一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用，所述的美洲大蠊酶解物中的肽类物质含量高、无毒、色泽浅等优点。所述的制备方法包括加入蛋白酶水解，除油脂，离心，醇沉，大孔树脂吸附等步骤，本发明研究表明，所述的美洲大蠊酶解物还具有缩短创面修复时间、治疗消化道溃疡的效果显著的有益效果。
【专利说明】
-种美洲大酿酶解物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及医药技术领域，具体设及一种美洲大赚酶解物及其制备方法和应用。
【背景技术】 阳002] 美洲大赚（Periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲董赚目董赚科大赚属昆 虫，俗称"蜂卿"，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓"味：咸、寒；治：血疲 证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子"。"蜂卿"为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为 石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如：偷油婆、茶婆子、灶妈子等。董赚科度lattidae) 是一个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了 3. 2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。无疑 它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。
[0003] 近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对运一几千年来 无法根绝的害虫进行了应用方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了运一传统意义上 的害虫的正面价值。W美洲大赚醇提物纯化制成的产品"康复新液"，在烧伤、烫伤等外伤创 面的良好疗效，同时具有抗炎、消肿、加速病损组织修复、提高免疫力，故可W内服用于治 疗十二指肠溃瘍，胃溃瘍，肺结核。
[0004] 现代消化理论认为，蛋白质口服后不能被直接吸收进入血液，只有经过胃肠道转 化成小分子肤才能被吸收，小分子肤主要指含2~15个氨基酸残基的肤，其相对分子质量 在3000 W下，具有可直接被消化道吸收、转运速度快、耗能低和不易饱和等特点。而美洲大 赚醇提取物中主要成分除了游离氨基酸外，还有蛋白质，多肤类等大分子物质，而蛋白质运 一类大分子是不能被直接吸收进入血液的，而是需要口服后经过胃肠道的转化才能起到相 应的作用。因此，需要得到一种新的美洲大赚提取物，其包含的主要成分为可W直接被吸收 进入血液的游离氨基酸、肤类等小分子物质。
【发明内容】
[0005] 针对上述技术问题，本发明提供了一种美洲大赚酶解物。
[0006] 所述的美洲大赚酶解物中肤类成分含量高，能够被直接吸收进入血液，快速的作 用病患处。
[0007] 所述的美洲大赚酶解物为一种新的美洲大赚提取物。
[0008] 本发明的目的还在于提供所述美洲大赚酶解物的制备方法。
[0009] 本发明所述的美洲大赚酶解物的制备方法，它包括如下步骤：
[0010] (1)取美洲大赚干虫或鲜虫，粉碎后加入2~20倍原料药重量的纯水，混匀料液， 调解抑值； W11] 似向步骤（1)中所述的料液中加入原料药重量的1%~10%的蛋白酶，水解后， 过滤，冷藏去油脂后离屯、；将离屯、后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇 体积浓度为60 %~90 %，静置，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；
[0012] (3)取步骤（2)中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流 出液至流出液巧Ξ酬反应呈阴性；然后流出液再通过聚酷胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至 流出液巧Ξ酬反应呈阴性；
[0013] (4)将步骤（3)中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大赚酶解物。
[0014] 其中，步骤（1)中所述的纯水为原料药的10~20倍。
[0015] 其中，步骤似中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、膜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、 膜凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中一种或者一种W上的组合，其中蛋白酶加入量为原料药的 3% ~10%。
[0016] 其中，步骤似所述的水解溫度为20~60°C。 阳017] 其中，步骤（2)所述的水解时间为1~8小时，优选的为3. 5~8小时。
[0018] 其中，步骤（2)所述离屯、的时间为15~60分钟，速率为10000转/分~28000转 /分。
[0019] 其中，步骤似所述加入乙醇的体积浓度为90%~96%。
[0020] 其中，步骤（2)所述静置溫度为0~10°C，静置时间为12~24小时。
