一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖?藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将固体凝胶浸入壳聚糖溶液中，然后取出，再浸入去离子水中，所述固体凝胶由明胶溶液凝固而成；(2)将步骤(1)浸入去离子水中的固体凝胶取出，浸入藻酸盐溶液中，然后取出，再浸入更换后的去离子水中；(3)重复步骤(1)和(2)10～20次后，将固体凝胶置于水中加热熔化，其中白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖?藻酸盐纳米膜。本发明通过温和的条件即可实现纳米膜与基底的分离，降低了分离过程对纳米膜的机械损伤，制作工艺简单，不涉及有机溶剂等毒性材料，保证了纳米膜良好的生物亲和力。
【专利说明】
_种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于组织工程的生物材料领域，具体涉及一种用于创伤组织修复的壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法。
【背景技术】
[0002]人体内多种组织器官(如皮肤、骨、牙齿等)会因各种因素导致损伤，损伤的修复过程即组织的重建过程，涉及到炎症反应，免疫反应，血管再生及干细胞分裂分化等一系列复杂的变化。由于创伤后微环境的变化，如烧伤烫伤病人皮肤皮岛缺失，或者继发性创面感染等均严重影响了组织损伤修复。因此，制备一种和人体组织间生物亲和性强，无毒性且能为组织修复和细胞再生提供良好微环境的生物材料，可以极大地促进组织愈合，减少创伤后并发症的发生，缩短患者疗程，改善预后情况，甚至挽救患者生命。
[0003]具有类似皮肤组织结构和功能的组织工程皮肤由充当细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)角色的仿生生物支架材料组成，它可促进干细胞在其表面粘附、增殖、分化，最终达到皮肤组织重建的目的，在皮肤组织工程中应用较广泛的为细胞相容的生物多聚物超薄膜。通过自组装制备超薄膜，由于制备的超薄膜结构简单、制备相对容易等特点，引起了人们的研究兴趣。
[0004]在已有的文献记载中，许多不同材料被选做层层自组装的基底。例如，在SofiaG.Caridade等人的研究中，分别运用了硅片、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)及聚四氟乙烯等材料分别作为基底进行层层自组装，通过冷冻干燥24h后，用镊子从聚苯乙烯和聚丙烯基底上机械地分离得到游离的纳米膜。该方法既浪费材料和时间，而且极易对纳米膜造成机械性损坏。ToshinoriFujie等人设计了一种可用丙酮溶解的光阻材料作为层层自组装的基底，通过丙酮溶解基底而分离得到纳米膜，而丙酮做为有机溶剂，对组织细胞具有毒性作用，势必将影响纳米膜本身的细胞亲和力。Chen J等人也试图用类似的纳米膜在体外对细胞进行培养，具体地，在载玻片上涂上一层均匀的温敏材料，将目的细胞粘附在该材料上后，以层层自组装法在温敏材料-细胞复合物上壳将聚糖和藻酸盐层层叠加来制作纳米膜-细胞复合物。该方法步骤繁琐，耗时长，无法保证细胞对于外界环境的严格要求，因此严重限制了对该纳米膜运用于体内的更进一步研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的主要是针对现有层层自组装制备超薄膜的方法，存在制备时间长、生物相容性差等问题，提供一种制备简单、生物相容性好的壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法。
[0006]本发明的具体技术方案为:一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007](I)将固体凝胶浸入壳聚糖溶液中，然后取出，再浸入去离子水中；
[0008](2)将步骤(I)浸入去离子水中的固体凝胶取出，浸入藻酸盐溶液中，然后取出，再浸入更换后的去离子水中；
[0009](3)重复步骤(I)和(2)10?20次后，将固体凝胶置于水中加热熔化，其中白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖-藻酸盐纳米膜。
[0010]本发明利用带不同电荷的材料相互吸引的原理，通过层层自组装，依次向固体凝胶表面层层叠加带正电荷的壳聚糖和带负电荷的藻酸盐，经层层叠加后，最终在明胶基底表面形成壳聚糖-藻酸盐纳米膜，该膜的厚度与叠加层数成正比，层与层之间的距离仅约200nm，最后利用固体凝胶在不同温度下固液两态间的变化，将固体凝胶熔化，从而得到游离的壳聚糖-藻酸盐纳米膜。本发明制备的纳米膜为独立无支撑(Free-standing)的3D膜结构，目前尚无对此种独立纳米膜生产报道，是传统层层自组装纳米膜制备技术的进一步升华，创新独特，制作简单，可充当细胞支架的作用，可为多种细胞的生长提供适宜的微环境。[0011 ]作为优选，所述明胶溶液的质量体积比为0.15?0.25g/mLo
[0012]作为优选，所述壳聚糖溶液的质量体积比为0.04?0.06g/mL，pH为4.5?5.5。在配制壳聚糖溶液溶液时，可添加适量的NaCl和醋酸以促进溶解。
[0013]作为优选，所述藻酸盐溶液的质量体积比为0.04?0.06g/mL，pH为6.5?7.5。在配制藻酸盐溶液时，可添加适量的NaCl和氢氧化钠以促进溶解。
