糖蛋白激素长效超激动剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供糖蛋白激素的长效、超活性类似物，其与野生型对应物相比在体外和体内都展示增强的生物活性。所述类似物特别地用于治疗显示低受体表达或差的受体响应性的受试者，且用于治疗任何与糖蛋白激素活性相关的病况。
【专利说明】
糖蛋白激素长效超激动剂
技术领域
[0001] 本发明大体涉及具有超激动剂活性的被修饰的糖蛋白激素，以及其在治疗与糖蛋 白激素活性相关的病况中的用途。更具体地，本发明涉及被修饰的糖蛋白分子，其与野生型 a亚单位相比在a亚单位中含有氨基酸取代和一个或多个插入的肽，其中此类被修饰的分子 与野生型糖蛋白相比展现增强的药理学性质。
【背景技术】
[0002] 促性腺素促滤泡素(促卵泡激素，FSH)和绒毛膜促性腺素(CG)、促黄体激素(黄体 化激素，LH)和促甲状腺素（甲状腺刺激激素，TSH)构成糖蛋白激素家族。各激素为两个非共 价连接的亚单位，即a亚单位和0亚单位的杂二聚体。在相同的物种内，a-亚单位的氨基酸序 列在所有激素中都相同，而0 _亚单位的序列是激素特异性的（P i e r c e， Ann. Rev. Biochem. 50:465-495(1981))。所述亚单位的序列从鱼到哺乳动物高度保守的事 实暗示这些激素由共同的祖先蛋白进化而来(Fontaine，Gen. Comp. Endocrinol. 32 :341-347(1977))。糖蛋白激素在整个动物谱中的普遍存在也指示所述激素或所述激素的任何修 饰形式被用于各种物种中的巨大潜力。
[0003]之前关于被修饰的糖蛋白激素的研究已揭示令人鼓舞的数据。例如，除了提供具 有增加活性的被修饰的糖蛋白激素之外，进一步的突变还证明受体亲和结合的增加(参见 例如W0 2005/089445和W0 2005/101000)。然而，尽管亲和力增加，但研究证明被修饰的糖 蛋白激素的清除即使不比它们的野生型对应物快，也与它们的野生型对应物一样快。为了 产生具有增强活性的临床有用的超激动剂，被修饰的糖蛋白超激动剂除了应当具有改善的 受体结合亲和力之外，还应具有改善的生物半衰期。然而，之前进一步修饰糖蛋白激素以增 加半衰期和改善生物利用度的尝试不太令人满意，而是被修饰的糖蛋白激素仅展示减弱的 响应。
【发明内容】
[0004] 本发明涵盖被修饰的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亚单位的Q13、E14、P16 或Q20处具有至少一个保守的碱性氨基酸取代且在D3和Q5之间具有VNVTINVT(SEQ ID NO: 20)的插入片段的氨基酸序列。
[0005] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素在Q13、P16和Q20处包含至少两个或至少 三个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素进一步在E14处包含碱性氨 基酸取代。在一些实施方案中，碱性氨基酸为精氨酸。
[0006] 在一些实施方案中，a亚单位包含与SEQ ID N0:11具有至少85%同一性的氨基酸 序列且进一步包含黄体化激素(LH)的0亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的0亚单位、促卵泡激 素(FSH)的0亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的0亚单位。在一些实施方案中，a亚单位衍生自 人a亚单位（SEQ ID N0:6)。
[0007] 本发明涵盖被修饰的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亚单位的K15、K17、K20 或K24具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID N0:1)的插 入片段的氨基酸序列。
[0008] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素在K15、K17、K20和K24处包含至少两个、 或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素进一步 在E18处包含碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，碱性氨基酸为精氨酸。
[0009] 在一些实施方案中，a亚单位包含与SEQ ID N0:7具有至少85%同一性的氨基酸序 列且进一步包含黄体化激素(LH)的0亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的0亚单位、促卵泡激素 (FSH)的0亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的0亚单位。
[0010] 本发明涵盖被修饰的糖蛋白激素，其包含在糖蛋白激素的a亚单位的K15、E18、K20 或K24处具有至少一个保守碱性氨基酸取代，且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID N0:1)的 插入片段或具有在F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之间INV的插入片段的氨基酸序 列。
[0011] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素在K15、E18、K20和K24处包含至少两个、 或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素在a亚单 位的F6和T7之间包含NVTINV(SEQ ID N0:1)的插入片段。在一些实施方案中，被修饰的糖蛋 白激素包含a亚单位的F6和T7之间的NV插入片段加上T7和T8之间的INV插入片段。在一些实 施方案中，碱性氨基酸为精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，碱性氨基酸为精氨酸。
[0012] 在一些实施方案中，a亚单位包含与SEQ ID N0:4具有至少85%同一性的氨基酸序 列且进一步包含黄体化激素(LH)的0亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的0亚单位、促卵泡激素 (FSH)的0亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的0亚单位。在一些实施方案中，a亚单位衍生自马 a亚单位（SEQ ID N0:4)。
[0013]本发明还涵盖被修饰的糖蛋白激素，其包含在a亚单位的a-Ll环中具有至少一个 碱性氨基酸取代且在a亚单位的N-末端附近具有一个或多个插入片段的氨基酸序列，其中 与野生型糖蛋白激素相比所述插入片段向a亚单位中引入NXINXASNNXA糖基化位点， 并且Xi、X 2、X3和X4独立地为任何氨基酸。
[0014] 在一些实施方案中，每个插入片段包括一个或多个NXiTSNXA糖基化位点，其中Xi 和X2独立地为除脯氨酸以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，插入片段向a亚单位中引入 NXANX2S或NNX 3X4位点，但NXANX2S或NNX3X4引入位点中的至少一个氨基酸不是插入片段 的一部分。在一些实施方案中，插入片段在野生型糖蛋白激素a亚单位的F6和T7之间。在一 些实施方案中，插入片段可以向a亚单位中引入NNX 3X4糖基化位点，其中X3和X4独立地为T或 So
[0015] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素在野生型糖蛋白激素a亚单位的15、17、 18、20或24氨基酸位置处包含至少一个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，被修饰的糖蛋 白激素在野生型糖蛋白激素a亚单位的151(、171(/176/171、181(/18￡、201(或241(氨基酸位置处 包含至少一个碱性氨基酸取代。
[0016]本发明还涵盖被修饰的糖蛋白激素，其包含被修饰的a亚单位且进一步包含黄体 化激素(LH)的0亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的0亚单位、促卵泡激素(FSH)的0亚单位或甲 状腺刺激激素(TSH)的0亚单位。
[0017] 在一些实施方案中，a亚单位衍生自野生型人a亚单位(SEQ ID N0:6)、野生型牛a 亚单位（SEQ ID NO: 2)、野生型猪a亚单位（SEQ ID NO: 5)和野生型绵羊a亚单位（SEQ ID N0:3)、野生型犬a亚单位（SEQ ID N0:47)、野生型猫a亚单位（SEQ ID N0:50)、野生型兔a亚 单位（SEQ ID N0:53)、野生型山羊a亚单位（SEQ ID N0:55)、野生型负鼠（didelphine)a亚 单位（SEQ ID NO: 57)、野生型鲤鱼a亚单位（SEQ ID NO: 67)、野生型大马哈鱼a亚单位（SEQ ID N0:69)、野生型马a亚单位（SEQ ID N0:4)、野生型鸡a亚单位（SEQ ID N0:59)、野生型火 鸡a亚单位（SEQ ID N0:61)、野生型鸵鸟a亚单位（SEQ ID N0:63)、或野生型鲶鱼a亚单位 (SEQ ID N0:65)。
[0018]本发明涵盖用于在动物中刺激糖蛋白激素受体的方法，其包括向所述动物施用上 述被修饰的糖蛋白激素。所述动物可以是哺乳动物、鸟类或鱼类，并且可以包括但不限于 牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额 牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛、牦牛、鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡、鸵鸟、鲤鱼、 大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
【附图说明】
[0019]图1显示用通过瞬时转染产生的所选bFSH类似物在CH0-FSHR细胞中的cAMP刺激。 图1A显示？〇丨丨比€^11?，(口?311)士?311-11'(野生型）与匕?311-51?类似物的比较。图18显示通过 两个N-端延伸物(ANITV，NITV)和一个内部新糖基化(V78N)对hFSH-TR4402类似物（瞬时 4402)的体外生物活性的减弱（SPA cAMP测试）。图1C显示bFSH-5R类似物与插入片段1(5R+ 插入片段1)和插入片段2(5R+插入片段2)的比较。
[0020]图2A和2B显示小鼠在单一皮下注射后各种bFSH类似物的PK筛选测试。在各实验 中，将5只小鼠用于各制备物。在注射后24h、32h和48h获取血样，扣除血浆水平并且将数据 表示为注射剂量的％ (ID%)。使用FSH ELISA(Endodrine Technologies)测定血浆样品中 的FSH水平。