[0021] 其中，步骤（3)所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。
[0022] 其中，步骤（3)所述聚酷胺柱中聚酷胺的粒度为100~200目。
[0023] 本发明的目的还在于提供所述美洲大赚酶解物在消化道溃瘍、创面修复中的应 用。
[0024] 进一步地，所述消化道溃瘍为胃溃瘍。
[00巧]进一步地，所述创面为烧烫伤创面。
[00%] 本发明所述的美洲大赚酶解物中肤类成分的重量百分比能达到50% W上，且具有 缩短创面愈合时间，无毒副作用，治疗溃瘍效果好等优点。
[0027] 通过本发明提供的制备方法能够将美洲大赚中的大分子蛋白质在提取过程中直 接水解为能被吸收进入血液的小分子肤，氨基酸等有效的小分子物质，制备出的美洲大赚 酶解物具有色泽浅、腥臭味淡、患者顺应性高，药效高且快速的优点。利用本发明所述的制 备方法提高了美洲大赚提取物的产品品质，制备的药物能够更易被病患接受，且药效更好， 克服了现有美洲大赚提取物色泽深、腥臭味重W及口服后需要经过胃肠道转化才能被有效 吸收的缺陷。
[002引显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0029] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0031] 称取10kg美洲大赚鲜虫鲜料，用高速组织捣碎机处理成匀浆状，再加入100升水， 混匀，用10%的氨氧化钢调节抑值为7. 8,加入药材重量4%的弹性蛋白酶，混匀，在20°C 的溫度下保持8小时，放入冷藏室冷藏16小时，用滤纸去除上层油脂后，在28000转速下离 屯、15分钟；上清液浓缩至相对密度为60°C时的1. 20,加入体积浓度为94%的乙醇至溶液 中乙醇体积浓度达60%，在10°C静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至15升，过滤；滤 液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ 酬反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液 直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，60°C减压浓缩、干燥、粉碎，得0.71kg浅黄色粉末，即为美 洲大赚酶解物。
[0032] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占61. 7% (重量百分比）。
[0033] 实施例2本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0034] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，加100升纯水，混匀，用10 %的氨氧化钢调节 抑值为8. 0,加入药材重量3 %的膜蛋白酶，混匀，在45°C的溫度下保持3. 5小时，放入冷藏 室冷藏20小时，用滤纸去除上层油脂后，在15000转速下离屯、50分钟；上清液浓缩至相对 密度为60°C时的1. 15,加入体积浓度为95 %乙醇至溶液中乙醇体积浓度达75 %，在20°C 静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为HPD400的大孔吸 附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒 度为100目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性， 75°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 05kg浅黄色色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0035] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占58. 1% (重量百分比）。
[0036] 实施例3本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0037] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，再加入70升水，混匀，用10%的氨氧化钢调 节抑值为9. 0,加入药材重量10%的膜凝乳蛋白酶，混匀，在40°C的溫度下保持5小时，放 入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在18000转速下离屯、50分钟；上清液浓缩 至相对密度为60°C时的1. 10，加入体积浓度为92%的乙醇至溶液中乙醇体积浓度达75%， 在5°C静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至12升，过滤；滤液通过型号为X-5的大孔吸 附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒 度为200目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性， 70°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 05kg浅黄色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0038] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占57. 5% (重量百分比）。