[0014]作为优选，步骤(I)中，固体凝胶浸入壳聚糖溶液中5?7min，浸入去离子水中45?75So
[0015]作为优选，步骤(2)中，固体凝胶浸入藻酸盐溶液中5?7min，浸入去离子水中45?75s。固体凝胶浸入壳聚糖溶液和藻酸盐溶液中，主要是促进壳聚糖或藻酸盐在明胶基底层上沉淀，适当的浸入时间可保证壳聚糖或藻酸盐沉淀完全，去离子水浸泡主要是为了漂洗杂质，促进电离，不宜太久。在上述操作中，只要保证溶液能够完全浸没固体凝胶即可，在制备过程中，为了防止固体明胶熔化，整个过程在20°C左右环境中进行。
[0016]作为优选，所述藻酸盐为海藻酸钠。
[0017]作为优选，步骤(3)中水的温度为45?55°C。
[0018]本发明的有益效果是:(1)通过温和的条件即可实现纳米膜与基底的分离，降低了分离过程对纳米膜的机械损伤；(2)制备过程不涉及有机溶剂等毒性材料，保证了纳米膜良好的生物亲和力；(3)制作工艺简单，时间短、成本低；(4)本发明制备的纳米膜可运用于组织工程多个领域，包括皮肤创伤修复，牙齿创伤修复，骨组织修复等，用途广泛。
【附图说明】
[0019]图1为各组小鼠不同时间点创面愈合图；
[0020]图2为各组小鼠不同时间点残余创面比率；
[0021]图3为实施例1制备的壳聚糖-藻酸盐纳米膜扫描电镜图；
[0022]图4为实施例1制备的壳聚糖-藻酸盐纳米膜在透射电镜下的横截面观；
[0023]图5为实施例1中经层层自组装后固体明胶在50°C热水中熔化后表面析出的壳聚糖-藻酸盐纳米膜图；
[0024]图6为小鼠BMSC(骨髓间充质干细胞)在实施例1制备的纳米膜上培养72hLive-dead染色后免疫荧光显微镜图；
[0025]图7为小鼠BMSC在不同条件下培养经MTT染色后细胞溶液吸光度变化图；
【具体实施方式】
[0026]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
[0027]本发明所采用原料和设备若非特指，均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0028]实施例1
[0029]在37°C的恒温水浴中按质量体积比0.2g/mL配制明胶溶液，将配制好的明胶溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固体明胶。
[0030]按质量体积比0.05g/mL配制壳聚糖溶液，配制时加入0.14mo I/L的NaCI和2mo I/L的醋酸，以促进壳聚糖溶解，然后用质量分数为10%的氢氧化钠溶液调节其pH为5.0。
[0031]按质量比体积0.0 5 g/mL配制海藻酸钠溶液，配制时加入0.14mο I / L的NaCI和0.1!1101/1的他0!1，使海藻酸钠在碱性调节下充分溶解，再用稀盐酸调节?!1至7.0。
[0032]在室温20°C环境下，将固体明胶浸入壳聚糖溶液中6min，然后取出，再浸入去离子水中lmin，然后再取出浸入海藻酸钠溶液中6min，再浸入更换过的去离子水中lmin。重复上述过程15次，每次需要更新使用过的去离子水。整个过程完成后，将固体明胶浸入50°C的热水中，使固体明胶熔化，可见表面有白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖-藻酸盐纳米膜。
[0033]实施例2
[0034]在370C的恒温水浴中按质量体积比0.15g/mL配制明胶溶液，将配制好的明胶溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固体明胶。
[0035]按质量体积比0.04g/mL配制壳聚糖溶液，配制时加入0.14mo I/L的NaCI和2mo I/L的醋酸，以促进壳聚糖溶解，然后用质量分数为10%的氢氧化钠溶液调节其pH为4.5。
[0036]按质量比体积0.06g/mL配制海藻酸钠溶液，配制时加入0.14moI/L的NaCI和0.lmol/L的NaOH，使海藻酸钠在碱性调节下充分溶解，再用稀盐酸调节pH至6.5。
[0037]在室温20°C环境下，将固体明胶浸入壳聚糖溶液中7min，然后取出，再浸入去离子水中75s，然后再取出浸入海藻酸钠溶液中5min，再浸入更换过的去离子水中45min。重复上述过程20次，每次需要更新使用过的去离子水。整个过程完成后，将固体明胶浸入50°C的热水中，使固体明胶熔化，可见表面有白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖-藻酸盐纳米膜。
[0038]实施例3
[0039]在370C的恒温水浴中按质量体积比0.25g/mL配制明胶溶液，将配制好的明胶溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固体明胶。
[0040]按质量体积比0.06g/mL配制壳聚糖溶液，配制时加入0.14mol/L的NaCl和2mol/L的醋酸，以促进壳聚糖溶解，然后用质量分数为10%的氢氧化钠溶液调节其pH为5.5。
[0041 ] 按质量比体积0.04g/mL配制海藻酸钠溶液，配制时加入0.14mo 1/L的NaCl和
0.lmol/L的NaOH，使海藻酸钠在碱性调节下充分溶解，再用稀盐酸调节pH至7.5。