[0021]图3A-D显示TR55601产生的不同批次（lot)的分析。图3A显示使用IEF、然后使用蛋 白质印迹进行的电荷异质性分析。批次3(泳道2和3)的次佳唾液酸化作用（Suboptimal sialylation)明显不同于批次4(泳道5和6)中检测到的最佳高度酸性亚型。泳道1，IEF 3-10标记；泳道2，TR55601/批次 3(8yg);泳道3，TR55601/批次3(4yg);泳道4和 8，TR4401(ly g);泳道5，TR55601/批次4(8yg);泳道6，TR55601/批次4(4yg);泳道8，IEF 3-10标记。图3B 显示使用神经氨酸酶(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、IEF和蛋白质印迹对带电荷的亚型的 分析。未处理的TR55601/批次4样品（泳道2和3)和在施加至3-10IEF凝胶之前用神经氨酸酶 处理的TR55601/批次4样品（泳道4-6)。泳道1，IEF 3-10标记；泳道2,未处理的TR55601/批 次4(8yg);泳道3,未处理的TR55601/批次4(4yg);泳道4,处理的TR55601/批次4(4yg);泳道 5,处理的TR55601/批次4(2yg);泳道6,处理的TR55601/批次4(lyg)。神经氨酸酶消化的亚 型的IEF曲线已位移至7.8至10.0的pi范围。pi的平均位移为约5个pH单位且多个带(接近10 个带)转化为一个主要带(pi~9.5)和三个次要带(pi 7.8-10.0)，这表明大多数观察到的 电荷异质性(图3A-批次4)依赖于末端唾液酸残基以及具有其它修饰如脱酰胺化和/或蛋白 水解降解的次要组分。3B中所示的残余碱性带(pi 4.8-5.5)为非特异性的，源自神经氨酸 酶制备物。图3C显示通过pi梯度凝胶中的IEF 3-10(IEF 3-10)、然后通过蛋白质印迹对 TR55601-批次5的带电荷亚型的分析。泳道1，IEF 3-10标记；泳道2，TR55601-批次5(4yg); 泳道3，TR55601-批次5(4yg);泳道4，TR55601-批次4(4yg);泳道5，TR55601-批次4(8yg);泳 道6，TR55601-批次3(4yg);泳道7，TR55601-批次3(8yg)。图3D图解说明相比于TR55601批次 4和Fol-V对TR55601批次5的SDS-蛋白质印迹分析。泳道1，蛋白质标记；泳道2:批次4， 500ng;泳道3:批次5，lul;泳道4:空泳道；泳道5:批次4，4ug;泳道6 :批次5，15ul;泳道7 : Fol-V，673ng;泳道8:蛋白质标记。
[0022]图4显示在不成熟（22天龄）Sprague-Dawley雌性大鼠中对于卵巢重量的hCG增加 的经典Steelman-Pohley生物测定的结果。在给药后72小时测量卵巢重量。数据表示为两个 卵巢的平均总卵巢重量+SEM(每次给药每组n = 5)。大鼠用补充有40IU hCG的测试制品或媒 介物的一次单一注射刺激。使用以下剂量组:组1仅接受hCG(无FSH)，组2-5接受TR55601批 次4(从左至右分别为0 ? 33yg、1 ? 〇yg、3 ? 33yg和l〇yg，），组6-8接受F〇ntropin?-V(从左至右 分别为3，333yg、10，OOOyg和30，OOOyg)，且组9-10接受TR4401 (1 ? Oyg和3 ? 33yg)。
[0023] 图5展示超数排卵、诱导排卵和固定时间人工受精的卵泡波同步方案。 Folltropin-VR(Bioniche)的8次注射用单次或双次注射TR55601代替。
[0024] 图6显示肉用母牛(beef cow)在超刺激处理过程中卵泡(直径3至5mm)的平均数， 所述肉用母牛用通过单一肌内注射给予的60yg rFSH治疗，或以每天两次肌内注射给予的 300mg Folltropin-V(对照）治疗4天（组合3次实验）。
[0025] 图7显示肉用母牛在超刺激处理过程中直径6至8mm的卵泡的平均数，所述肉用母 牛用通过单一肌内注射给予的60yg rFSH治疗，或以每天两次肌内注射给予的300mg Fo 11 tropin-V(对照）治疗4天(组合3次实验）。
[0026]图8显示肉用母牛在超刺激处理过程中直径>9mm的卵泡的平均数，所述肉用母牛 用通过单一肌内注射给予的60yg rFSH治疗，或以每天两次肌内注射给予的300mg Fo 11 trop in-V (对照）治疗4天(组合3次实验）。
[0027]图9显示肉用母牛在超刺激处理过程中直径2 3mm的所有卵泡的平均直径曲线，所 述肉用母牛用通过单一肌内注射给予的60yg rFSH治疗，或以每天两次肌内注射给予的 300mg Folltropin-V(对照）治疗4天（组合3次实验）。
[0028]图10A显示对于人a亚单位中的插入片段(A2)、没有氨基端缬氨酸的插入片段(插 入片段2)、没有插入片段的仅5个精氨酸取代(5R)和仅介质对照的cAMP产生的比较。图10B 显示三个测试的构建物的EC50。
[0029]图11A显示响应于具有SEQ ID NO: 1插入片段的人被修饰a亚单位和缺少所述插入 片段的牛被修饰a亚单位的cAMP产生的比较。图11B显示响应于有和没有各种插入片段的人 被修饰a亚单位和牛亚单位的cAMP产生的比较。
[0030] 图12显示基于稳定表达野生型大鼠LH受体(rLHR)的HEK 293细胞中的cAMP刺激的 eCG类似物(2号、3号和4号）的体外LH生物活性。
[0031]图13显示基于表达大鼠LH受体(r LHR)的MLTC-1细胞中的孕酮刺激的e CG类似物(2 号、3号和4号）的体外LH生物活性。
[0032] 图14显示基于稳定表达野生型人FSH受体(hFSHR)的CH0细胞中的cAMP刺激的eCG 类似物(2号、3号和4号）的体外FSH生物活性。
【具体实施方式】
[0033]本发明提供被修饰的超活性糖蛋白激素分子，其与它们的野生型对应物相比令人 惊奇地显示增强的效力和增加的生物半衰期。被修饰的意思是，虽然所述蛋白质含有不同 于野生型糖蛋白激素的氨基酸序列，但是该序列已被改变成使得它与另一物种的已知糖蛋 白激素序列不同。可以根据各种参数来评估超活性，包括效力和功效。"效力(potency)"是 通过测量半最大响应所确定的生物活性的参数。通过比较糖蛋白激素类似物在基线和最大 值(EC 50)之间的中间值的糖蛋白激素响应值与野生型糖蛋白激素的糖蛋白激素响应值来 确定效力差异。可以使用纯化的蛋白质在体外测量糖蛋白激素响应，或者可以在瞬时转染 编码修饰蛋白质的核酸之后估计糖蛋白激素响应。还可以在体内、即在对所述糖蛋白激素 类似物有响应的动物体内测量糖蛋白激素响应。此类响应涵盖糖蛋白激素与其受体结合的 任何已知的细胞的或生物学的以及定量的或定性的响应，例如cAMP产生、蛋白质如孕酮的 合成、受精率、胚泡形成率、每个受精卵母细胞的胚胎发育等。"功效(efficacy)"（Vmax)或 最大响应是生物活性的另一参数。如在本文中所讨论的，生物活性的参数可以根据所测定 细胞系中的受体数目和受体偶联而改变。在具有低受体数目或偶联受损的系统中，Vmax(功 效)上的差异更易辨别。在受体过度表达的系统中，效力上的差异更为明显。
[0034]例如，在被修饰的糖蛋白激素为被修饰的FSH或CG分子的情况下，可以在对于卵母 细胞数目而言的最大有效剂量下测量体内定量和定性的参数如卵母细胞的数量、受精率和 胚泡及胚胎形成率。对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量是对卵母细胞的质量和数量而 言均为最佳量的超活性FSH。对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量依赖于动物的体重和 代谢速率。例如，具有较慢代谢速率的较大动物的最大有效剂量大于具有较快代谢速率的 较小动物的最大有效剂量。经验性地确定每只动物的最大有效剂量。
[0035]然而，无论所使用的系统如何，与野生型对应物相比，本发明的被修饰的超活性糖 蛋白激素蛋白质可以展示效力至少约2至10倍的增加或效力至少约20倍、30倍、40倍、50倍、 60倍、70倍、80倍、90倍或甚至100倍的增加，或与野生型对应物相比，本发明的被修饰的超 活性糖蛋白激素蛋白质可以展示最大功效约2 %至10 %的增加，或最大功效至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、甚至100%的增加。与野生型FSH相比，本发明的超 活性类似物还可以提供效力约5至10倍的增加或最大功效5%至10%的增加。与野生型相 比，本发明的一些被修饰的蛋白质可以展示效力至少约30至50倍的增加或最大功效30%至 50%的增加。因此，本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质可以用于治疗具有低受体数目或 受体响应缺陷的受试者，因为本发明的被修饰蛋白质即使在具有低受体数目或响应的系统 中也可以维持效力至少10倍的增加或最大功效10%的增加。
[0036]被修饰的超活性糖蛋白激素的吸收速率可以导致增加的作用持续时间。具有降低 的吸收速率和增加的作用持续时间的被修饰的糖蛋白激素类似物可以有益于敏感度减弱 的受试者，如患有生育障碍的那些受试者。吸收速率通过1测量。消除速率通过IU则量。
[0037]本发明的被修饰的糖蛋白激素分子包括所有动物物种如哺乳动物、鸟类和鱼类的 被修饰蛋白质：作为示例，被修饰的糖蛋白激素可以包括源自人、牛、犬、猫、马、猪、绵羊、 虎、狮、熊猫、负鼠、兔、鼠、鸟或鱼a亚单位的a亚单位。鱼糖蛋白激素（也被称为GTH-1)可以 用于水产业，即，以辅助濒危的或其它鱼类物种的圈养生长。其它物种的被修饰的糖蛋白激 素可以用于农业育种，并且可以进一步用于实验室环境以测试不同组合的突变对各种雄性 和雌性糖蛋白激素相关病况的作用。本发明的被修饰的糖蛋白激素还可以用于濒危物种诸 如但不限于虎、狮和斑马的保护和促进。
[0038]被修饰的糖蛋白激素可以包含源自野生型a亚单位的突变的a亚单位。在一些实施 方案中，所述a亚单位源自野生型人a亚单位(SEQ ID N0:6)、野生型牛a亚单位(SEQ ID N0: 2)、野生型猪a亚单位(SEQ ID NO:5)和野生型绵羊a亚单位(SEQ ID NO:3)、野生型犬a亚单 位（SEQ ID NO:47)、野生型猫a亚单位（SEQ ID NO:50)、野生型兔a亚单位（SEQ ID NO:53)、 野生型山羊a亚单位（SEQ ID NO:55)、野生型负鼠a亚单位（SEQ ID NO:57)、野生型鲤鱼a亚 单位（SEQ ID N0:67)、野生型大马哈鱼a亚单位（SEQ ID N0:69)、野生型马a亚单位（SEQ ID N0:4)、野生型鸡a亚单位（SEQ ID N0:59)、野生型火鸡a亚单位（SEQ ID N0:61)、野生型鸵 鸟a亚单位(SEQ ID N0:63)或野生型鲶鱼a亚单位(SEQ ID N0:65)。
[0039]被修饰的糖蛋白激素分子可以在对应于本文公开的被修饰的人(例如SEQ ID NO: 11)、牛（例如SEQ ID N0:7)、犬（例如SEQ ID N0:48)、猫（例如SEQ ID N0:51)、马（例如SEQ 10勵:9)、猪（例如3￡〇10勵：10)、绵羊（例如3￡〇10勵 :9)、负鼠（例如3￡〇10勵：58)、兔 (例如SEQ ID N0:54)、鸟（例如SEQ ID N0:60、62和64)和鱼（例如SEQ ID N0:66、68、70和 71)的糖蛋白激素分子的位置处具有取代，其可以使用任何比对程序鉴定，包括但不限于 DNASIS、ALIONment、SIM 和 GCG 程序如 Gap、BestFi t、FrameAl ign 和 Compare 〇