[0039] 实施例4本发明美洲大赚酶解物的制备方法 W40] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，加水80升，混匀，用10 %的氨氧化钢调节pH 值为7. 5,加入药材重量5%的中性蛋白酶，混匀，在60°C的溫度下保持4小时，放入冷藏室 冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在20000转速下离屯、45分钟；上清液浓缩至相对密 度为60°C时的1. 05,加入体积浓度为96%乙醇至溶液中乙醇体积浓度达90%，在4°C静置 6小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至5化过滤；滤液通过型号为AB-8的大孔吸附树脂柱， 用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒度为100 目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，70°C减压 浓缩、干燥、粉碎，得0. 96kg浅黄色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0041]采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占56. 9% (重量百分比）。
[0042] 实施例5本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0043] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，加水50升，混匀，用10 %的氨氧化钢调节抑 值为7. 5,加入药材重量4%的木瓜蛋白酶，混匀，在50°C的溫度下保持5小时，放入冷藏室 冷藏12小时，用滤纸去除上层油脂后，在24000转速下离屯、30分钟；上清液浓缩至相对密 度为60°C时的1. 10,加入体积浓度为93%的乙醇至含醇量达65%，在0°C静置12小时，过 滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号为HPD100的大孔吸附树脂柱，用纯水 冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚 酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，65°C减压浓缩、 干燥、粉碎，得1. 10kg浅黄色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0044] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占53. 8% (重量百分比）。
[0045] 实施例6本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0046] 称取10kg美洲大赚鲜虫原料，用高速组织捣碎机处理成匀浆状，再加入20升水， 用10%肥L溶液调节抑值为1. 0,加入药材重量1 %的胃蛋白酶，混匀，在40°C的溫度下保 持4小时后，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在10000转速/分下离屯、60 分钟；上清液浓缩至相对密度为60°C时的1. 10,加入体积浓度为90%乙醇至溶液中乙醇体 积浓度达80%，在0°C静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至5升，过滤；滤液通过型号 为化。1的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性， 流出液再通过粒度为100目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧 Ξ酬反应呈阴性，79°C减压浓缩、干燥、粉碎，得0.56kg浅黄色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0047] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占52. 3% (重量百分比）。
[0048] 实施例7本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0049] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，再加入60升水，混匀，用10%的氨氧化钢调 节抑值为8. 0,加入药材重量1 %的膜蛋白酶和3 %中性蛋白酶，混匀，在40°C的溫度下保 持4小时，放入冷藏室冷藏12小时，用滤纸去除上层油脂后，在26000转速下离屯、35分钟； 上清液浓缩至相对密度为60°C的1. 08,加入体积浓度为96 %的乙醇至溶液中乙醇体积浓 度达85%，在8°C静置18小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号为 NK-2的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧立酬反应呈阴性，流 出液再通过粒度为100目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧Ξ 酬反应呈阴性，75°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 05kg浅黄色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0050] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占60. 2% (重量百分比）。
