牛蒡苷元在与糖尿病相关的药物中的应用
【专利摘要】本发明提供一种牛蒡苷元在制备减少糖尿病蛋白尿的药物中的应用。本发明的牛蒡苷元的用途，能够显著的减少糖尿病小鼠的蛋白尿。同时，牛蒡苷元能够显著抑制STZ?eNOS?/?小鼠肾小球NOX4的表达。
【专利说明】
牛黃昔元在与糖尿病相关的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及牛募巧元在与糖尿病相关的药物中的应用，属于中药领域。
【背景技术】
[0002] 牛募巧元(ATG)是中药牛募子中的主要单体化合物。牛募子被临床广泛用于糖尿 病的治疗，但其作用机制和有效作用成分还不明确。
[0003] 糖尿病肾病的临床表现为持续的蛋白尿W及肾小球滤过率下降，正常成人24小时 尿蛋白总量小于150mg，青少年可略高但不超过300mg/24h，当尿中蛋白总量超300mg/24h而 被检出时，即被称为蛋白尿。蛋白尿是糖肾患者最头痛的问题，尿中蛋白的多少不仅与肾脏 损伤程度有关，也是考量糖肾等慢性肾病患者病情进展的主要指标之一。正常人尿液含有 极微量蛋白，常规检查尿蛋白呈阴性。但如果肾脏病变引起肾小球功能改变，导致肾小球滤 过膜通透性增加后，可使肾小球滤液中的蛋白增多，超出肾小管重吸收能力，出现W白蛋白 为主的蛋白尿。降低糖尿病蛋白尿可W减少其对肾脏的继续损伤。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供牛募巧元的新用途。
[0005] 本发明采用了 W下技术方案：
[0006] 本发明提供一种牛募巧元在制备减少糖尿病蛋白尿的药物中的应用。
[0007] 进一步，本发明的牛募巧元的应用，还可W具有运样的特征:其中，牛募巧元的有 效剂量为20~60mg/kg。
[000引本发明还提供一种牛募巧元在制备减少糖尿病小鼠的蛋白尿的药物中的应用。
[0009]本发明还提供一种牛募巧元在制备抑制N0X4基因表达的试剂中的应用。
[0010]另一方面，本发明还提供一种抑制小鼠的N0X4基因表达的方法，其特征在于：包 括，W剂量为20~60mg/kg的牛募巧元对小鼠进行给药的步骤。
[0011] 进一步，本发明的抑制小鼠的N0X4表达的方法，还可W具有运样的特征:其中，所 述小鼠为STZ-eNOS-/-小鼠。
[0012] 本发明还提供一种抑制人永生型足细胞的N0X4表达的方法，其特征在于:包括：W 剂量为10~100M1的牛募巧元对人永生型足细胞进行培养的步骤。
[0013]本发明还提供一种牛募巧元在抑制高糖导致的内皮细胞中N0X4过度表达中的应 用。
[0014] 本发明还提供一种牛募巧元在制备抑制N0X4产生活性氧簇R0S的试剂中的用途。
[0015] 发明的有益效果
[0016] 本发明的牛募巧元的用途，能够显著的减少糖尿病小鼠的蛋白尿。同时，牛募巧元 能够显著抑制STZ-eNOS-/-小鼠肾小球N0X4的表达。
【附图说明】
[0017]图1是使用牛募巧元对糖尿病模型小鼠进行给药的实验结果曲线。
[001引图2是牛募巧元给药的STZ-eNOS-/-小鼠肾小球N0X4的蛋白表达图。
[0019] 图3是牛募巧元给药的STZ-eNOS-/-小鼠肾小球N0X4基因的mRNA表达图。
[0020]图4是ATG给药的人永生型足细胞的N0X4蛋白表达图。
[0021 ]图5是ATG给药的人永生型足细胞的N0X4基因的mRNA表达图。
[0022] 图6是ATG给药的内皮细胞的N0X4蛋白表达图。
[0023] 图7是ATG给药的内皮细胞的N0X4基因的mRNA表达图。
[0024] 图8是ATG对高糖引起N0X相关R0S的影响。
【具体实施方式】
[0025] W下对本发明的【具体实施方式】做详细说明。
[0026] 本实施方式中所使用的Western Blot和mRNA的检测方法均为本领域的技术人员 所常用的检测方法，其具体检测方法记载于《分子生物学实验手册》(人民军医出版社，出版 时间2011年6月1日）中。本实施方式中所使用的试剂、细胞和实验动物均可通过商业途径购 买得到。实施方式中各实验的重复次数均采用大于有统计学意义的重复次数。
[0027] 1、牛募巧元(ATG)可W明显减少糖尿病肾脏疾病小鼠的蛋白尿
[0028] 小鼠6周时开始尾静脉注射链脈佐菌素(STZ)诱导糖尿病肾脏疾病模型，具体方法 是:STZ按照50mg/kg尾静脉注射。在注射72小时后通过检测血、尿葡萄糖水平来判定造模是 否成功。当血糖超过尿糖在+++到++++认定造模成功。在注射STZ10周后给予给予 ATG灌胃，给药剂量40mg/kg，每日给药一次。对照组给予同样体积的DMS0(二甲基亚讽）灌 胃。疗程8周。然后检测各组的尿蛋白情况。表1中每组小鼠的数量为10只。结果如表1和图1 所示，ATG能明显减少蛋白尿，且效果优于目前被广泛用于该病ACEI/ARBsdACEI:血管紧张 素转化酶抑制剂;ARBs:血管紧张素受体阻断剂。
[0029] 表1:ATG减少蛋白尿的实验结果
[0030]