[0040] 本发明的被修饰的糖蛋白激素分子至少包含被修饰的a-亚单位，其中所述a亚单 位在所述a亚单位的a-Ll环中包含至少一个碱性氨基酸取代。在人a亚单位中，碱性氨基酸 可以在野生型人a亚单位(SEQ ID N0:6)的13、14、16和/或20位被引入。在其它物种中，碱性 氨基酸可以在对应于野生型牛a亚单位(SEQ ID N0:2)、野生型猪a亚单位(SEQ ID N0:5)和 野生型绵羊a亚单位（SEQ ID NO: 3)、野生型犬a亚单位(SEQ ID N0:47)、野生型猫a亚单位 (SEQ ID N0:50)、野生型兔a亚单位（SEQ ID N0:53)、野生型山羊a亚单位（SEQ ID N0:55)、 野生型负鼠a亚单位(SEQ ID N0:57)、野生型鲤鱼a亚单位(SEQ ID N0:67)和野生型大马哈 鱼a亚单位（SEQ ID N0:69)的15、17、18、20和/或24位；野生型马<1亚单位（5￡〇10勵:4)的 15、18、20和/或24位；野生型鸡a亚单位（SEQ ID N0:59)、野生型火鸡a亚单位（SEQ ID NO: 61)和野生型鸵鸟a亚单位(SEQ ID N0:63)的15、17、18和/或24位；以及野生型鲶鱼a亚单位 (SEQ ID N0:65)的12、14、15、17和/或21位被引入。在一些实施方案中，碱性氨基酸可以是 精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸。在一些实施方案中，碱性氨基酸可以是精氨酸和/或组氨酸。 在一些实施方案中，碱性氨基酸可以是精氨酸。
[0041] 本发明的被修饰的糖蛋白激素分子可以在a亚单位的N-末端附近包含一个或多个 插入片段。与野生型糖蛋白激素相比所述插入片段向a亚单位中引入NXlNXsSSNNXA糖 基化位点，并且Xi、X 2、X3和X4独立地为任何氨基酸。在一些实施方案中，XjPX2独立地为V或I 或A。在一些实施方案中，X 3和X4独立地为T或S，且X3X4为TT、SS、TS或ST。在一些实施方案中， 所述插入片段包含NXd、NX 2S或NNX3X4糖基化位点。在一些实施方案中，NXd、NX2S或NNX 3X4糖 基化位点中的至少一个氨基酸不是来自所述插入片段。在一些实施方案中，两个或更多个 NXil^NXA糖基化位点被引入a亚单位中。在一些实施方案中，两个或更多个似"或似以糖 基化位点被单一氨基酸分开，其中在一些实施方案中，所述氨基酸是V或I。
[0042] 序列为附1'1附（5￡〇10勵：1)或1附1'1附（5￡〇10勵：12)或￥爾1'1爾1'(5￡〇10勵： 20)的肽可插入在人a亚单位(SEQ ID N0:6)的氨基酸D3和Q5之间，牛、猪、绵羊、马、犬、猫a 亚单位的F6和T7之间，兔a亚单位的F6和A7之间，山羊a亚单位的F6和M7之间，负鼠a亚单位 的F6和17之间，鸡、火鸡和鸵鸟a亚单位的F6和L7之间，以及鲶鱼a亚单位的N3和D4之间。或 者，马的被修饰的糖蛋白激素a亚单位可以包含在F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之 间INV的插入片段。本发明的被修饰的蛋白质还可以含有其它取代，特别是不改变所述蛋白 质增强的性质的保守取代。然而，通常，此类被修饰的蛋白质在以上所列位置之外的位置处 将含有少于5个取代，且可能在以上所列位置之外的位置处展现与相应的野生型糖蛋白激 素a的完全氨基酸序列同一性。
[0043]碱性氨基酸包括氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，以及可能为这三种氨基酸中任 一个的修饰物的任何其它碱性氨基酸，通常在自然界没有被发现的合成的碱性氨基酸，或 在中性pH带正电荷的任何其它氨基酸。所述碱性氨基酸尤其选自赖氨酸和精氨酸组成的 组。
[0044]具有碱性氨基酸取代和肽插入片段的示例性被修饰的a分子示于SEQ ID N0:11和 21(人），SEQ ID N0:7、14-19和22(牛），SEQ ID N0:8、46、79-80(绵羊），SEQ ID N0:10、45和 77-78(猪）、SEQ ID N0:9、38-42和72-76(马）、SEQ ID N0:48-49(犬）、SEQ ID N0:51-52 (猫）、SEQ ID N0:54(兔）、SEQ ID N0:56(山羊）、SEQ ID N0:58(负鼠）、SEQ ID N0:60(鸡）、 SEQ ID N0:62(火鸡）、SEQ ID N0:64(鸵鸟）、SEQ ID N0:66(鲶鱼）、SEQ ID N0:68(鲤鱼）和 SEQ ID N0:70-71(大马哈鱼）。本发明提供具有与SEQ ID N0:7-ll、14-19、21-22、38-42、 45-46、48-49、51-52、54、56、58、60、62、64、66、68和70-80中的任一个具有至少85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性 的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0045]本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质的被修饰的a亚单位也可以具有包含一个、 两个、三个、四个或五个碱性氨基酸取代的a亚单位。被取代的氨基酸可以是任何非碱性氨 基酸。在一些实施方案中，非碱性氨基酸可以是赖氨酸残基、谷氨酸残基、脯氨酸残基或谷 氨酰胺残基。例如，在野生型牛a亚单位中，15、17、20、24位的一个或多个赖氨酸以及18位的 谷氨酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型人a亚单位中，13和20位的一个 或多个谷氨酰胺以及14位的谷氨酸和16位的脯氨酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸 取代。在野生型猪a亚单位中，15、17、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可以 被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型绵羊a亚单位中，15、17、20和24位的一个或 多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型马a亚 单位中，15、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可以被碱性氨基酸如精氨酸 和组氨酸取代。
[0046] 此外，在野生型犬a亚单位中，15、17、20和24位的一个或多个氨基酸以及18位的氨 基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型猫a亚单位中，15、17、20和24位的 一个或多个氨基酸以及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型 兔a亚单位中，15、17、20和24位的一个或多个氨基酸以及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸 如精氨酸和组氨酸取代。在野生型山羊a亚单位中，15、17、20和24位的一个或多个氨基酸以 及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型鲤鱼a亚单位中，15、 17、20和24位的一个或多个氨基酸以及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸 取代。在野生型大马哈鱼a亚单位中，15、17、20和24位的一个或多个氨基酸以及18位的氨基 酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型鸡a亚单位中，15、17和24位的一个 或多个氨基酸以及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型火鸡 a亚单位中，15、17和24位的一个或多个氨基酸以及18位的氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨 酸和组氨酸取代。在野生型鸵鸟a亚单位中，15、17和24位的一个或多个氨基酸以及18位的 氨基酸可以被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型鸵鸟a亚单位中，12、14、17和21 位的一个或多个氨基酸以及15位的氨基酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。
[0047] 作为示例，被修饰的牛a亚单位以如SEQ ID N0: 7、14至19和22中所示的序列被呈 现。本发明提供具有与SEQ ID N0:7、14至19和22中的任一个具有至少85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基 酸序列的被修饰糖蛋白。
[0048] 作为示例，被修饰的马a亚单位以如SEQ ID N0:9、38至42和72-76中所示的序列被 呈现。本发明提供具有与SEQ ID N0:9、38至42和72-76的任一个具有至少85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基 酸序列的被修饰糖蛋白。
[0049] 作为示例，被修饰的绵羊a亚单位以如SEQ ID N0:8、46和79-80中所示的序列被呈 现。本发明提供具有与SEQ ID N0:8、46和79-80的任一个具有至少85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基酸序 列的被修饰糖蛋白。
[0050] 作为示例，被修饰的猪a亚单位以如SEQ ID N0:10、45和77-78中所示的序列被呈 现。本发明提供具有与SEQ ID勵：10、45和77-78的任一个具有至少85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基酸序 列的被修饰糖蛋白。
[0051 ] 作为示例，被修饰的犬a亚单位以如SEQ ID N0:48_49中所示的序列被呈现。本发 明提供具有与SEQ ID N0:48-49的任一个具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰 糖蛋白。
[0052] 作为示例，被修饰的猫a亚单位以如SEQ ID N0:51_52中所示的序列被呈现。本发 明提供具有与SEQ ID N0:51-52的任一个具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰 糖蛋白。
