小檗果α-糖苷酶抑制活性有效提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种小檗果α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。所述的提取物通过如下方法获得：先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:100，体积比）洗脱，继用甲醇溶剂洗脱，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为α-糖苷酶抑制活性提取物。
【专利说明】
小巽果α-糖音酶抑制活性有效提取物及其组合物的医药 用途和制备方法
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体设及一种小築果α -糖巧酶抑制活性提取物及其组 合物的制备方法W及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。
【背景技术】
[0002] 小築果为小築科植物红果小築仇?rAeris niMZffli/yaria Bge.的干燥成熟果实。呈 广卵形、楠圆形或近球形，长7-12 mm，宽5-8 mm。外表面光滑或微显皱缩，紫黑色，常被灰 白色粉霜。果皮薄而脆，极易破碎，破碎面紫黑色。有时可见果柄，长约5 mm，果柄着生处可 见种子3-6粒，栋褐色，先端稍弯曲，底端纯圆，长约5 mm，光滑。气微，味微酸。具有健胃 和中，生津止渴，清热解毒的功效。临床上用于治疗消化不良，频疾泻下，口渴，口疮，咽炎。
[0003] 本发明通过大规模、系统地活性筛选，意外地发现维吾尔药小築果提取物及其部 分化学组分，具有显著地α -糖巧酶抑制活性，该活性提取物及其组合物有望应用于降血 糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供一种小築果提取物。
[0005] 本发明还提供了 W小築果提取物为主要活性成分的组合物。
[0006] 本发明同时提供了小築果提取物及其组合物的制备和在制备α -糖巧酶抑制活 性药物中的应用。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药小築果经水煮沸提取，提取液浓缩后，用硅胶（Si化）柱分离，上样后的硅胶 柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1)，各氯仿-甲醇比例混合溶 剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其α -糖巧酶抑制活性，意外地发现先用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱，继用甲醇溶剂洗脱，得到的甲醇 溶剂洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为α-糖巧酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱 部位，没有α-糖巧酶抑制活性的作用。特别地，优选先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:100,体积比）洗脱10倍柱体积，继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体积洗脱液即为本发明 α-糖巧酶抑制活性的提取物，可W通过W上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离 开。该小築果α-糖巧酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征 如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙醋：甲醇（1:1:0,显色方法：香 草醒-硫酸显色。
【发明内容】
[0008] 本发明所解决的技术问题是提供一种提取物。
[0009] 本发明还提供了 W提取物为主要活性成分的组合物。
[0010] 本发明同时提供了小築果提取物及其组合物的制备和在制备α -糖巧酶抑制活 性中的应用。
[0011] 本发明是通过如下技术方案实现的： 1、小築果经水煮沸提取物的制备 取维吾尔药小築果20 g，经200 ml水煮沸提取2 h，提取液浓缩后，得提取物SN0011B， 样品1.3203 g，留样0.1092 g，上样量1.2111 g，拌样硅胶2 g，空白硅胶10 g，氯仿-甲醇 系统洗脱。
[0012] 2、氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药小築果20 g，经200 ml水煮沸提取2 h，提取液浓缩后，得提取物SN0011B， 1.3203 g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15血。上硅胶柱色谱，拌样硅胶2 g，空白硅胶10邑， 玻璃柱内径2.4 cm,氯仿-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积22 mU每个梯度洗脱 200 mU得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，氯仿：甲醇梯度洗脱提取物， TLC分析结果见图2,图3,展开系统：氯仿：乙酸乙醋：甲醇（3:1:1)，氯仿：乙酸乙醋：甲醇 (1:1:1 )，显色方法：香草醒-硫酸显色。
[001引 表1
3、抑制α-糖巧酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 曰、材料：DMS0(二甲基亚讽）（科密欧公司）；ΚΗ2Ρ04、Κ2ΗΡ04 '3&0(广东灿头市西晚化 工厂）；ff-glucosidase 酶（美国 Sigma 公司）；PNPG(美国 Sigma 公司） b、实验仪器：多功能酶标仪Bio-Rad Model 680型度i0-Rad L油oratories Inc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将1 mg待测样品溶于20 μ L二甲基亚讽（DMSO)作为母液，取1 μ L母液 加入99 μ L缓冲盐配成500 yg.血1的样品溶液。
[0014] 在96孔板中依次加入a-glucosidase酶PBS溶液20 μL使其终浓度为0.07 u/ 血，样品浓度为500 μ g·血1的PBS溶液10 μ L。冰浴5分钟，加入底物PBS溶液20 μ L 使其终浓度为2. 5 mmol/L，用浓度为0. 1 Μ、抑6. 84的PBS溶液补足体积为100 μ L。加 过样的96孔板在37 °C水浴30分钟。于405 nm处测定反应物的吸光度，并W阿卡波糖作 为阳性对照。样品抑制a-glucosidase酶活性比率用加样品较空白对照的0々值的比值来 表示。样品抑制百分率按W下公式计算： 酶活性抑制率％ = [A空白-(A样品-A背景）]/ A空白X 100 式中Age :不加样品反应后的吸收值； Afi。。。:加入样品反应后的吸收值； A胃胃:只加样品的吸收值。
[0015] 3)实验结果 表2
结果发现： 本发明的最优方案为：维吾尔药小築果经水煮沸提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离， 上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱，继用甲醇 溶剂洗脱，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物，即为该α -糖 巧酶抑制活性提取物。该α-糖巧酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如 图1。
