奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用
【专利摘要】本发明提供了奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。本发明通过实验发现，口服奥美拉唑对自身免疫性疾病、尤其是自身免疫性疾病导致的炎性损伤具有确切的缓解作用。进一步实验表明，奥美拉唑下调了EAN脾脏中γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素17四种促炎性细胞因子的mRNA水平，同时上调了白介素4和白介素10两种抗炎性细胞因子的mRNA水平。而且在脾单个核细胞培养上清液中，ELISA检测的细胞因子表达谱也有相似的趋势。正是基于以上药理性质，奥美拉唑起到自身免疫性疾病治疗作用，进而支撑其用于制备自身免疫性疾病治疗药物的用途。
【专利说明】
奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。
【背景技术】
[0002]自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。由于其成因在于自身免疫系统，因此此类病症的治疗主要着眼于免疫系统的调节，通常具有较长的疗程。现有技术中依据自身免疫疾病病变位置的不同，治疗方法的侧重点也存在差异，普遍来看，自身免疫疾病的治疗目前主要依赖于免疫抑制剂，最常用的是肾上腺皮质激素类制剂，如:强的松、氢化可的松、地塞米松等，大家往往将其简称“激素” ο如果疗效不佳，还可能用环磷酰胺、氨甲喋呤等所谓细胞毒性药物，这些药物在缓解自身免疫疾病的同时，也影响着免疫系统正常的抵御能力。
[0003]奥美拉唑，5-甲氧基_2-[[ (4-甲氧基-3，5_二甲基-2-吡啶基)甲基]亚磺酰基]_IH-苯并咪唑，为质子栗抑制剂，是一种脂溶性弱碱性药物。现有技术研究发现，奥美拉唑易浓集于酸性环境中，特异性地作用于胃黏膜壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞质内的管状泡上，即胃壁细胞质子栗(H+，K+_ATP酶)所在部位，并转化为亚磺酰胺的活性形式，通过二硫键与质子栗的巯基发生不可逆行的结合，从而抑制H+，K+-ATP酶的活性，阻断胃酸分泌的最后步骤，使壁细胞内的H+不能转运到胃腔中，使胃液中的酸含量大为减少。对基础胃酸和刺激引起的胃酸分泌都有很强的抑制作用。对组胺、五肽胃泌素及刺激迷走神经引起的胃酸分泌有明显的抑制作用，对H2受体拮抗剂不能抑制的由二丁基环腺苷酸引起的胃酸分泌也有强而持久的抑制作用。
[0004]目前的医疗实践中，奥美拉唑主要用于十二指肠溃疡和卓-艾综合征，也可用于胃溃疡和反流性食管炎;静脉注射可用于消化性溃疡急性出血的治疗。现有技术中未见奥美拉唑在自身免疫性疾病中的应用。
【发明内容】
[0005]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用，以解决现有技术中奥美拉唑用途范围较为局限的技术问题。
[0006]本发明要解决的另一技术问题是自身免疫性疾病的治疗效果不佳。
[0007]奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。
[0008]作为优选，所述药物下调体内γ干扰素含量。
[0009]作为优选，所述药物下调体内肿瘤坏死因子α含量。
[0010]作为优选，所述药物下调体内iNOS含量。
[0011]作为优选，所述药物下调体内白介素6的信使RNA表达量。
[0012]作为优选，所述药物下调体内白介素17的信使RNA表达量。
[0013]作为优选，所述药物的剂型是口服剂。
[0014]作为优选，所述自身免疫性疾病是自身免疫性神经炎。
[0015]作为优选，所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病引起的炎症损伤。