[0053]作为示例，被修饰的兔a亚单位以如SEQ ID N0:54中所示的序列被呈现。本发明提 供具有与SEQ ID N0:54具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0054]作为示例，被修饰的山羊a亚单位以如SEQ ID N0:56中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:56具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0055]作为示例，被修饰的负鼠a亚单位以如SEQ ID N0:58中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0056]作为示例，被修饰的鸡a亚单位以如SEQ ID N0:60中所示的序列被呈现。本发明提 供具有与SEQ ID N0:60具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0057]作为示例，被修饰的火鸡a亚单位以如SEQ ID N0:62中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:62具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0058]作为示例，被修饰的鸵鸟a亚单位以如SEQ ID N0:64中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:64具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0059] 作为示例，被修饰的鲶鱼a亚单位以如SEQ ID N0:66中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:66具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0060] 作为示例，被修饰的鲤鱼a亚单位以如SEQ ID N0:68中所示的序列被呈现。本发明 提供具有与SEQ ID N0:68具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被修饰糖蛋白。
[0061 ] 作为示例，被修饰的大马哈鱼a亚单位以如SEQ ID N0:70_71中所示的序列被呈 现。本发明提供具有与SEQ ID N0:70-71的任一个具有至少85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的被 修饰糖蛋白。
[0062]可以通过与其它物种比较目标a亚单位的氨基酸序列以鉴定其它物种的蛋白质中 的相应基础残基，从而设计出进一步被修饰的a亚单位。美国专利6,361，992中公开了此类 方法，该专利的全部内容以引用方式并入本文中。还可以针对所选定的用于比较和取代的 物种，考虑来自不同物种的糖蛋白激素的相对生物学活性。此外，基于相关糖蛋白激素的结 构进行同源性建模可用于鉴定表面暴露出的氨基酸残基。为了修饰附加的氨基酸位置，可 以利用标准的计算机软件程序如DNASIS(Hitachi Software Engineering)或上面所列的 任一其它比对程序(包括但不限于LI0Nment、SIM和GCG程序如Gap、BestFit、FrameAlign和 Compare)来比对来自人和非人的糖蛋白激素序列。然后可以利用上述技术中的一种取代在 人和非人的糖蛋白激素之间有所不同的氨基酸残基，并利用在此所提及的测定法中的一种 测定所得到的糖蛋白激素的效力。
[0063]因此，本发明还提供包含本文所述的被修饰的a亚单位的被修饰的FSH蛋白，其相 对于来自相同物种的野生型FSH具有增强的效力。
[0064] 本发明还提供包含本文所述的被修饰的a亚单位的被修饰的LH蛋白，其相对于来 自相同物种的野生型LH具有增强的效力。
[0065] 本发明还提供包含本文所述的被修饰的a亚单位的被修饰的TSH蛋白，其相对于来 自相同物种的野生型TSH具有增强的效力。
[0066] 本发明还提供包含本文所述的被修饰的a亚单位的被修饰的CG蛋白，其相对于来 自相同物种的野生型CG具有增强的效力。
[0067] 本发明还提供在动物中刺激糖蛋白激素受体的方法，其包括向所述动物施用被修 饰的糖蛋白激素，其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述动物可以是哺乳 动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、 白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、 驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方案中，所述鸟类 可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中，所述动物可以 是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲈 鱼、鲷或石斑鱼。
[0068] 本发明还提供在动物中诱导超数排卵的方法，其包括向所述动物施用被修饰的糖 蛋白激素(例如，FSH类似物），其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述动物 可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、 绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、 美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方案 中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中， 所述动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗 非鱼、鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0069] 本发明还提供在动物中促进天然或人工受精或者体外受精接着胚胎转移的方法， 其包括向所述动物施用被修饰的糖蛋白激素(例如，FSH类似物），其中所述动物可以是任何 物种。在一些实施方案中，所述动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可 以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊 猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述 动物可以是鸟类。在一些实施方案中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍 珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中，所述动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以 包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、自卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0070] 本发明还提供在动物中治疗不育症的方法，其包括向所述动物施用被修饰的糖蛋 白激素(例如，FSH类似物），其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述动物可 以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、绵 羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美 洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方案中， 所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中，所述 动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、 鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0071] 本发明还提供改善动物的卵存储的方法，其包括向所述动物施用被修饰的糖蛋白 激素(例如，FSH类似物），其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述动物可以 是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、绵 羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美 洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方案中， 所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中，所述 动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、 鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0072] 本发明还提供在动物中防止胚胎胎儿损失的方法，其包括向所述动物施用被修饰 的糖蛋白激素(例如，LH类似物），其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述 动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、 猪、马、绵羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天 竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施 方案中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案 中，所述动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、 罗非鱼、鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0073] 本发明还提供维持动物妊娠的方法，其包括向所述动物施用被修饰的糖蛋白激素 (例如，LH类似物），其中所述动物可以是可能怀孕的任何物种。在一些实施方案中，所述动 物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、 马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺 鼠、美洲盤、兔、驯鹿、水牛或牦牛。
[0074] 本发明还提供在动物中治疗隐睾病的方法，其包括向所述动物施用被修饰的糖蛋 白激素(例如，LH类似物），其中所述动物可以是可能受该病况影响的任何物种。在一些实施 方案中，所述动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于 人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大 额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。
