试剂，检测其 细胞活性。吸去其它6个复孔加药培养基，往其中3个孔中加入新鲜培养基，另外3个复孔中 加入相同浓度的含氯福克酚培养基；
[0073] (5)继续培养48小时后，MTS检测细胞活性。
[0074]药物作用48小时，而后检测恢复48小时的情况，操作如上。
[0075]结果见图6A和图6B，氯福克酚对胶质瘤干细胞的作用效果一定程度上是不可逆 的。
[0076]实施例7:裸鼠原位成瘤
[0077] 收集经氯福克酚30μΜ度下预处理24小时后细胞，PBS洗两遍，部分细胞台盼蓝染 色，细胞计数。取细胞原位注射于5~7周龄Balb/C裸鼠颅内纹状体，IO5个细胞/只，每组5 只，并设置DMSO对照组。
[0078]结果见表1、图7A和图7B，氯福克酚预处理胶质瘤干细胞GSC2,可显著抑制其裸鼠 原位成瘤能力。
[0079]表 1
L 0081J 实施例8:斑马鱼胶质瘤移植模型给药实验
[0082] 往48小时斑马鱼胚胎的卵黄囊内注射3000个带有绿色荧光标记的U87MG SLC-GFP，让其自然生长48小时，利用荧光显微镜检测斑马鱼体内肿瘤形成情况，而后往斑马鱼 孵化液中加入氯福克酚，使其浓度为1〇μΜ，药物处理48小时，荧光显微镜检测斑马鱼卵黄囊 部位绿色荧光的强弱，用以判断氯福克酚对斑马鱼移植瘤模型体内肿瘤的抑制效果。
[0083]结果见图8Α和图8Β，氯福克酚可显著抑制斑马鱼移植瘤模型体内肿瘤的生长。 [0084] 实施例9:
[0085]裸鼠腋下皮下成瘤:将离心消化后的重悬于PBS的GSC2单细胞接种于15只5周大的 Balb/C裸鼠腋下皮下，接种数目为IO5个/只，记录裸鼠的肿瘤大小(裸鼠肿瘤体积=长*宽2/ 2)，当裸鼠皮下肿瘤长至约IOOmm3时，将其分为DMSO组、及氯福克酚药物给药组，给药剂量 为20mg/kg，腹腔注射给药，给药时间为11天，期间记录两组裸鼠肿瘤的体积及体重变化。 [0086]结果见图9A至9C，氯福克酚可显著抑制斑裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长，且其副作 用较小。
[0087] 实施例10:AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡
[0088] 具体步骤如下；
[0089] (1)氯福克酚在1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1浓度下处理6302 12小时或24小时；
[0090] (2)收集细胞，PBS洗两遍；
[0091] (3)取50yL 1*结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞，使细胞密度约为1*106个/ mL ；
[0092] (4)加入2.5yL FTIC AnnexinV和2.5yL PI;
[0093] (5)避光情况下，室温孵育15min;
[0094] (6)往体系中加入200yLl*结合缓冲液（binding buffer)，各处理管分别过细胞 筛；
[0095] (7)流式细胞仪分析；
[0096] 所用AnnexinV/PI双染试剂盒购自BD pharmingen，产品批号为556547。
[0097] 结果见图10A-1至图10B-5,氯福克酚可诱导胶质瘤干细胞细胞凋亡。
[0098]综上，本发明在细胞水平证实氯福克酚相对于胶质瘤细胞(U251、U87MG、N3(从病 人肿瘤组织分离得到的原代胶质瘤细胞））、人正常星形胶质细胞（HA)、人胚肾细胞 (293ET)，人神经干细胞(H1P56NSC)对实验室分离得到的四株胶质瘤干细胞(U87MG SLC、 1]2513^：、6302、6305)具有明显的特异性抑制效果(48小时作用的1(：5()值为：7.65~10.534 M)。并进一步通过克隆形成实验，肿瘤球抑制实验，原位成瘤实验等证实氯福克酚可明显抑 制胶质瘤干细胞的自我更新，肿瘤球形成及肿瘤形成能力。而后本发明利用斑马鱼胶质瘤 移植瘤模型、裸鼠胶质瘤皮下移植瘤模型，在体水平证明了氯福克酚对胶质瘤的治疗作用。 且本发明发现氯福克酚明显的诱导胶质瘤干细胞细胞凋亡，在一定程度上解释了氯福克酚 发挥对胶质瘤干细胞抑制作用及其发挥对胶质瘤抑瘤效果的机制。
[0099]因此，本发明首次发现临床药物氯福克酚可通过抑制人神经胶质瘤干细胞达到治 疗人神经胶质瘤的目的。众所周知，小分子化合物在体内发挥功能都需倚靠相关的关键基 团，而在此基础上其它基团的改变虽能产生不同的化合物，但也能发挥其目的功能。因此， 任何在此基础上对氯福克酚的修饰，修改后达到与本发明相同效果的研究均用于本发明。
【主权项】
1. 氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途。2. 根据权利要求1所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中所 述药物通过抑制胶质瘤干细胞的细胞活性以治疗所述人神经胶质瘤。3. 根据权利要求1所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中所 述药物通过抑制胶质瘤干细胞的自我更新、肿瘤球形成，及体内肿瘤形成的能力以治疗所 述人神经胶质瘤。4. 根据权利要求1所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中所 述药物通过诱导胶质瘤干细胞凋亡以治疗所述人神经胶质瘤。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的 用途，其中，所述胶质瘤干细胞包括但不限于:U87MG SLC、U251SLC、GSC2、GSC5。6. 根据权利要求1所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中所 述药物还通过抑制胶质瘤细胞以治疗所述人神经胶质瘤。7. 根据权利要求6所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中，所 述胶质瘤细胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。8. 根据权利要求1所述的氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途，其中，所 述人神经胶质瘤处于I到IV级。
【文档编号】A61K31/055GK105943522SQ201610333673
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】彭小忠, 胡艳, 韩为, 强伯勤
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所