[0016]本发明以经典的吉兰-巴雷综合征动物模型，即实验性自身免疫性神经炎(EAN)作为实验环境研究了奥美拉唑对自身免疫性疾病的治疗作用。本发明发现奥美拉唑可下调促炎性细胞因子γ-干扰素、肿瘤坏死因子CU白介素6及白介素17的信使RNA水平，并上调抗炎性细胞因子白介素4和10的信使RNA的水平，从而改善EAN模型中的炎症损伤；同时发现其在哺乳动物中的主要作用器官在于脾脏及坐骨神经。基于以上积极的发现，本发明进一步确定了利用奥美拉唑制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。临床评分及组织病理学检查结果显示，奥美拉唑干预后实验动物坐骨神经炎症细胞浸润和脱髓鞘损伤得到明显缓解，其抗炎效果也改善了免疫器官环境并间接产生神经保护作用，其疗效确切、显著。
【附图说明】
[0017]图1是本发明实施例中奥美拉唑对EAN症状、组织学病理学特征以及炎症细胞浸润的缓解作用实验结果图；其中A部分是临床评分变化图；B部分是发病高峰期临床评分结果；C部分是首发症状出现时间；D部分是临床评估运动缺损曲线的AUC结果图；E部分是临床评分高峰期实验动物坐骨神经横断面HE染色图；F部分是坐骨神经中炎症细胞浸润数目检测结果图；G部分是临床评分高峰期实验动物坐骨神经横断面快蓝染色图；H部分是坐骨神经组织评分结果图。
[0018]图2是本发明实施例中奥美拉唑对淋巴细胞增殖情况和细胞因子表达量的影响图；图中A部分是淋巴细胞数量的化学发光检测结果图；B部分是TNF-α、IL_6、IFN- γ、IL-1a、IL-4以及IL-1O六种细胞因子表达量检测结果图；C?F部分分别是TNF_a、IL_6、IFN- γ、IL-1a、IL-4以及IL-10六种细胞因子mRNA表达水平检测结果图。
[0019]在以上附图中，CMC标记表示对照组实验结果，DMF-P表示奥美拉唑预防组实验结果，DMF-T表示奥美拉唑治疗组实验结果。
【具体实施方式】
[0020]以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0021]以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90至IjllO之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0022]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0023]I材料与方法
[0024]1.1实验动物和分组
[0025]本发明以18只6-8周龄的雄性Lewis大鼠(体重160_190g)作为实验对象。所有大鼠均在温度合适及12小时昼夜循环的环境下饲养7天以适应环境，期间大鼠均可自由获取食物和水。本发明将大鼠随机分为3组(预防组，治疗组，对照组，每组n = 6)。实验共重复3次，结果类似。
[0026]1.2EAN造模及临床功能评估
[0027]本发明将含300微克的溶解后的PO 180-199肽段(10mg/ml; B1-Synthes isCorporat1n)的300微升乳化物注射于动物的双足垫进行造模。首先将肽段溶解于磷酸盐缓冲液中(2毫克每毫升)，然后用含有结核菌素(strain H37RA)的同等体积的完全弗氏佐剂(CFA; D i fco)进行乳化，肽段的终浓度为I毫克每毫升。免疫后，本发明对动物的临床症状进行评分，量化如下:0分正常；I分尾部变软；2分尾部无法抬起;3分体位不能自行纠正;4分共济失调;5分后肢轻度麻痹;6分后肢中度麻痹;7分后肢重度麻痹;8分四肢轻瘫;9分四肢重瘫;10分死亡。
[0028]1.3奥美拉唑处理
[0029]奥美拉唑(97 %纯度)溶于0.08 %的羧甲基纤维素/磷酸盐缓冲液中。预防组于免疫后第一天开始给药，直到免疫后第16天(疾病高峰期)，灌胃给药，剂量为25毫克/公斤体重/天。治疗组给药的剂量与预防组相同，是在出现症状后开始给药，也就是从免疫后第7天到第16天期间给药。对照组灌胃给同样剂量的载体溶液(0.08%的羧甲基纤维素/磷酸盐缓冲液)。
[0030]1.4组织病理学评估
[0031]在发病高峰期(免疫后第16天)取坐骨神经。每组6只大鼠全身麻醉后行心脏灌注，首先用4摄氏度的磷酸盐缓冲液灌注2分钟，然后用4%的多聚甲醛灌注5分钟。快速分离取出坐骨神经置于4 %多聚甲醛中4摄氏度过夜，然后石蜡包埋。
