一种多肽在制备ttx-s型钠通道工具试剂中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种生物活性多肽在制备电压门控钠通道工具试剂?TTX?S型钠通道抑制剂中的应用方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钠肽?IX（SPNP?IX），试验验证该活性多肽对TTX?S型电压门控钠通道具有明显的抑制作用。在制备电压门控钾通道亚型工具试剂时，配制细胞外给药的浓度为100 nmol/L或500 nmol/L。SPNP?IX的半数有效作用剂量IC50为360 nmol/L。SPNP?IX对TTX?S型钠通道的抑制呈现时间依从性和可逆性，是一种较好的TTX?S型钠通道工具试剂。
【专利说明】
一种多肽在制备TTX-S型钠通道工具试剂中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1x(简写为SPNP-1X)在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂中的用途。
【背景技术】
[0002]电压门控钠通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程，同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钠通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钠通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料，同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等)的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。它们通过与钠通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽_IX(简写为SPNP-1X)，其氨基酸序列为:
NH2~G1u Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys ProHis Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-
NH2,
其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X作为单一有效活性组份用于制备TTX-S型钠通道抑制剂。
[0004]所述的蜘蛛抑钠肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。
[0005]该蜘蛛抑钠肽-1X作为单一有效活性组分用于制备TTX-S型钠通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成TTX-S型钠通道工具试剂。
[0006]蜘蛛抑钠肽-1X在制备TTX-S型钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为 100 nmol/L 或500 nmol/L。
[0007]蜘蛛抑钠肽-1X抑制TTX-S型钠通道的半数有效作用剂量IC5q为360 nmol/L。
[0008]蜘蛛抑钠肽-1X对TTX-S型钠通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的TTX-S型钠通道工具试剂。
【附图说明】
[0009]图1是100 nmol/L SPNP-1X对大鼠DRG神经元上TTX-S型钠通道的影响。
[0010]图2是500 nmol/L SPNP-1X对大鼠DRG神经元上TTX-S型钠通道的影响。
[0011]图3是SPNP-1X作用于大鼠DRG细胞TTX-S钠通道的时间-效应关系曲线。
[0012]图4是SPNP-1X作用于大鼠DRG细胞TTX-S钠通道的浓度-效应关系曲线。
[0013]图5是SPNP-1X对大鼠DRG细胞TTX-S钠通道电流-电压关系的影响。
[0014]图6是SPNP-1X对大鼠DRG细胞TTX-S钠通道电导-电压关系的影响。
[0015]图7是SPNP-1X对大鼠DRG细胞TTX-S钠通道的稳态失活动力学的影响。
【具体实施方式】
[0016]为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用大鼠背根神经节细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-1X的TTX-S型钠通道抑制作用。
[0017]
1、实验材料和方法
1.1大鼠背根神经节细胞(DRG细胞)的急性分离培养
挑选出生4周左右、体重140?200 g的SD大白鼠，断颈处死后，用剪子迅速取出脊椎并剪成2?3段，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维。在胸腰椎段，可挑选18个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中；在解剖显微镜下，用尖头镊子和维娜斯剪分离出神经节。剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5 mL培养液的培养皿中。用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎，越碎越好。剪碎之后，转入消化液，在34°C、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min。期间每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入胰酶抑制剂，终止酶解。无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心(800 rpm、5 min)，去上清，加入8 mL含10%小牛血清的长期培养液。重悬细胞后分成3?4皿，放入培养箱(5%C02、95%空气)中，37 °C培养3?4 h贴壁。
[0018]1.2膜片钳电生理活性实验