[0016] 4、α -糖巧酶抑制活性有效提取物的提取方法研究 1)提取溶剂的种类研究 分别用甲醇、丙酬、石油酸、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的α-糖巧酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研究结果表明：提取用有机溶剂可W为甲醇、石油酸、丙酬、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0017] 2)提取溶剂的用量研究 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物的 α-糖巧酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0018] 3)干燥方法的研究 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的 抑制α -糖巧酶活性提取物进行干燥，W含水量、化C、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干燥法适用于对α -糖巧酶抑制活性提取物进行干 燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[001引 表5
优选地，小築果α-糖巧酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药小築果经水煮沸提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比)洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用甲醇溶 剂洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性 提取物。特别地，优先选先用氯仿：甲醇混合溶剂(氯仿：甲醇，100:100,体积比)洗脱10倍 柱体积，继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体积。其中， 1)提取物提取用溶剂可W为甲醇、氯仿、水、甲醇、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混合溶剂、乙 醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重量 的2-50倍(重量/体积比)。
[0020] 2)提取物干燥方法可W为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0021] 5.小築果抑制α-糖巧酶活性提取物(洗脱液为纯甲醇时干燥所得的提取物）的 医药用途研究 按优化的小築果α-糖巧酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其 曰-糖巧酶抑制活性为IC50=19. 5 μ g/血。
[0022] 由于α-糖巧酶抑制剂具有降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面的医药用途。因 此，我们发现的小築果α-糖巧酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0023] 6、小築果抑制α -糖巧酶活性提取物的组合物及其制备方法研究 1)固体分散体 处方 小築果提取物 20 g Vc 1邑 聚乙締化咯烧酬 79 g 固体分散lOOg 制备方法： 称取小築果提取物和载体聚乙締化咯烧酬（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力揽拌器揽拌至小築果提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得小築果有效提取 物PVP包合物。
[0024] 2)环糊精包合物 处方： 小築果提取物 20 g Vc 1邑 β-环糊精 79 g 包合物lOOg 制备方法： 将β-环糊精与1-5倍水研匀，加小築果有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低溫干燥即得环糊精包合物。
[00幼 3)分散片处方： 小築果提取物 100 十^烷基硫酸钢 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酬 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 小築果有效提取物分散体的制备，精密称取小築果提取物、Vc，加入处方量的十二烧 基硫酸钢，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的溫度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的小築果有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酬，预胶化淀粉， 用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边揽拌，制成湿颗粒过14目筛，室溫下放置 15min后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀 后，压片即得。
[0026] 7、小築果抑制α -糖巧酶活性提取物的检测方法研究 我们发现，可W用薄层色谱的方法，很好地检测和标示小築果α -糖巧酶抑制活性提 取物的特征，见图1。
[0027] 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙醋：甲醇（1:1:1)，显色方法： 香草醒-硫酸显色。
[002引【附图说明】： 图1小築果α -糖巧酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图2小築果溶剂提取物的TLC色谱图； 图3小築果溶剂提取物的TLC色谱图。
[0029]
【具体实施方式】： W下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0030] 实施例1 : 取维吾尔小築果20 g，经100血甲醇超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖巧酶抑制活性为 1C加=83. 0 yg/mL。
[0031] 实施例2: 取维吾尔药小築果20 g，经100血乙醇超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖巧酶抑制活性为 Ι〔50=88. 0 yg/mL。
[0032] 实施例3 : 取维吾尔药小築果20 g，经100血石油酸超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的洗 脱液经回收有机溶剂，旋蒸干燥法，即为该活性提取物。经测试，其α-糖巧酶抑制活性为 Ι〔50=79. 0 yg/mL。
[0033] 实施例4: 取维吾尔药小築果20 g，经100 mL丙酬超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖巧酶抑制活性为 1C加=81.0 yg/mL。