[0032]石錯包块切片(6微米)行HE (So larb1 Science&Technology)和快蓝染色以评估单核细胞浸润及脱髓鞘情况。利用尼康数字显微镜的图像分析技术对HE染色中浸润的炎症细胞数进行计数。随机取5个视野计算每平方毫米范围内的细胞数目(200倍的放大倍数)。所有计数都采用的盲法计数。平均结果表示为细胞数/平方毫米。本发明用组织学评分来评价脱髓鞘的严重程度。每个血管旁的区域都由两名独立的观察者(对于实验分组并不知情)依据如下半定量病理组织学标准进行评分:O分，血管周围区域无炎性细胞浸润和脱髓鞘;I分，血管周围区域轻度的炎性细胞浸润；2分，血管周围区域存在炎性细胞浸润和脱髓鞘;3分，整个切片视野均有炎性细胞浸润和脱髓鞘存在。
[0033]1.5淋巴细胞增殖实验
[0034]像之前描述的一样，利用MTS进行抗原特异的淋巴细胞增殖实验。简单来说，无菌取脾后收集脾单个核细胞。将100微升的密度为2 X 10~6个细胞/毫升的脾单个核细胞的单细胞悬液接种于96孔板。所用培养基为1640完全培养基(含2.05毫摩尔每升的谷氨酰胺，HyClone)，I % (v/v)HEPES溶液(Gibco)，0.I % (ν/ν)β巯基乙醇(Gibco)，I % (ν/ν)丙酮酸钠(Gibco) ,and I % (ν/ν)青霉素/链霉素(Gibco) ,and 10% (ν/ν)胎牛血清(FBS;Gibco)。刚接种时即加入PO 180-199肽段(10yg/ml;B1-Synthesis Corporat1n)刺激细胞或不加。肽段的浓度是按照以往的报道来决定的。在37°C，5%二氧化碳条件下孵育72小时后，在每孔加入20微升的MTS溶液(Promega)，继续孵育4小时。然后用酶标仪(Titertek)读取96孔板在490nm处的吸光光度值。因为已经体内给药，所以本发明没有计算抑制率。所有数据均表示为平均OD值土标准误。每组有4只大鼠进行试验，重复3次。
[0035]1.6ELISA检测细胞因子表达谱
[0036]单个核细胞(2\106个/1111)伴或不伴?0180-199肽段刺激，在37°(:和5%0)2条件下培养72小时后收集上清液。按照说明书应用多因子ELI SA检测试剂盒(QIAGEN)同时对6种细胞因子包括白介素1α、白介素4、白介素6、白介素10、γ干扰素和肿瘤坏死因子α经行半定量检测。检测是重复进行的，结果表示为平均0D值±SEM(n = 4)。
[0037]2实验结果
[0038]2.1奥美拉唑处理组改善EAN的症状、组织学改变和炎症细胞浸润
[0039]奥美拉唑分为两种方式干预EAN(图1)。在预防组中，本发明在免疫后即胃管饲载体或奥美拉唑(25mg/kg/天)。治疗组中则是在免疫后第7天出现首发症状时开始给药。与对照组(CMC)相比，应用临床症状评分的方式，预防组和治疗组均减轻了EAN的症状。预防组的大鼠与对照组相比，在免疫后第6天到第16天均有较好的临床评分(每个时间点，p<0.05)。另外，治疗组临床症状的改善较预防组晚，其在第8天开始临床评分低于对照组，而在免疫后第10天开始评分差异才有统计学意义(每个时间点，p<0.05)。此外预防组、治疗组和对照组三组发病高峰期的得分分别是5.20±0.30，5.67±0.25和7.42±0.15(图1A和B)。预防组延迟了机体损伤后的首发症状(图1A和C)。预防组首发症状出现在第7.83±0.17天，治疗组是第6.33 ± 0.21天，对照组是6.00 ± 0.26天(图1C)。奥美拉唑也减少了临床评估运动缺损曲线的曲线下面积(图1D)。总之，奥美拉唑预防组和治疗组均改善了 ΕΑΝ。
[0040]在EAN评分最高期(即免疫后第16天)，本发明对大鼠的坐骨神经进行了组织病理学评估。应用HE染色评估炎症细胞浸润，应用快蓝染色表示髓鞘脱失。奥美拉唑干预的两组均减少了坐骨神经中炎症细胞的浸润数目(图1E和F)。奥美拉唑干预的两组中脱髓鞘和炎症细胞浸润的发生率均较对照组低(图1G和H)。应用半定量评分评估染色组织后，对照组的平均组织学评分(2.33 ± 0.25)明显高于预防组(1.25±0.17，ρ<0.05)和治疗组(1.33 土
0.25，ρ<0.05)的评分。
[0041]2.6奥美拉唑改善了淋巴细胞增殖活性反应，改变了细胞因子表达谱