[0075] 本发明还提供在动物中治疗性腺功能减退症的方法，其包括向所述动物施用被修 饰的糖蛋白激素(例如，LH类似物），其中所述动物可以是可能受该病况影响的任何物种。在 一些实施方案中，所述动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但 不限于人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、 驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以 是鸟类。在一些实施方案中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵 鸟。在一些实施方案中，所述动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不 限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0076] 本发明还提供在动物中减少到发情的时间和同步发情的方法，其包括向所述动物 施用被修饰的糖蛋白激素(例如，CG类似物），其中所述动物可以是发情期的任何物种。在一 些实施方案中，所述动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不 限于人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、 驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。
[0077] 本发明还提供评估动物的代谢健康状况的方法，其包括向所述动物施用被修饰的 糖蛋白激素(例如，TSH类似物），其中所述动物可以是任何物种。在一些实施方案中，所述动 物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、 马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺 鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方 案中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案 中，所述动物可以是鱼类。在一些实施方案中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、 罗非鱼、鲶鱼、?卢鱼、鲷或石斑鱼。
[0078] 本发明还提供在动物中诊断和/或治疗甲状腺癌和/或其它癌症的方法，其包括向 所述动物施用被修饰的糖蛋白激素(例如，TSH类似物），其中所述动物可以是可能受此类癌 症影响的任何物种。在一些实施方案中，所述动物可以是哺乳动物。在一些实施方案中，所 述哺乳动物可以包括但不限于人、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、 鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛。在一些 实施方案中，所述动物可以是鸟类。在一些实施方案中，所述鸟类可以包括但不限于鸡、鸭、 火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵鸟。在一些实施方案中，所述动物可以是鱼类。在一些实施方案 中，所述鱼类可以包括但不限于鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲈鱼、鲷或石斑鱼。
[0079] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素(例如，FSH类似物)可用于兽类超数排卵 以及天然或人工受精或者体外受精，接着进行胚胎转移。在一些物种(例如，人）中，被修饰 的糖蛋白激素可以用于治疗患有不育症的受试者和用于卵库存(egg banking)。
[0080] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素（例如，LH类似物）可以用于防止兽类胚 胎胎儿损失和维持妊娠。在一些物种(例如，人）中，被修饰的糖蛋白激素可以用于在隐睾病 中促进睾丸下降，并且用于治疗性腺功能减退症。
[0081] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素（例如，CG类似物)可以用于在各种动物 中减少发情时间、同步发情或诱导发情，所述动物包括但不限于处女猪(virgin pig)、未发 情小母猪、发情小母猪、产后乏情或者断奶后乏情的母猪、处于正常繁殖季节外的母羊和牛 胚胎转移接受者。
[0082] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素(例如，TSH类似物)可以用于在所有物种 中诊断和/或治疗甲状腺癌和/或其它癌症。
[0083]本发明还提供可以用于水产业中的试剂和方法。a单位中的插入和取代显著地增 强了 FSH、TSH、CG和LH的活性。来自一个物种的被修饰的糖蛋白激素可以用于治疗另一个物 种，具有显著的异种促甲状腺(heter〇thyr〇trop i c)效果。例如，一项研究表明，被修饰的人 TSH(TR-1401)和被修饰的人FSH(TR-4401)对于金鱼的血浆T4水平具有显著影响。参见 Mi 1ler等，Thyrotropic activity of recombinant human glycoprotein hormone analogsand pituitary mammalian gonadotropins in goldfish(Carassius auratus): Insights into the evolution of thyrotropin receptor specificity,General and Comparative Endocrinology, 166(2012), 70-75的图5、表1和图8。这一研究（其全部内容被 并入)也证明了被修饰的糖蛋白激素的广泛潜在用途，因为源自一个物种的超激动剂可以 被用于其它物种(例如鱼)并具有显著效果。具体地说，不论源自鱼还是源自其它物种的被 修饰的糖蛋白激素都可以用于促进鱼的生长、改善繁殖以及维持和/或扩大鱼的种群。
[0084] 本发明还提供可以用于保护濒危物种的试剂和方法。由于被修饰的糖蛋白激素的 交叉-激活作用，因此来自一个动物物种(例如人或牛）的超激动剂可以被施用给另一个物 种(例如虎或狮），并具有显著效果。因此，被修饰的糖蛋白激素可以用于促进濒危物种的繁 殖和扩大濒危物种的种群。
[0085] 本发明还涵盖本文所述的类似物的片段，其具有超激动剂或拮抗剂活性。例如，本 发明的被修饰的a链的片段可以单独使用，或者与片段或全长龄连组合使用，以产生超激动 剂化合物。在一些情况下，本发明的被修饰的a亚单位分子的片段还可以用作拮抗剂，例如， 以在施用糖蛋白激素治疗剂后限制其活性的持续时间。
[0086] 本发明还提供编码本文所述的被修饰的糖蛋白激素的核酸序列。本发明还提供编 码具有保守氨基酸取代的多肽的核酸。分离的核酸可以编码与上述标识的序列具有至少约 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的 序列同一性的蛋白质。分离的核酸可以编码具有与由上述标识的登记号编码的氨基酸序列 具有至少约 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽。编码转运体的分离的核酸可以杂交至上述 标识的核酸序列。
[0087] 编码被修饰的糖蛋白激素蛋白质的核酸可以被遗传融合至表达控制序列以进行 表达。合适的表达控制序列包括适用于靶宿主生物体的启动子。对于来自原核和真核生物 体的不同宿主，此类启动子是本领域技术人员众所周知的且描述于文献中。例如，此类启动 子可以从天然存在的基因分离或可以是合成或嵌合启动子。
[0088] 本发明还提供用于将编码被修饰的糖蛋白激素蛋白质的核酸插入靶核酸分子如 载体中的表达盒(expression cassette)。出于该目的，该表达盒在5和3侧提供有核苷 酸序列以促进在特定的序列位置的移除和插入，例如，限制酶识别位点或用于同源重组(例 如通过重组酶所催化)的靶序列。除了本发明的核酸分子或表达盒之外，该载体还可以含有 其它基因如标记基因，所述基因允许在合适的宿主细胞和在合适的条件下选择所述载体。 通常，该载体还含有一个或多个复制起点。所述载体还可以包含终止序列以限制转录长度 超过编码本发明的转运体的核酸。
[0089] 有利地，所述载体中所含的核酸分子可操作地连接至表达控制序列，所述控制序 列允许在原核细胞或真核细胞中的表达，即保证可翻译RNA的转录和合成。
[0090] 术语分离的是指从存在于大分子的天然来源中的其它细胞/组织成分(例如DNA或 RNA)分离的分子。本文使用的术语分离的还指当通过重组DNA技术产生时基本上无细胞材 料、病毒材料和培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上无化学前体或其它化学物质的 核酸或肽。而且，分离的核酸或肽可以包括不以片段天然存在且不以天然状态被发现的核 酸或肽片段。
[0091] 术语质粒和载体可互换使用，因为质粒为最常用的载体形式。然而，本发明意在包 括表达载体的此类其它形式，其发挥等同功能且随后在本领域变为已知。载体可以是多个 核酸的任一个，期望的序列可以通过限制和连接而插入所述核酸中以用于在不同遗传环境 之间运输或用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，尽管RNA载体也是可用的。载体包 括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能在宿主细胞中复制的载体，且其特征进一步在于 一个或多个核酸内切酶限制位点，在这些位点所述载体可以可确定的方式被切割，且期望 的DNA序列可连接至这些位点中，使得新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质 粒的情况下，期望序列的复制可以由于质粒拷贝数在宿主细菌内增加而发生多次，或在宿 主通过有丝分裂复制前每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可以在细胞溶解期 主动发生或在溶原期被动发生。
[0092] 载体可以进一步含有启动子序列。启动子可以包含通常位于编码区上游的非翻译 核酸序列，其含有引发核酸转录的位点。启动子区还可以包含作为基因表达的调节物的其 它元件。在本发明的其它实施方案中，表达载体含有另外的区域以辅助选择合并有表达载 体的细胞。启动子序列经常在其3'端以转录起始位点为界(包含端点)且向上游(5'方向）延 伸以包括以背景之上可检测到的水平引发转录所需的最小数量的碱基或元件。在启动子序 列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子经常，但 不总是，含有TATA盒和CAT盒。启动子的激活对于某些细胞或组织可能是特异的，例如其通 过仅在某些组织中表达的转录因子，或启动子可能是普遍存在的且能在大多数细胞或组织 中表达。