[0042]在室温20°C环境下，将固体明胶浸入壳聚糖溶液中5min，然后取出，再浸入去离子水中60s，然后再取出浸入海藻酸钠溶液中7min，再浸入更换过的去离子水中60s。重复上述过程10次，每次需要更新使用过的去离子水。整个过程完成后，将固体明胶浸入50°C的热水中，使固体明胶熔化，可见表面有白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖-藻酸盐纳米膜。
[0043]实施例4:创面愈合实验
[0044]I)实验动物分组:实验动物(BALB/C小鼠)由第三军医大学实验动物中心提供，32只小鼠以抽签法随机分为4组(每组8只)，分别设为空白对照组，纳米膜组，MSC注射组和纳米膜+MSC注射组。实验动物予1%戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉，背部术区备皮后，于俯卧位固定，术区常规碘伏消毒，酒精脱碘后，于小鼠背部用打孔器制备直径
0.5cm全层皮肤缺损创面。
[0045]2)实验方案:空白对照组小鼠创面不予任何处理，纳米膜组小鼠创面仅予纳米膜覆盖而不注射MSCs，MSC注射组小鼠创面仅进行注射MSC操作而不予纳米膜覆盖创面，纳米膜+MSC注射组小鼠创面既用纳米膜覆盖，并在创面注射MSCs。在术后第1、3、5、7、9天分别观察各组小鼠创面愈合情况(具体见图1)，并计算统计残余创面所占原创面的百分比(具体见图2)，其中计算公式为:残余创面百分比=第η天残余创面面积/原始创面面积X 100%。
[0046]由图1可以看出，纳米膜+MSC注射组创面随着时间延长(术后第7、9天)在同一时间点愈合情况优于空白对照组、纳米膜组和MSC注射组，空白对照组愈合情况最差;术后9天纳米膜+MSC注射组小鼠创面已接近完全愈合。由图2也可以看出，在术后7、9天，纳米膜+MSC注射组残余创面百分比小于其它3组，残余创面百分比<0.05%。上述结果证明了本发明制备的纳米膜作为良好的生物支架材料，可促进干细胞生长增殖，对创面的修复有良好的促进作用。
[0047]图3为实施例1制备的壳聚糖藻酸盐-纳米膜扫描电子显微镜照片，由图可看出纳米膜表面平面为致密的凹凸不平的结构。
[0048]图4为实施例1制备的壳聚糖藻酸盐-纳米膜透射电子显微镜照片，图片显示了纳米膜层层自组装的层层结构，相邻两层之间的距离约200nm，证明该方法成功制备了纳米膜。
[0049]图5为实施例1中经层层自组装后的固态明胶在50°C热水中熔化后表面析出的纳米膜图。
[0050]图6为小鼠BMSC(骨髓间充质干细胞)在实施例1制备的纳米膜上培养72h后Live-dead 染色后免疫荧光显微镜下观察照片(图中白色为死亡的小鼠 BMSC，箭头所示为正处于有丝分裂中期的BMSC)，图片显示超过99%的细胞在纳米膜上培养3天后都具有良好的生物活性，说明该方法制备的纳米膜具有良好的生物相容性。
[0051]图7为小鼠BMSC在实施例1制备的纳米膜上培养及普通培养皿中培养后，经MTT染色后细胞溶液吸光值变化图，由图可以看出，在BMSC培养0h、24h、48h三个时间点，实验组和对照组经MTT染色后细胞溶液吸光值无明显差别；而在72h时经MTT染色后实验组细胞溶液吸光值显著高于对照组，说明本发明方法制备的纳米膜具有良好的细胞亲和力。
【主权项】
1.一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将固体凝胶浸入壳聚糖溶液中，然后取出，再浸入去离子水中，所述固体凝胶由明胶溶液凝固而成； (2)将步骤(I)浸入去离子水中的固体凝胶取出，浸入藻酸盐溶液中，然后取出，再浸入更换后的去离子水中； (3)重复步骤(I)和(2)10?20次后，将固体凝胶置于水中加热熔化，其中白色或淡黄色薄膜析出物，即为壳聚糖-藻酸盐纳米膜。2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液的质量体积比为0.15?0.25g/mL03.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的质量体积比为0.04?0.06g/mL，pH为4.5?5.5。4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，所述藻酸盐溶液的质量体积比为0.04?0.06g/mL，pH为6.5?7.5。5.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，固体凝胶浸入壳聚糖溶液中5?7min，浸入去离子水中45?75s。6.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，固体凝胶浸入藻酸盐溶液中5?7min，浸入去离子水中45?75s。7.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，所述藻酸盐为海藻酸钠。8.根据权利要求1所述的一种壳聚糖-藻酸盐纳米膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，水的温度为45?55°C。
【文档编号】A61L27/26GK105903072SQ201610373066
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】孔易, 徐瑞, 贺伟峰, 罗高兴, 邢梦秋, 吴军
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第附属医院, 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院