[0034] 实施例5 : 取维吾尔药小築果20 g，经100 mL氯仿超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，离屯、干燥，即为该活性提取物。经测试，其α -糖巧酶抑制活性为 Ι〔50=8Ο. 0 yg/mL。
[0035] 实施例6 : 取维吾尔药小築果20 g，经100 mL乙酸乙醋超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100， 体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其α-糖巧酶抑制活性为 Ι〔50=7Ο. 0 yg/mL。
[0036] 实施例7 : 取维吾尔药小築果20 g，经100 mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1:1)超声提取15 min， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶 剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱 体积，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其 曰-糖巧酶抑制活性为ICs〇=88. 0 μ g/mL。
[0037] 实施例8 : 取维吾尔药小築果20 g，经100血乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1:1)超声提取15 min, 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶 剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱 体积，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其 曰-糖巧酶抑制活性为ICw=60. 0 μ g/mL。
[0038] 实施例9 : 取维吾尔药小築果20 g，经100血乙醇-水混合溶剂（乙醇：水=90 :10)超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2 cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合 溶剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用纯甲醇洗脱，洗脱20倍柱 体积，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其 曰-糖巧酶抑制活性为IC50=73. 0 μ g/血。
[003引实施例10:固体分散体 称取小築果提取物和载体聚乙締化咯烧酬（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力揽拌器揽拌至小築果提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得小築果有效提取 物PVP包合物。
[0040] 实施例11 :环糊精包合物 将β-环糊精与1-5倍水研匀，加小築果有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低溫干燥即得环糊精包合物。
[00川实施例12 :分散片 1. 小築果有效提取物分散体的制备，精密称取小築果提取物、Vc，加入处方量的十二烧 基硫酸钢，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的溫度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的小築果有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酬，预胶化淀粉， 用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边揽拌，制成湿颗粒过14目筛，室溫下放置 15min后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀 后，压片即得。
【主权项】
1. 一种小檗果提取物，其特征为小檗果经水煮沸提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离， 上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱，继用甲醇 溶剂洗脱，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提取物。2. 如权利要求1所述小檗果提取物，其特征为提取溶剂可以为甲醇、氯仿、水、甲醇、氯 仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，优选甲醇或95%乙醇，提取物提取用溶 剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。3. 如权利要求1所述小檗果提取物，其特征为小檗果经水煮沸提取，提取液浓缩后，用 硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗 脱，洗脱2-50倍柱体积，继用甲醇溶剂洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用甲醇溶剂洗脱的洗脱液 经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。4. 如权利要求1所述的维吾尔药小檗果提取物，其特征为，先用体积比为100 :100的 氯仿-甲醇混合溶剂2-50倍洗脱，继用甲醇2-50倍洗脱。5. 如权利要求1-4所述的维吾尔药小檗果提取物，其特征为：最优为先用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:100,体积比）洗脱10倍柱体积，继用甲醇溶剂洗脱20倍柱体 积。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的提取物和药学上 可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的提取物或权利要求6 所述的药物组合物。8. 如权利要求1-5任何一项所述的小檗果提取物或权利要求6所述的组合物或权利要 求7所述的药物制剂在α-糖苷酶抑制活性药物中的应用。9. 如权利要求8所述维吾尔药小檗果提取物，其特征为，所述活性可用于降血糖、减 肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。10. 如权利要求1-5任何一项所述的小檗果提取物，其特征在于，用TLC检测法，其色谱 条件为=GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=1:1: 1，显色方法：香草醛浓硫酸显 色。
【文档编号】A61K131/00GK105878327SQ201510039169
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】王金辉, 王航宇, 李国玉, 黄健, 张珂, 李珊, 张萃, 陈娟
【申请人】石河子大学