[0093] 载体可以进一步含有一个或多个适用于鉴别和选择已用载体转化或转染的细胞 的标记序列。标记包括例如编码增加或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白 质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定检测的酶(例如，半乳糖苷酶或碱性 磷酸酶)的基因，和明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或噬斑的表型的基因。载体可以 是能自发复制和表达在它们可操作地接合的DNA片段中存在的结构基因产物的那些载体。 表达载体是这样的载体，期望的核酸序列可以通过限制和连接而被插入该载体中，使得其 可操作地接合或可操作地连接至调节序列并且可以作为RNA转录物表达。表达是指内源性 基因、转基因或编码区在细胞中的转录和/或翻译。
[0094] 当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制 之下的方式共价连接时，所述编码序列和调节序列可操作地结合。如果期望将编码序列翻 译为功能蛋白质，则认为两个DNA序列可操作接合，条件是5 '调节序列中启动子的诱导导致 编码序列的转录且两个DNA序列之间的连接性质不会（1)导致移码突变的引入，（2)干扰启 动子区引导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物翻译为蛋白质的能力。因此， 启动子区将可操作接合至编码序列，条件是启动子区能实现该DNA序列的转录，使得所得转 录物可以翻译为期望的蛋白质或多肽。
[0095] 本发明的一些方面包括核酸的转化和/或转染。转化是将外源或异源核酸引入原 核细胞内部。转染是将外源或异源核酸引入真核细胞内部。转化性核酸或转染性核酸可以 或可以不整合(共价连接)至构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物中，例如，转化性 核酸可以维持在附加型元件如质粒或病毒载体上。关于真核细胞，稳定转染的细胞是其中 转染性核酸已整合至染色体中使得它由子细胞通过染色体复制而被遗传的细胞。该稳定性 通过真核细胞建立包含一群含转染的核酸的子细胞的细胞系或克隆的能力而被证明。
[0096] 本领域技术人员已知多种用于表达核酸插入片段的大肠杆菌（E. col i， Escherichia coli)表达载体。其它适用的微生物宿主包括杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is )，和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌 属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载 体，它通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点）。此外，可以存在任何数目 的各种众所周知的启动子，如乳酸启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、内酰胺酶启动 子系统或来自噬菌体A的启动子系统。启动子通常会任选地与操纵子序列一起控制表达，并 且具有例如用于启动和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列。如果需要，可以通过在5' 且与下游核酸插入片段在框内插入Met密码子来提供氨基末端的甲硫氨酸。并且，可以利用 标准的寡核苷酸诱变程序去除核酸插入片段中的羧基末端延伸。
[0097]另外，可以使用酵母表达。酵母表达系统具有几个优点。首先，证据表明酵母分泌 系统中所产生的蛋白质展现正确的二硫键配对。其次，通过酵母分泌系统可以有效地实施 翻译后的糖基化。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)前a因子原（pre-pro-alpha-factor)前导区（由MF"_1基因编码）常规地用于指导酵母分泌蛋白质（Brake， Proc .Nat.Acad. Sci .，81:4642-4646(1984))。前a因子原前导区含有一个信号肽和一个包 含KEX2基因所编码的酵母蛋白酶的识别序列的前片段(pro-segment):该酶在Lys-Arg二肽 裂解信号序列的羧基侧裂解前体蛋白质。可以将FSH编码序列与前a因子原前导区框内融 合。然后将该构建体置于强转录启动子如醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的控制之下。核 酸编码序列之后是翻译终止密码子，之后是转录终止信号。或者，可以将核酸编码序列与第 二蛋白质编码序列如Sj26或0半乳糖苷酶融合，所述第二蛋白质可以用于促进通过亲和色 谱来纯化融合蛋白质。用于分离融合蛋白质组分的蛋白酶裂解位点的插入适用于用于在酵 母中表达的构建体。在杆状病毒系统中也可以实现重组蛋白质的有效的翻译后糖基化和表 达。
[0098] 哺乳动物细胞容许在有利于重要的翻译后修饰的环境中表达蛋白质，所述修饰例 如折叠和半胱氨酸配对、添加复杂的碳水化合物结构以及分泌活性蛋白质。用于在哺乳动 物细胞内表达活性蛋白质的载体的特征在于在强病毒启动子和多腺苷酸化信号之间插入 蛋白质编码序列。载体可以含有赋予潮霉素(hygromycin)抗性、庆大霉素(gentamicin)抗 性，或其它适于用作选择性标记的基因或表型，或甲氨蝶呤抗性以进行基因扩增的基因。可 以利用编码甲氨蝶呤抗性的载体将嵌合蛋白质编码序列引入到中国仓鼠卵巢(CH0)细胞系 内，或者利用合适的选择标记将嵌合蛋白质编码序列引入到其它细胞系内。可以通过DNA印 迹分析来确认载体DNA在被转化细胞中的存在。可以通过RNA印迹分析来确认对应于插入片 段编码序列的RNA的产生。本领域已经开发出大量能分泌完整人类蛋白质的其它适合的宿 主细胞系，且包括CH0细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkat细胞等。用于这些细胞的表 达载体可以包括表达控制序列如复制起点、启动子、增强子，以及必需的信息加工位点如核 糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。示例性的表达控制序列是 源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。可以通过众所周知的方 法将含有目标核酸片段的载体转移到宿主细胞内，所述方法根据细胞宿主的类型而改变。 例如，氯化钙转化常常被用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或lipofectin介导的转染或 电穿孔可以用于其它细胞宿主。
[0099] 可以采用用于在哺乳动物细胞内表达基因的替代载体，那些载体与被开发用于表 达人T干扰素、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子VIII、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶连接 蛋白l(Nexin 1)和嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白的载体相似。此外，载体可以包含可用于在 哺乳动物细胞(例如C0S-7)内表达所插入的核酸的CMV启动子序列和多腺苷酸化信号。
[0100] 可以在体内或体外表达基因或杂合基因。体内合成包括转化可以充当用于载体的 宿主细胞的原核或真核细胞。或者，可以在体外表达系统中进行基因表达。例如，可以商购 常规地用于合成相对大量的mRNA的体外转录系统。在此类体外转录系统中，将编码糖蛋白 激素的核酸克隆到表达载体内邻近于转录启动子。例如，Bluescript II克隆和表达载体含 有多个侧接原核强转录启动子(Stratagene)的克隆位点。可以获得含有从DNA模板体外合 成RNA所必需的所有试剂的试剂盒，如Bluescript载体(Stratagene)。然后可以在体外翻译 由如上系统在体外所产生的RNA，以产生期望的糖蛋白激素(Stratagene)。
[0101] 产生糖蛋白激素的另一种方法是通过蛋白质化学技术将两种肽或多肽连接在一 起。例如，利用目前可获得的实验室设备，利用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧基羰 基)化学(Applied Biosystems)可以化学合成肽或多肽。本领域技术人员可以容易地认识 到可以通过标准的化学反应合成对应于杂交糖蛋白激素的肽或多肽。例如，肽或多肽可以 被合成并且不将其从合成树脂中裂解下来，而杂交肽的另一片段可以被合成并随后从树脂 中裂解下来，由此暴露出在另一片段上被官能封闭的末端基团。通过肽缩合反应，这两个片 段可以分别在它们的羧基和氨基末端经由肽键共价地接合在一起，以形成杂交肽。(Grant， Synthetic Peptides：A UserGuide，W?H?Freeman(1992)和Bodansky，Principles of Peptide Synthesis，Springer_Verlag( 1993))。或者，如上所述可以体内独立地合成肽或 多肽。一旦被分离，这些独立的肽或多肽就可以经由相似的肽缩合反应连接以形成糖蛋白 激素。例如，所克隆的或合成的肽片段的酶的或化学的连接可以容许相对短的肽片段接合， 以产生更大的肽片段、多肽或完整的蛋白质结构域(Abrahmsen，Biochemistry，30 : 4151 (1991);Dawson，Science，266:776-779(1994))〇
[0102] 本发明的被修饰的糖蛋白激素可以是通过将编码多肽的核酸克隆到能产生其多 肽片段的表达系统内所获得的重组蛋白质。例如，可以确定被修饰的a亚单位的活性结构 域，其与0亚单位一起可以与糖蛋白激素受体相互作用并引起与糖蛋白激素相关的生物效 应。在一个示例中，可以删除所发现的不会影响糖蛋白激素的活性或结合特异性或亲和力 的氨基酸，且不会丧失相应的活性。
[0103] 例如，可以依次去除天然或修饰的糖蛋白激素中的氨基或羧基末端的氨基酸，并 在如上所述的多种可获得的测定中的一种中测试相应的活性。在另一个示例中，可以用多 肽片段或其它部分(如生物素)代替本发明的被修饰蛋白质中的氨基末端或羧基末端或者 甚至所述激素的内在区域的一部分，所述多肽片段或其它部分可以有助于被修饰的糖蛋白 激素的纯化。例如，可以通过将编码两个多肽片段的相应核酸克隆到表达载体内使得编码 区的表达生成杂交多肽的肽化学，将被修饰的糖蛋白与麦芽糖结合蛋白融合。可以通过使 杂交多肽经过直链淀粉亲和柱来亲和纯化所述杂交多肽，然后可以通过用特异的蛋白酶因 子Xa裂解杂交多肽，将被修饰的糖蛋白与麦芽糖结合区域分离开来。
[0104] 也可以直接地合成或者通过化学地或机械地破坏更大的糖蛋白激素来获得本发 明的被修饰的糖蛋白激素分子的活性片段。活性片段被定义为源自天然存在的氨基酸序列 的至少约5个连续氨基酸的氨基酸序列，其具有相关的活性，例如结合或调节活性。无论是 否与其它的序列相连接，片段都还可以包含对具体区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取 代或其它所选的修饰，只要肽的活性与被修饰的糖蛋白的活性相比没有被显著地改变或削 弱。这些修饰可以提供一些附加的性质，例如去除/添加能形成二硫键的氨基酸，增加其生 物寿命等。在任何情况中，肽都必须具备生物活性性质，如结合活性、调节结合域处的结合 等。通过对激素的特定区域的诱变，以及随后的表达及对所表达多肽的测试，可以鉴定出糖 蛋白激素的功能的或活性的区域。此类方法对于本领域人员是显而易见的，并且可以包括 对编码受体的核酸的位点特异性诱变。