[0042]在免疫16天后取EAN大鼠脾脏的单个核细胞体外培养72小时，伴或不伴Ρ0180-199肽段(10yg/ml)刺激，以评估奥美拉唑对淋巴细胞增殖活性反应的效果(图2A)。应用MTS试验发现，在有PO肽段刺激时，和对照组(0.91 ±0.08)相比，预防组(0.58 ± 0.02)和对照组(0.54 ± 0.05)的淋巴细胞增殖活性都较低。没有PO肽段刺激时，有同样的淋巴细胞增殖活性模式，但奥美拉唑干预组与对照组的差异并没有统计学意义。
[0043]研究表明，细胞因子的表达谱影响EAN的转归。因此本发明应用多因子ELISA对伴或不伴PO刺激的体外培养的EAN大鼠脾脏单个核细胞的细胞因子进行了半定量分析。如图2B所示，奥美拉唑预防组和治疗组较对照组减少了单个核细胞的促炎细胞因子(白介素6、γ干扰素、白介素Ia和肿瘤坏死因子α)的产生。其中白介素6、γ干扰素和肿瘤坏死因子α的变化具有统计学差异(图2Β，ρ<0.05)，白介素Ia的水平在三组间的变化并无意义。相反，抗炎性细胞因子白介素4和10的水平升高。但只有白介素4的水平的变化具有统计学意义(图2Β，ρ<0.05);而白介素1在各组内的水平差异性较大，并没有统计学差异。
[0044]本发明进一步通过脾脏的RT-PCR证实了奥美拉唑处理组单个核细胞中产生细胞因子的差异。像图2C-H所示，奥美拉唑干预组的γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素17的mRN水平较对照组明显下降(图2C-F，p <0.05)，而白介素4和白介素10的水平则明显升高(图 2G 和H，p<0.05)。
[0045]3实验结论
[0046]本发明研究发现，奥美拉唑下调了EAN脾脏中γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素17四种促炎性细胞因子的mRNA水平，同时上调了白介素4和白介素10两种抗炎性细胞因子的mRNA水平。而且在脾单个核细胞培养上清液中，ELISA检测的细胞因子表达谱也有相似的趋势。该性质足以支撑奥美拉唑对EAN炎症损伤的治疗作用。
[0047]通过临床评分来评估神经症状，本发明发现奥美拉唑可以明显改善EAN症状，表现为减轻瘫痪严重程度，延迟首发症状的出现，减低高峰期临床评分和减少临床评分的曲线下面积。肌电图研究表明奥美拉唑可以通过改善运动传导速度和复合肌动作电位波幅、减少末端运动潜伏期来保护EAN导致的外周神经损伤。组织病理方面，EAN的特点是炎症细胞浸润和神经脱髓鞘。本项研究中，奥美拉唑的预防组和治疗组较对照组均明显减少了浸润的炎症细胞的积聚和退髓鞘的程度。由此可见，奥美拉唑对EAN动物具有确切的治疗作用。
[0048]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.奥美拉唑用于制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物下调体内γ干扰素含量。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物下调体内肿瘤坏死因子α含量。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物下调体内iNOS含量。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物下调体内白介素6的信使RNA表达量。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物下调体内白介素17的信使RNA表达量。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的剂型是口服剂。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述自身免疫性疾病是自身免疫性神经炎。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述自身免疫性疾病是由自身免疫性疾病引起的炎症损伤。
【文档编号】A61P25/00GK105920002SQ201610298608
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】徐祗栋
【申请人】徐祗栋