[0031] 氧化应激被认为是糖尿病肾病发生和发展的一个关键致病因素，许多研究证实， 无论在实验室的糖尿病肾病模型还是糖尿病患者体内都存在着氧化应激现象。氧化应激， 指的是机体在遭受各种有害刺激时，自由其及其活性衍生物产生增多，同时伴有抗氧化系 统能力降低，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损 伤。在肾组织中有许多的酶系统可W产生R0S，如尼克酷胺腺嚷岭二核巧酸憐酸氧化酶 (NADPH oxidase,N0X)系统。肾脏是对氧化操作敏感的器官之一。而本发明证实牛募巧元对 N0X4的表达具有显著的抑制作用，掲示了牛募巧元对N0X4的表达具有调节作用，从而减轻 糖尿病肾病患者蛋白尿的症状。
[0032] 2、ATG能减少STZ-eNOS-/-小鼠肾小球中N0X4的蛋白W及mRNA表达。
[0033] WestenBlot结果证实ATG给药（给药剂量与第1部分中一致）的STZ-eNOS-/-小鼠肾 小球N0X4(abl33303)的蛋白表达较未给药组明显减少，具体结果见表2和图2。
[0034] 表2: We S ternB 101数据的统计结果
[0035]
[0036] 进一步，提取肾小球的mRNA后做RT-PCR。结果发现ATG能显著减少N0X4基因的mRNA 表达，结果见图3。
[0037] 3、ATG能减少人永生型足细胞和内皮细胞N0X4的蛋白和mRNA表达。
[003引 3.1通过Western杂交和Realtime PCR证实ATG在人永生型足细胞中可W抑制高糖 作用下N0X4的过度表达，见图4和图5,实验分别检测了人永生型足细胞总蛋白、膜蛋白和线 粒体蛋白中N0X4表达情况结果发现高糖环境下总蛋白、膜蛋白和线粒体蛋白中N0X4的表达 均增加，而ATG在W上巧中结构中均能抑制N0X4的表达。人永生型足细胞中的ATG添加量为10 皿ol/L。图5表明ATG能抑制高糖导致的人永生型足细胞内N0X4mRNA的过度表达。
[0039] 图4中各符号的含义如下：册：高糖（葡萄糖25mM);T:总蛋白；Tmeb细胞膜蛋白； Mi to:线粒体蛋白。
[0040] 表3足细胞中N0X4蛋白Western杂交的统计结果
[0041]
[0042]
[0043] 3.2通过Western blot和Realtime PCR证实ATG在小鼠原代内皮细胞，可W抑制高 糖作用下N0X4的过度表达，如图6所示，ATG刺激内皮细胞的用量，1和1 Oumo 1 /L的剂量在图 中对应后面两个条带。ATG能抑制高糖导致的小鼠原代内皮细胞内N0X4蛋白的过度表达。
[0044] 表4内皮细胞中N0X4蛋白Western杂交的统计结果
[0045]
[0046] 如图7所示，ATG能抑制高糖导致的小鼠原代内皮细胞内N0X4mRNA的过度表达。
[0047] 4、ATG能抑制N0X产生活性氧簇R0S
[004引用人永生型足细胞分为6组：空白组、高糖组（30mM)、高糖+10yMATG、高糖+20μ MATG、高糖巧 OyMATG、高糖+1 OOyMATG。
[0049] 检测NADPH(还原型辅酶Π )氧化活性来观察ATG对N0X产生的R0S的影响方法：用 皿SS化anks平衡盐溶液)洗小鼠内皮细胞2次，且将细胞培养皿置于冰上。用冰冻的含有蛋 白酶抑制剂的皿SS将细胞刮下，匀浆。计算蛋白含量。每个孔加30yg蛋白并加入25μΜ光泽精 (Santa Cruz)和200μΜ NADPH(Cayman Chemical)。在暗室37摄氏度放置10分钟后，测量每 孔的发光度。
[0化0] 结果：高糖组与正常组R0S有差异，P<0.05;高糖刺激后ATG不同浓度（10μΜ、20μΜ、 50μΜ、100μΜ)均能减少Ν0Χ产生的R0S量，Ρ<0.05。具体见表5和图8。
[0051 ] 表5:ATG对高糖引起Ν0Χ相关R0S的影响
[0化2]
【主权项】
1. 牛蒡苷元在制备减少糖尿病蛋白尿的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于： 其中，牛蒡苷元的有效剂量为20~60mg/kg。3. 牛蒡苷元在制备减少糖尿病小鼠的蛋白尿的药物中的应用。4. 牛蒡苷元在制备抑制N0X4基因表达的试剂中的应用。5. -种抑制小鼠的N0X4基因表达的方法，其特征在于： 包括，以剂量为20~60mg/kg的牛蒡苷元对小鼠进行给药的步骤。6. 如权利要求4所述的抑制小鼠的N0X4表达的方法，其特征在于： 其中，所述小鼠为STZ-eNOS+小鼠。7. -种抑制人永生型足细胞的N0X4表达的方法，其特征在于： 包括：以剂量为10~IOOum的牛蒡苷元对人永生型足细胞进行培养的步骤。8. 牛蒡苷元在抑制高糖导致的内皮细胞中N0X4过度表达中的应用。9. 牛蒡苷元在制备抑制N0X4产生活性氧簇ROS的试剂中的用途。
【文档编号】A61P39/06GK105919993SQ201610320986
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】钟逸斐, 顾宏刚, 陈以平, 邓跃毅, 李雪玲, 郑蓉
【申请人】上海中医药大学附属龙华医院