[0105] 本发明还涵盖包含本文所述的突变的融合蛋白质和嵌合蛋白，例如包括与FSH糖 蛋白的融合物。此类融合蛋白质可以通过用本领域已知的方法在正确的编码框中将编码期 望的氨基酸序列的合适的核酸序列彼此连接并通过上面所述的任一手段表达所述融合蛋 白质而制得或者，此类融合蛋白质可以通过蛋白质合成技术，例如使用肽合成仪而制得。本 发明的单链类似物和嵌合蛋白质可以在所述嵌合蛋白质的a亚单位和0亚单位之间或在其 不同部分之间合并有肽接头。
[0106] 糖蛋白激素超激动剂的表征
[0107] 本文所述的对野生型糖蛋白激素的一种或多种修饰的作用可以任何数量的方式 被确定。例如，可对用编码被修饰的糖蛋白激素的核酸转染的细胞内第二信使系统的变化 进行测量并且将其与用编码野生型糖蛋白激素的核酸转染的类似细胞比较。或者，被修饰 的糖蛋白激素的活性可以由受体结合测试、胸苷摄取测试、孕酮产生测试或T4分泌测试确 定。本领域技术人员可以容易地确定使用任何合适的测试来确定野生型或被修饰的糖蛋白 激素的活性。
[0108] 在本发明一个实施方案中，被修饰的糖蛋白激素具有的效力比野生型糖蛋白激素 的效力增强。该增强的效力可以通过上述任何技术或本领域技术人员容易确定的任何其它 合适的测试来评估。增强的效力在各测试之间或各细胞系之间不必一致，因为这些当然会 改变。
[0109] 在本发明另一实施方案中，被修饰的糖蛋白激素具有的最大功效相比野生型糖蛋 白激素的最大功效增加。该增加的最大功效可通过上述任何技术或本领域技术人员容易确 定的任何其它合适的测试来评估。该增加的最大功效在各测试之间或各细胞系之间不必一 致，因为这些当然会改变。
[0110]在PCT/US99/05908中描述了适用于表征本文所述的类似物的其它测定，其全部内 容以引用方式并入本文中。例如，可以使用各种免疫测定，包括但不限于利用例如下列技术 的竞争性和非竞争性测定系统:放射免疫测定、ELISA、等电点聚焦（IEF)测定、三明治免疫 测定、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法、蛋白质印 迹法、沉淀反应法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫荧光测定法、蛋白A测定法和免疫电 泳测定法等。
[0111] 例如，当0亚单位为FSH的0亚单位时，卵母细胞质量和数量的改善可以通过体外和 体内测试来评估。超活性FSH可以用于改善来自动物的卵母细胞的质量和数量，所述动物包 括但不限于，人、小鼠、大鼠、牛、母牛、猪、马、棉羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、狗、 虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛、牦牛、鸡、鸭、火鸡、鹅、 鸽子、珍珠鸡、鸵鸟、鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲈鱼、鲷和石斑鱼。
[0112] 在一些实施方案中，将超活性FSH施用给人或任何动物。通常使用体外受精过程的 不同终点如卵母细胞形成、卵母细胞受精和胚泡形成来确定卵母细胞的质量和数量的改 善。体外受精实验可以遵循"超数排卵方案"，其中用根据本发明的超活性FSH类似物治疗受 试者，这导致多个卵母细胞的释放和成熟。在体外受精实验中，FSH(超活性FSH和重组野生 型FSH)可以与hCG-起被施用以触发排卵。可以使用仅接受hCG或孕马血清促性腺素(PMSG) 的对照动物。卵母细胞的质量可以通过增加动物中卵母细胞的受精率而改善。超活性促卵 泡激素的受精率可以通过比较使用超活性FSH达到的受精率与使用相同量的重组野生型 FSH实现的受精率在体内或体外确定。还可以使用接受hCG的对照动物。受精率可以通过所 发育的两细胞胚胎占卵母细胞总数的百分比而测量。如果受精在体外发生，则两细胞胚胎 可以在受精培养皿中计数。在小鼠中，两细胞胚胎在受精后大约24小时发育。受精率基于所 施用的超活性FSH的量而改变。动物可以接受多剂量的超活性FSH。由于以对卵母细胞数量 而言的最大有效剂量施用超活性FSH，因此受精率增加了至少约10%。由于以对于卵母细胞 数量而言的最大有效剂量施用超活性FSH，因此受精率可以增加至少约20%，优选至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0113] 超活性促卵泡激素可以通过改善每个受精卵母细胞的胚泡形成率而改善卵母细 胞的质量。胚泡形成率可以通过确定形成胚泡的两细胞胚胎的百分比而测量。无论胚泡在 体内还是体外形成，胚泡形成率都增加。胚泡形成率取决于所施用的超活性促卵泡激素的 量。由于以对于卵母细胞数量而言的最大有效剂量施用超活性促卵泡激素，因此胚泡形成 率增加了至少约10%。由于以对于卵母细胞数量而言的最大有效剂量施用超活性FSH，因此 胚泡形成率可以增加至少约20 %，优选至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或 100%〇
[0114] 超活性促卵泡激素可以通过增加每个受精卵母细胞的胚胎总数而改善卵母细胞 的质量。无论受精在体内还是体外发生，每个受精卵母细胞的胚胎总数都增加。每个受精卵 母细胞的胚胎总数的增加取决于所施用的超活性促卵泡激素的量。由于以对于卵母细胞数 量而言的最大有效剂量施用超活性促卵泡激素，因此每个受精卵母细胞的胚胎总数增加了 至少约10%。由于以对于卵母细胞数量而言的最大有效剂量施用超活性FSH，因此每个受精 卵母细胞的胚胎总数可以增加至少约20%，优选至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或 100%。
[0115] 在一些实施方案中，当0亚单位为CG的0亚单位时，有效的促黄体激素(LH)-状活性 可以通过体外和体内生物测定来评估。超活性CG诱导排卵，延长黄体寿命，增加孕酮合成且 在某些物种中促进附属黄体形成。此类作用导致更有效的卵母细胞收集、某些物种中卵母 细胞质量的增加、妊娠和妊娠维持率的增加。
[0116] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素(例如，FSH类似物)可以用于兽类超数排 卵以及天然或人工受精、或体外受精，接着进行胚胎转移。在一些物种(例如，人）中，被修饰 的糖蛋白激素可以用于治疗患有不育症的受试者和用于卵库存。可以通过对于超数排卵、 天然或人工受精、不育症和卵存储的作用来评估被修饰的糖蛋白激素的功效。
[0117] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素（例如，LH类似物)可以用于防止兽类胚 胎胎儿损失和维持妊娠。在一些物种(例如，人）中，被修饰的糖蛋白激素可以用于在隐睾病 中促进睾丸下降，并且用于治疗性腺功能减退症。可以通过对于胎儿损失、妊娠维持、隐睾 病中的睾丸下降和性腺功能低下的治疗效果来评估被修饰的糖蛋白激素的功效。
[0118] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素（例如，CG类似物)可以用于在各种动物 中减少发情时间、同步发情或者诱导发情，所述动物包括但不限于处女猪、未发情小母猪、 发情小母猪、产后乏情或者断奶后乏情的母猪、处于正常繁殖季节外的母羊和牛胚胎转移 接受者。可以通过对于发情的时间和同步的作用来评估被修饰的糖蛋白激素的功效。
[0119] 在一些实施方案中，被修饰的糖蛋白激素(例如，TSH类似物)可以用于在所有物种 中诊断和/或治疗甲状腺癌和/或其它癌症。可以通过对于此类诊断和治疗的作用来评估被 修饰的糖蛋白激素的功效。
[0120] 具有增加的血清半衰期的糖蛋白激素类似物
[0121] 本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质还可以被进一步地修饰，使得血浆半衰期相 比于野生型对应物的半衰期增加。本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质可以进一步包含潜 在的糖基化位点，所述位点包括含N-糖基化和/或0-糖基化位点的序列。新糖基化位点可以 通过在野生型a亚单位的N-末端附近插入肽而引入。所述糖基化位点可以包括NXiTJXsSS NNX 3X4糖基化位点，其与野生型糖蛋白激素相比被引入a亚单位中，并且Xi、X2、X3和X4独立地 为任何氨基酸。在一些实施方案中，XjPX2独立地为V、I或A。在一些实施方案中，X3和X4独立 地为T或S。在一些实施方案中，所述插入片段包含NXANXASNNXA糖基化位点。在一些实 施方案中，NXiKNXASNNXsX*糖基化位点中的至少一个氨基酸不是来自所述插入片段。在 一些实施方案中，两个或更多个NXdSNXA糖基化位点被引入a亚单位中。在一些实施方案 中，两个或更多个似"或似以糖基化位点被单一氨基酸分开，其中在一些实施方案中，所述 氨基酸是V或I。例如，所述糖基化位点可以包括NVT、NVTINVT、NIT、NITINIT、NNTT、NNTS、 NNSS或NNST。
[0122] 例如，将肽NVTIV(SEQ ID N0:1)或VNVTINVT(SEQ ID N0:20)置于a亚单位中提供a 亚单位的潜在糖基化位点。可以将SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20的肽置于人野生型序列的 D3和Q5之间。可以将SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:20的肽置于牛、马、猪和绵羊的野生型序列 的F6和T7之间。插入的肽在氨基端可以进一步包含另外的苏氨酸残基。插入以改变糖基化 的其它肽包括NV、INV和TNV肽，以及TNVTINV(SEQ ID N0:12)。如上所述，目标是向a亚单位 中引入诸如NVT的糖基化位点。在一些实施方案中，糖基化位点中的所有氨基酸都来自所述 插入片段。在一些实施方案中，糖基化位点中的至少一个氨基酸不是来自所述插入片段。例 如，糖激素的被修饰a亚单位可以包括在F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之间INV的插 入片段（例如SEQ ID N0:38和39)，其将糖基化位点NVTINVT引入所述a亚单位中，但并非 NVTINVT中的所有氨基酸都来自所述插入片段。