膜片钳实验均在室温(25±1°C)进行，采用全细胞膜片钳技术。挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞或者有绿色荧光的HEK293T细胞作为实验细胞。电流记录通过全细胞膜片钳技术利用EPC9放大器(HEKA公司，German)在电脑上进行。计算机记录和分析系统采用Pulse+Pulsefit 8.0软件。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管(南京泉水教学实验器材厂)。玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪(Narishige,Japan)抛光后电极尖端直径约为3 um，充灌电极液后电极电阻为1-3ΜΩ。膜片钳实验要在室温条件下进行，整个实验过程中温度的变动最多上下不超过2°C。采用SigmaPlot 9.0软件分析实验结果。
[0019]2、实验结果与分析 2.1 SPNP-1X对TTX-S型电压门控钠通道的影响
我们检测了 SPNP-1X对DRG细胞TTX-S型电压门控钠通道的影响。结果如图1、2所示，10nM和500 nM的SPNP-1X对TTX-S钠通道都有明显的抑制作用，最大抑制率分别为23± 3%(η = 5)和63±5% (η = 4)。而且，不同于其它蜘蛛毒素(如JZTX-1)，当SPNP-1X部分抑制钠电流后，电流的形状和对照电流形状一致，说明它们没有明显改变钠电流的激活与失活动力学特征，因而我们推测毒素在钠通道上的结合位点可能不是位点3ΑΡΝΡ-ΙΧ抑制TTX-S型钠电流速度都非常迅速，具有时间依从性。当浓度为10 μΜ时，可在约2 min的时间内达到100%的抑制程度(图4)。10 μΜ的SPNP-1X抑制DRG细胞TTX-S钠电流的时间常数为18.1 土2.3 s (η = 4)。并且10 μΜ的SPNP-1X对静息关闭状态的TTX-S钠通道的抑制比例约为97%，表明SPNP-1X对处于静息关闭和激活状态的钠通道均有相似的亲和性。SPNP-1X对大鼠DRG细胞TTX-S钠通道电流的抑制都具有浓度依从性，它们的半数有效抑制浓度(IC5q)是360nmol/L (图4)。当剂量曲线用Hi 11公式拟合时，可得出浓度效应曲线的Hi 11系数，大小为0.95ο
[0020]2.2 SPNP-1X对TTX-S型电压门控钠通道激活状态的影响
在全细胞电压钳记录模式下，将细胞钳制在-80 mV时，分别给予一系列测试电压，其变化范围为-80?+60 mV，步幅为+10 mV，持续时间为50 ms，可在大鼠DRG细胞上得到TTX-S钠通道的电流-电压(1-V)关系曲线图，并能揭示出通道的激活阈值、最大峰值电流激活电压和逆转电位大小。空白对照条件下，当细胞膜电位钳制在-80 mV时，TTX-S钠通道的起始激活电压约为-50 mV，最大电流峰值激活电压约为-20 mV，而逆转电位约为+35 mV。在细胞周围加入500 nM的SPNP-1X，让毒素与细胞作用3 min后，再以相同的去极化刺激诱导1-V曲线，结果如图5APNP-1X能使TTX-S和TTX-R钠通道的起始激活电位和峰值电流激活电压向去极化方向漂移约+10 mV，但反转电位变化不明显，说明毒素与通道的相互作用没有改变通道对离子通透的选择性。SPNP-1X对TTX-S钠通道的电导-电压曲线也有相似的影响，能导致TTX-S钠通道的电导-电压(G-S)关系曲线往去极化方向漂移约+10 mV(图6)。
[0021]2.3 SPNP-1X对TTX-S型电压门控钠通道稳态失活的影响
我们运用一标准的双脉冲刺激方式，进一步观察了SPNP-1X对大鼠DRG细胞TTX-S钠通道的稳态失活动力学的影响。双脉冲刺激参数为:先将细胞膜电位预钳制在-120 mV，持续时间为I s，然后将膜电位转变为-80 mV，时间为0.5 ms，目的是消除细胞膜电容的充电状态，再将去极化电位跃迀到-10 mV，持续时间为50 ms，之后，膜电位回复到-80 mV。进行下一次刺激时，只需改变预钳制电压(-120 mV - O mV，步幅为+10 mV)，而测试电压水平同上。图7表示的是在不同预钳制电压下，所诱导电流与最大电流(S卩-120 mV)的比值大小。将图中所有数据点群用Boltzmann方程进行拟合，可得出通道的半数稳态失活电压(V1/2)值。如图7，对于TTX-S钠通道，对照条件下，V1/2为-58.5 ± 1.2 mV(n=8)，加入SPNP-1X后，Vv2变成-62.5 ± 1.2 mV(n=7)。结果表明SPNP-1X对TTX-S钠通道的稳态失活特征没有明显影响，而且没有明显改变对照曲线的斜率。
【主权项】
1.一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X(简写为SPNP-1X)，其氨基酸序列为: Mfe-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH2, 其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X作为单一有效活性组份用于制备TTX-S型钠通道抑制剂。2.根据权利要求1所述的一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-1X在制备电压门控钠通道工具试剂-TTX-S型钠通道抑制剂中的应用，其特征在于，所述的蜘蛛抑钠肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-1X作为单一有效活性组分用于制备TTX-S型钠通道抑制剂。4.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-1X制备成细胞外给药的TTX-S型钠通道工具试剂。5.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-1X在制备TTX-S型钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为100 nmol/L或500 nmol/L。6.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-1X的半数有效作用剂量IC5O为360 nmol/Lο7.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-1X的作用是时间依从的。
【文档编号】A61P25/00GK105903000SQ201610254510
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月24日
【发明人】邓梅春, 罗旋
【申请人】长沙沁才生物科技有限公司