[0051] 实施例8本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0052] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，加水50升，混匀，用10%的氨氧化钢调节抑 值为7. 8,加入药材重量2 %的中性蛋白酶、1. 5 %膜蛋白酶W及1 %木瓜蛋白酶，混匀，在 40°C的溫度下保持2小时，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在21000转速 下离屯、30分钟；上清液浓缩至相对密度为60°C时的1. 10,加入体积浓度为90%的乙醇至 溶液中乙醇体积浓度达80%，在4°C静置16小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至7升，离屯、； 上清液通过型号为HPD600的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液 巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流 出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，75°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 02kg浅黄色粉末，即 为美洲大赚酶解物。
[0053] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占57. 3% (重量百分比）。
[0054] 实施例9本发明美洲大赚酶解物的制备方法
[0055] 称取美洲大赚干虫化g，粉碎成粉末，再加入10升水，混匀，用10%的氨氧化钢调 节抑值为8.0,加入药材重量1%的膜凝乳蛋白酶、1.5%中性蛋白酶化及1%木瓜蛋白酶， 混匀，在50°C的溫度下保持3小时，放入冷藏室冷藏20小时，用滤纸去除上层油脂后，在 12000转速下离屯、60分钟；上清液浓缩至相对密度为60°C时的1. 15,加入体积浓度为95% 的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度达70%，在8°C静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至 12升，过滤；滤液通过型号为D3520的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直 至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺 柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性，75°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 15kg浅黄 色粉末，即为美洲大赚酶解物。
[0056] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占55. 1% (重量百分比）。 阳057] 参比实施例1美洲大赚酶解物
[0058] 称取美洲大赚10kg，粉碎，加入80%的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量 为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70°C减压回收乙醇，回收50°C时相对密度为1. 05， 浓缩液于〇°C冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离屯、机里离屯、，溫 度为l〇°C，转速2000化/min,离屯、30分钟，得到的上清液在75°C减压浓缩、干燥、粉碎，即得 4. 76kg美洲大赚醇提取物。
[0059] 取上述美洲大赚醇提取物，加纯水配成含有5 %的美洲大赚醇提取物溶液，加 10%的氨氧化钢调节溶液的抑为7. 0,再加入8400U/mg的木瓜蛋白酶，在55°C条件下进行 水解3小时，将水解后的药液过滤，浓缩干燥，即得美洲大赚酶解物2. 17kg。
[0060] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚酶解物中肤类成分含 量占41.0% (重量百分比）。
[0061] 参比实施例2美洲大赚醇提物
[0062] 称取美洲大赚10kg，粉碎，加入80%的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量 为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70°C减压回收乙醇，回收50°C时相对密度为1. 05， 浓缩液于〇°C冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离屯、机里离屯、，溫 度为10°C，转速200(K)r/min，离屯、30分钟。离屯、后上清液于75°C减压浓缩、干燥、粉碎，即 为美洲大赚提取物3. 23kg，即为美洲大赚醇提物。
[0063] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚醇提物中肤类成分含 量占17. 7% (重量百分比）。 W64] 参比实施例3美洲大赚醇提物 W65] 称取美洲大赚10kg，粉碎，加入80%的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量 为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70°C减压回收乙醇，回收50°C时相对密度为1. 05， 浓缩液于〇°C冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离屯、机里离屯、，溫 度为10°C，转速200(K)r/min，离屯、30分钟；滤液通过HPD400型大孔吸附树脂柱，用纯水冲 洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性；流出液通过粒度为100目的聚酷胺 柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性；所得的流出液65°C减 压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大赚提取物1. 07kg，即得美洲大赚醇提物。
[0066] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚醇提物中肤类成分含 量占28. 9% (重量百分比）。 阳067] 参比实施例4美洲大赚水提物
[0068] 称取美洲大赚干虫10kg，粉碎，加水，浸泡1. 5小时后，水煎煮3次，每次加水量为 原药材的8倍、6倍、6倍，每次煎煮时间分别为2. 5小时，1. 5小时，1. 5小时，合并立次煎液， 过滤，滤液冷藏静置24小时后去除上层油脂，下层液在18000转速下离屯、30分钟；上清液 浓缩至相对密度为65°C时的1. 12,加入体积浓度为95 %的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度 达85 %，在5 °C静置12小时，过滤；滤液75 °C减压浓缩、干燥、粉碎，得3. 01kg深褐色粉末， 即为美洲大赚水提物。
[0069] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚水提物中肤类成分含 量占13. 9% (重量百分比）。
[0070] 参比实施例5美洲大赚水提物
[0071] 称取美洲大赚干虫10kg，粉碎，加水，浸泡1. 5小时后，水煎煮3次，每次加水量为 原药材的8倍、6倍、6倍，每次煎煮时间分别为2. 5小时，1. 5小时，1. 5小时，合并立次煎 液，过滤，滤液冷藏静置24小时后去除上层油脂，下层液在18000转速下离屯、30分钟；上清 液浓缩至相对密度为65°C时的1. 12,加入体积浓度为95%的乙醇至含溶液中乙醇体积浓 度达85%，在5°C静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为 HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液巧Ξ酬反应呈阴性， 流出液再通过粒度为100目的聚酷胺柱，用纯水冲洗聚酷胺柱，收集流出液直至流出液巧 Ξ酬反应呈阴性，75°C减压浓缩、干燥、粉碎，得1. 52kg浅褐色粉末，即为美洲大赚水提物。
[0072] 采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大赚水提物中肤类成分含 量占27. 6% (重量百分比）。 阳073] 综上，实施例1~实施例9和参比实施例1~5所用提取方法最终得到的美洲大 赚提取物中肤类成分含量比较如表1 :
[0074]
阳075] 由表1中的各实施例制备的美洲大赚酶解物中肤类成分含量得到：使用蛋白酶对 美洲大赚进行水解，得到的美洲大赚酶解物中的肤类成分含量明显高于使用普通提取方法 得到的美洲大赚醇提物和水提物中的肤类成分含量。
[0076] 其中参比实施例1与实施例的酶解工艺的区别在于：参比实施例1是将蛋白酶作 用于已经制备好的美洲大赚醇提物，而实施例中的蛋白酶是直接作用于美洲大赚；由表1 中的数据可W看出实施例1制备的美洲大赚酶解物中的肤类含量明显高于参比实施例1制 备的美洲大赚酶解物。
[0077] 表1中数据还可W得到使用本发明所述的制备方法制备的蛋白美洲大赚酶解物 中的肤类成分含量可W高达50 % W上，具有良好的市场价值。
[0078] 从表1中的数据还能得出，同为在木瓜蛋白酶作用下制备的美洲大赚酶解物，实 施例5得到的美洲大赚酶解物中的肤类含量为53. 8%，而参比实施例1所述的方法制备的 美洲大赚酶解物中的肤类含量为41. 0%，由此说明本发明所述的制备方法制备的美洲大赚 酶解物中的肤类含量高。
[0079] W下将通过实验例对本发明所述的美洲大赚酶解物的有益效果进行进一步说 明：
[0080] 实验例1本发明所述美洲大赚酶解物对小鼠的急性毒性及半数致死剂量
[0081] 一、实验材料
[0082] 1.实验药物：实施例1和参比实施例5制备的美洲大赚酶解物。 阳〇8引 2.实验动物：
[0084] 实验动物：昆明种小鼠，SPF级（立级）合格动物。 阳0财 3.实验试剂
[0086] 氯化钢注射液（0. 9% )，其它试剂均为市售，分析纯。
[0087] Ξ、实验方法与结果
[0088] 预试验：取体重18~22g小鼠70只，雌雄各半，按体重随机分成7组，每组10只， 自由饮水，禁食6小时后，其中3组按0.41111/10邑体重分别1邑70%、56%、45%实施例1制 备的美洲大赚酶解物液体，另外3组按0. 4ml/10g体重分别ig 70%、56%、45%参比实施 例5制备的美洲大赚水提物液体，对照组ig等体积生理盐水，观察小鼠给药后毒性反应及 死亡情况，观察7天，每天一次，结果见表2 :
[0089] 表2毒性结果
[0090]
[0091] 由表1中的数据可W看出，在同体积同浓度的美洲大赚提取物灌胃小鼠的实验结 果比较中得到：参比实施例5的总体的死亡率比实施例1总体死亡率高，初步说明参比实施 例5制备的美洲大赚水提物的毒性比实施例1制备的美洲大赚酶解物的毒性大。
[0092] W下将根据表1所述死亡情况，进行实施例1和参比实施例5制备的美洲大赚酶 解物和美洲大赚水提物对小鼠半数致死剂量（LDJ测定。
[0093] 1. 1对小鼠的半数致死剂量（LDJ测定：
[0094] 1. 1. 1试验方法 阳0巧]取体重在20~2?之间的小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分成6组，每组10只， 禁食不禁水化，各组分别ig实施例1制备的美洲大赚酶解物30. 4g/kg、27. 4g/kg、24. 6g/ kg、22. 2g/kg、19. 9g/kg、0g/kg(NS 0. 4ml/10gb. w.)，按不同浓度同体积给药，0. 4ml/10g ig，观察14天，每天一次，记录逐日的小鼠毒性反应及死亡数，死亡动物即时尸体解剖，肉 眼观察各主要脏器，取屯、、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器，10%甲醒固定，病理切片检查。存活 动物至实验结束处死，取主要脏器病理检查。
[0096] 同上述试验方法对参比实施例5制备的美洲大赚水提物进行小鼠急性毒性实验 处理，观察17天，做好相应记录。
[0097] 1. 1. 2试验结果
[0098] 1. 1. 2. 1实施例1制备的美洲大赚酶解物：
[0099] (1)给予一次大剂量（30. 4g/kg) ig小鼠后，小鼠出现的症状反应为：大多小鼠活 动减少，俯邸，对外界刺激反应迟缓，皮肤体溫略有下降，部分动物翻正反射消失，呼吸频率 减慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1~8小时内死亡情况见表3,存活动物上述症状反应在 10~14小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活14天未 见异常情况出现。
[0100] 似死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，仅胃肠内有大量 清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取屯、、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10%甲 醒固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，胃的损伤主要体现在胃黏膜开始脱 落，未见出血症状。 阳101] 做给药后恢复14天小鼠的解剖结果：屯、、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病 变。由此说明实施例1制备的美洲大赚酶解物造成的小鼠屯、、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器 的损伤有自愈的可能。 阳102] 1. 1. 2. 2参比实施例5制备的美洲大赚水提物： 阳103] (1)给予一次大剂量（30. 4g/kg)ig小鼠后，小鼠出现的症状反应为：大多小鼠 活动减少，俯邸，对外界刺激反应迟缓，部分动物皮肤溫度下降，翻正反射消失，呼吸频率减 慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1~5小时内死亡情况见表3,存活动物上述症状反应在 18~24小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活17天未 见异常情况出现。
[0104] 似死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，胃肠内有大量清 稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取屯、、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10%甲 醒固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，胃的损伤主要体现在胃黏膜坏死脱 落，且有出血症状。
[0105] 0)给药后恢复17天小鼠的解剖结果：屯、、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病 变。 阳106] 1. 1. 2. 3实施例1和参比实施例5所述的药物对小鼠的LDw测定结果如表3和表 4 阳107] 表3实施例1制备的美洲大赚酶解物对小鼠的LDg。 阳10引
阳109] 根据表3中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明实施例1所述的美洲大赚酶 解物对小鼠的〇)5。=28.7邑/1^山〇5。的95%可信区间：27.0邑/1^~30.3邑/1^。
[0110] 表4参比实施例5制备的美洲大赚水提物对小鼠的LDw 阳 111]
[0112] 根据表4中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明参比实施5所述的美洲大赚 水提物对小鼠的LDs〇= 25. Og/kg ;LD 5。的95%可信区间：23. 4g/kg~26. 6g/kg。综上，水 提法来制备美洲大赚提取物，得到的提取物对小鼠的半数致死量LDw(参比实施例5)小于 使用酶解法制备的美洲大赚提取物对小鼠的半数致死量LDw(实施例1)，由此说明本发明 所述的美洲大赚酶解物在无毒性药物范围内，安全可靠。
[0113] 实验例2创面修复试验 阳114] 1对小鼠实验性烫伤的影响 阳11引分组：
[0116] 取体重18~22g小鼠80只，雌雄各半，按性别与体重随机分为8组，分别为NS对 照组，湿润烧伤膏对照组，给药组1~6 (实施例1~4所述的美洲大赚酶解物和参比实施 例2~5制备的美洲大赚提取物）。
[0117] 试验方法：
[0118] 将小鼠置于固定器内，小鼠右后足巧部位置于预先调至55°C恒溫水浴中15秒，此 后每隔半小时各组小鼠分别于右足巧部涂相对应的药物1次，共给药3次，4. 5小时后将小 鼠脱颈椎处死，于同一部位剪下两足巧部，用精密扭力天平称重，W每鼠右足重减去左足重 量为肿胀度，将对照组和给药组的肿胀程度进行比较和统计学处理。结果见表5。
[0119] 表5提取物对小鼠实验性烫伤的影响传±甜) 阳 120]
阳121] 注：*:P<0. 05与湿润烧伤膏组比较；**:P<0. 01与对照组比较
[0122] 结果显示，本发明所述实施例1-4制备的美洲大赚酶解物对热水烫伤致小鼠足巧 的肿胀度有不同程度的降低，数据显示实施例1-4与湿润烧伤膏组比较P<0. 05,具有显著 的统计学意义。而参比实施例2-5与湿润烧伤膏组比较不具有统计学意义。进而说明本发 明所述的美洲大赚酶解物对烫伤具有良好的保护和治疗作用。 阳123] 2对小鼠实验性烧伤的影响
[0124]分组： 阳12引取体重18~22g小鼠80只，雌雄各半，将中间挖空2cmX2cm的石棉纸置于小鼠 背上，用微量移液器吸取lOOuL无水乙醇滴于20mg棉球上，置于暴露处，点火燃烧造成II度 烧伤模型。按性别与烧伤面积随机分为8组，分别为NS对照组，湿润烧伤膏对照组，给药组 1~6 (实施例1~4和参比实施例2~5制备的美洲大赚提取物）。
[0126] 实验方法： 阳127] 各组分别涂药，连续涂20d，每天2次，换药前将创面清洗干净。观测小鼠烧伤面积 和愈合情况，给药6天与13天，分别用数码相机拍照，用IPP5. 1图像分析软件包测量各组 动物烧伤面积。将所测结果进行t检验。结果见表6。 阳1測表6提取物对小鼠实验性烧伤的影响+S货 阳 129]
阳130] 注：*:P<0. 05与湿润烧伤膏组比较；**:P<0. 05与对照组比较 阳131] 结果显示，与对照组比较，给药4天、给药10天，实施例1-4制备的美洲大赚酶解 物对小鼠的创面结挪面积有一定的减少，且与湿润烧伤膏组相比具有显著的统计学意义， P<〇. 05,实施例1-4制备的美洲大赚酶解物还能使创面愈合时间大大的缩短。与对照组相 比，参比实施例2-5制备的美洲大赚提取物（美洲大赚醇提物和美洲大赚水提物）对小鼠 的创面结挪面积也有一定的减少，但是与湿润烧伤膏相比没有统计学意义。所W，本实验例 表4中的结果说明本发明所述的美洲大赚酶解物对小鼠实验性烧伤有明显的治疗作用，且 效果显著。 阳132] 实验例3本发明所述的美洲大赚酶解物对乙醇致小鼠溃瘍的影响 阳133] 1、实验材料
[0134] (1)受试药物及分组
[0135] 实验分为随机分为8个组，每组动物10只，每组小鼠按照0. 05g/ml/20g体重给 药，具体分组情况如下： 阳136] 空白对照组：纯水；
[0137] 阳性药物组：达喜（侣碳酸儀片），生产企业：拜耳医药保健有限公司；
[013引治疗组1:实施例1所述的美洲大赚酶解物；
[0139] 治疗组2 :实施例5所述的美洲大赚酶解物；
[0140] 治疗组3 :参比实施例1所述的美洲大赚酶解物；
[0141] 治疗组4 :参比实施例3所述的美洲大赚醇提物；
[0142] 治疗组5 :参比实施例5所述的美洲大赚水提物； 阳143] 0)实验动物 阳144] 小鼠80只，KM种，SPF级，体重20~24g，雌雄各半，由成都达硕生物科技有限公 司提供
[0145] 2、实验方法 阳146] 2. 1药液的制备
[0147] 将上述受试药物，分别制成浓度为0. 05g/ml的药液；
[0148] 2. 2对胃溃瘍粘膜的保护功能评价方法
[0149] 2. 2. 1无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤模型试验
[0150] 将各组小鼠常规饲养3天后，按1ml/只进行灌胃给药，每天给药一次，连续10天， 动物每3~4天称重一次，根据体重调整给药体积。 阳151 ] 第9天给药后禁食2地，自由饮水，末次给药后比，所有动物均ig无水乙醇0. 2ml/ 只，1小时后处死动物，结扎幽口，1%甲醒固定，再结责口，将胃剪下，放入10%甲醒溶液中 浸泡1小时。沿胃大弯剖开胃，肉眼可见溃瘍发生在胃窦部。将胃窦部剪下，采用数码相机 拍照记录，将数码照片用Image-Pro Plus 6.0软件处理，记录溃瘍区域面积和整个胃窦部 面积，计算各小鼠的溃瘍指数和溃瘍抑制率。 阳152] 溃瘍指数（％)=溃瘍区域面积/胃窦部面积X 100。
[0153] 溃瘍抑制率（％) = (空白对照组溃瘍指数-各给药组溃瘍指数）/空白对照组溃 瘍指数X 100。 阳154] 2. 2. 2统计方法
[0K5] 数据采用^ ±S;表示，用SPSS 20. 0软件进行统计，进行完全随机设计资料的方差 分析和多重比较的统计分析，满足正态性和方差齐性采用Dunett检验， 阳156] 否则采用Tamhane' S T2检验。 阳157] 3、实验结果
[0158] (1)对小鼠体重的影响
[0159] 各组小鼠连续给药10天，对小鼠体重的影响，结果见表7。 阳160] 表7对小鼠体重的影响（丈± S，g3
[0161]
阳16引 由表7可知，阳性药物组和治疗组与空白对照组比较，在各时间点对小鼠体重的 影响无显著性差异，P〉〇. 05。 阳163] 似对无水乙醇致小鼠胃溃瘍的影响，结果见表8。 阳164] 表8乙醇致小鼠胃溃瘍的影响（丈+S) 阳1化]
[0166] 注：与空白对照组比较，*表示P<0. 05, **表示P<0. 01 ;与阳性药物组比较，#表 示 P<0.05 阳167] 由表8中的结果得知：实施例1和实施例5制备的美洲大赚酶解物对乙醇致小鼠 的胃溃瘍的抑制率分别为73. 64 %、63. 06 %，是整个实验中抑制率最高的两组；与空白对 照组比较均具有明显的统计学意义，P<〇. 01，与阳性药物组（达喜）比较也均具有明显的统 计学意义，P<〇.〇5。 阳168] 治疗组2 (实施例5)与治疗组3 (参比实施例1)相比较，实施例5制备的美洲大 赚酶解物对乙醇致小鼠的胃溃瘍的抑制率明显高于参比实施例1制备的美洲大赚酶解物 对乙醇致小鼠的胃溃瘍的抑制率，说明实施例5制备的美洲大赚酶解物具有显著的进步。
[0169] 由实验例3中的结果得到，本发明所述的美洲大赚酶解物具有很好的保护胃黏膜 的功能。
[0170] 综上所述，本发明所述的美洲大赚酶解物中肤类成分含量高，色泽浅、腥臭味淡， 毒性低，且能够在缩短创面愈合时间、在治疗烧烫伤W及溃瘍具有显著疗效。
【主权项】
1. 一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，它是由蛋白酶处理美洲大蠊虫体后得到的。2. 根据权利要求1所述的美洲大蠊酶解物，其特征在于，所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰 蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中一种或者一种以上的组合。3. 权利要求1-2中所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，它包括如下 步骤： (1) 取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2~20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解 pH值； (2) 向步骤（1)中所述的料液中加入原料药重量的1%~10%的蛋白酶，在20~60°C 温度下水解后，过滤，冷藏去油脂后离心；将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至 所得溶液中乙醇体积浓度为60%~90%，在0~KTC，静置12~24小时后，过滤，滤液回收 乙醇，得回收乙醇后的滤液； (3) 取步骤（2)中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至 流出液茚三酮反应呈阴性；然后流出液再通过粒度为100~200目的聚酰胺柱，纯水冲洗， 并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性； (4) 将步骤（3)中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。4. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所 述的纯水为原料药的10~20倍。5. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述 的蛋白酶加入量为原料药的3%~10%。6. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述 的水解时间为1~8小时，优选的为3. 5~8小时。7. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述 离心的时间为15~60分钟，速率为10000转/分~28000转/分。8. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述 加入乙醇的体积浓度为90%~96%。9. 根据权利要求3所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤（3)所述 吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。10. 权利要求1~12所述的美洲大蠊酶解物在消化道溃疡、创面修复中的应用。
【文档编号】A61P17/02GK105878287SQ201510375515
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年6月30日
【发明人】陈光健
【申请人】陈光健