[0123] 在一些实施方案中，所述糖基化位点可以包含重叠的序列子，诸如但不限于NNSS、 顺1'1'、顺了3和顺33(参见例如3￡〇10勵:72-80)。例如，对于源自野生型马€[亚单位的被修饰 的糖蛋白激素，SEQ ID N0:72-76中的蛋白质序列包含NNTT(SEQ ID N0:72和73)、NNST(SEQ ID N0:74)、NNSS(SEQ ID N0:75)或NNTS(SEQ ID N0:76)糖基化位点，其中所述糖基化位点 的氨基酸可以是或可以不是所述插入片段的一部分。对于源自野生型猪a亚单位的被修饰 的糖蛋白激素，SEQ ID N0:77和78的蛋白质序列可以包含NNTT，其中对于SEQ ID N0:77,所 述插入序列是F6和T7之间的NNTT，并且对于SEQ ID N0:78,所述插入序列是F6和T7之间的 NNTT。此外，作为示例，源自野生型绵羊a亚单位的被修饰的糖蛋白激素（SEQ ID N0: 79和 80)可以包含NNTT位点。将NNX3X4位点引入a亚单位的插入片段中可以插入野生型亚单位的N 末端附近。例如，NNT、NNS、NNTT或NNTS可以插入野生型马、猪或绵羊a亚单位的F6和T7之间。
[0124] 增加的半衰期还可以通过其它合适的化学基团的聚乙二醇化或缀合或通过构造 具有增加的半衰期的融合蛋白质或通过任何其它方法而提供。此类方法是本领域已知的， 例如描述于美国专利5,612,034、美国专利6,225,449和美国专利6,555,660中，这些美国专 利中的每一个的全部内容以引用方式并入。
[0125] 还可以通过增加分子内的带负电荷残基的数目（例如谷氨酸和/或天冬氨酸残基 的数目）来增加半衰期。可以通过定点诱变来实现此类改变。还可以通过向被修饰的糖蛋白 激素蛋白质中插入含有一个或多个带负电荷残基的氨基酸序列来实现此类改变。
[0126] 蛋白质的半衰期是蛋白质稳定性的量度，且表明蛋白质浓度降低一半所需的时 间。可以通过适于测量来自受试者的样品中随时间而变化的激素水平的任何方法来确定本 文所述的被修饰的糖蛋白激素蛋白质的血清半衰期，所述方法例如但不限于利用抗体的免 疫测定法以测量在施用被修饰的糖蛋白激素蛋白质后一段时间所获取的血清样品中的水 平，或者通过检测从施用标记的糖蛋白激素后的受试者获取的血清样品中的标记的激素分 子，即放射性标记的分子。
[0127] 治疗方法
[0128] 本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质可以用于治疗任何与糖蛋白激素活性相关 的病况。本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质可以用于治疗有此需要的受试者。受试者可 以是动物，诸如但不限于哺乳动物、爬行动物、鱼、鸟和两栖动物。受试者可以是哺乳动物， 诸如但不限于牛、母牛、猪、马、绵羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑 马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛和牦牛。动物包括家畜和家养宠物，如 猫和狗。受试者可以是需要改善的糖蛋白激素活性的人患者或动物。与糖蛋白激素活性相 关的病况是完全或部分由改变了的糖蛋白激素响应性所引起的病况，或者能从施用糖蛋白 激素中获益的病况。例如，此类病况包括但不限于排卵功能障碍、黄体期缺陷、原因不明的 不育症、雄性因素的不育症、限时怀孕、FSH受体低表达、FSH受体低敏感性、FSH受体结合缺 陷、FSH受体偶联缺陷、低睾酮产生、男性型脱发症和垂体衰竭或损伤。
[0129] 例如，可以通过向动物施用本文所述的超活性FSH类似物来改善卵母细胞的数量 和质量。例如，
【申请人】已惊奇地发现通过施用含有被修饰的a亚单位的超活性FSH，获得了卵 母细胞的数量和质量的显著增加。可以通过增加超活性FSH的FSH血清半衰期来进一步增强 超活性FSH对卵母细胞的数量和质量的作用。可以通过进一步修饰超活性FSH来增加FSH血 清半衰期。可以利用进一步的修饰(包括但不限于前面所述的那些修饰)来增加FSH血清半 衰期。
[0130] 也可以在男性或女性受试者的辅助生殖的治疗方案中使用本发明的被修饰的 FSH、CG、LH或TSH糖蛋白激素蛋白质，包括向所述受试者施用辅助量的被修饰的糖蛋白激素 蛋白质。在此类方法中，类似物可以单独地施用或与其它治疗剂组合施用，其它治疗剂例如 包括但不限于柠檬酸氯米芬（Clomiphene citrate )和GnRH(促性腺激素释放激素 (gonotropin releasing hormone))。本发明的被修饰的糖蛋白激素蛋白质可以作为一种 或多种糖蛋白的组合被施用。例如，被修饰的a亚单位可以与FS耶亚单位、CG0亚单位、TS邸 亚单位和/或L耶亚单位一起或分开组合，然后将被修饰的糖蛋白施用给受试者。例如，在患 有单一性促性腺激素缺陷症（IGD)的受试者中，可以向所述受试者施用被修饰的FSH、CG、 TSH和LH，以恢复正常的性腺功能。本领域众所周知的是，糖蛋白激素（例如FSH、CG、TSH和 LH)在雌性生殖生理中是一个整体，且可以向受试者施用这些糖蛋白激素以克服大量的生 殖病症并由此辅助生殖。
[0131] 针对被修饰的马CG糖蛋白测试单一和多重注射给药方案。对于在小鼠、大鼠、牛、 母牛、猪、马、绵羊、羊盤、白臀野牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山 羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、水牛或牦牛中使用马eCG类似物的超刺激，其中使用单一或2: 1分次eCG类似物注射。eCG类似物的剂量范围研究包括单一肌内注射30、45、60、75、90、105 和120mcg。优化的剂量以2:1比例测试，且任选的第二分次剂量将与第6天或另一日期的 PGF2a治疗一致。在小鼠、大鼠、牛、母牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、鹿、 狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲驼、兔、驯鹿、7K牛或牦牛中用被修饰 的eCG治疗产生超数排卵。
[0132] 本领域技术人员可以容易地确定施用糖蛋白激素的有效量，这将取决于诸如体 重、体格、具体病况的严重度和受试者本身的类型等因素。可以通过常规的优化方法容易地 确定治疗有效量。本发明提供相对于野生型糖蛋白激素具有增加的效力的糖蛋白激素。这 些被修饰的糖蛋白激素将允许本领域技术人员相对于野生型糖蛋白激素施用更低剂量的 被修饰的糖蛋白激素，以获得相似的治疗效果，或者施用剂量与野生型糖蛋白激素相似的 剂量的被修饰的糖蛋白激素，以获得增加的治疗效果。
[0133] 取决于是以口服、肠胃外还是以其它方式施用糖蛋白激素，所施用的前列腺素可 以是固体、半固体形式或液体剂型的形式，如例如片剂、丸剂、胶囊、粉末、液体、乳膏和悬浮 液等，优选地是适用于递送精确剂量的单位剂型。糖蛋白激素可以包括与药学上可接受的 载体组合的有效量的所选的糖蛋白激素，另外还可以包括其它的药剂、药物、载体、佐剂、稀 释剂等。"药学上可接受的"意指不是生物学或其它方面不期望的物质，即该物质可以与所 选的糖蛋白激素一起向个体施用且不引起不可接受的生物效应或不以不可接受的方式与 糖蛋白激素相互作用。制备此类剂型的实际方法对于本领域人员是已知的或者是显而易见 的；例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences，最新版(Mack Publishing)。
[0134] 提供以下实施例以描述和说明本发明。因此它们不应被理解为限制本发明的范 围。本领域技术人员将完全理解许多其它实施方案也落在如上文和权利要求中所描述的本 发明的范围内。
[0135] 实施例
[0136] a亚单位类似物的设计
[0137] 在Q13R+E14R+P16R+Q20R(人4R)具有对a-亚单位的修饰且具有野生型亚单位的 人FSH超激动剂糖蛋白与其野生型对应物相比显示显著的结合优越性。
[0138] 表1显示人a野生型(WT)和所选的hFSH超激动剂一级氨基酸结构的比较。显示了人 a野生型的N-端部分(总计92个残基的氨基酸残基1-28)和突变形式的N-端部分。4个超激动 剂精氨酸(R)取代的位置在阴影区。引入一个或两个另外的N-连接的碳水化合物链的所选4 个不同插入片段在野生型序列的氨基酸D3和Q5之间被标记。
[0139] 表1.
[0141] 表1 中的片段如下所列：SEQ ID N0:43:hFSH WT;SEQ ID N0:33，hFSHa(4R);SEQ ID N0:34，hFSHa(4R+Insl);SEQ ID N0:35，hFSHa(4R+Ins2);SEQ ID N0:36，hFSHa(4R+ Ins3)；SEQ ID NO:37,hFSHa(4R+Ins4)〇
[0142] 在一些实施方案中牛FSH(bFSH)取代高度类似于人FSHa亚单位中之前诱变处理的 残基且包括5个突变的组合，称为"5矿（1(151?+1(171?+￡181?+1(201?+1(241〇。例如5￡0 10勵:7。为 了增加引入的糖基化识别序列(NXil^NXsS)导致N-连接的碳水化合物链的附接的可能性， 建立18种不同的牛a亚单位构建物并且将其克隆至之前开发的表达载体中。12种构建物含 有N-端延伸肽序列
[0143] 表2显示牛a野生型(WT)和所选的bFSH超激动剂一级氨基酸结构的比较。显示了牛 a野生型的N-端部分(总计96个残基的氨基酸残基1-32)和突变的牛a的N-端部分。5个超激 动剂精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代的位置在氨基酸C14和P25之间的阴影区被标记，编码为4R + 1K的5R。引入一个或两个另外的N-连接的碳水化合物链的所选4个不同插入片段在野生型 序列的氨基酸F6和T8之间被标记。
[0144] 表2中的片段如下所列：SEQ ID N0:44，WT bFSH;SEQ ID N0:23，bFSHa(5R);SEQ ID N0:24，bFSHa(4R+lK);SEQ ID N0:25，bFSHa(5R+Ins 1);SEQ ID N0:26，bFSHa(5R+ Ins2);SEQ ID N0:27，bFSHa(5R+Ins3);SEQ ID N0:28，bFSHa(5R+Ins4);SEQ ID N0:29， bFSHa(4R+lK+Ins 1);SEQ ID N0:30，bFSHa(4R+lK+Ins2);SEQ ID N0:31，bFSHa(4R+lK+ Ins3);SEQ ID N0:32，bFSHa(4R+lK+Ins4)。
[0145] 表2
[0147] 还产生了包含突变的马糖蛋白a亚单位，且一些实施方案包含K15R、E18R、K20R和 K24R的取代。例如SEQ ID N0:9;SEQ ID N0:38-40。此外，还产生了具有K15R、E18H、K20R和 K24R的马糖蛋白a亚单位(例如SEQ ID N0:41;SEQ ID N0:42)。这些突变的a亚单位还含有 所述亚单位的F6和T7之间的NVTINV的插入片段(例如SEQ ID N0:9、40和42)，或F6和T7之间 插入片段加上了7和了8之间的1爾插入片段(例如3￡〇10从):38、39和41)。
[0148] 相比基于lipofectamine的方法，使用聚乙稀亚胺(PEI)瞬时转染bFSH类似物导致 bFSH类似物表达的3.7-4.5倍增加(数据未显示）。基于杂二聚体-特异的ELISA的各种FSH类 似物的表达水平表明没有FSH二聚体形成的重大损失，且不支持单链构建物是实现高水平 表达所必需的之前声明。
[0149]瞬时表达的bFSH类似物的选择包括基于cAMP的体外生物测定和PK筛选测定(参见 图1和2)。相比猪FSH(pFSH-F〇Htr〇piii⑧-V)和bFSH对照，具有5R取代的bFSH的效力有显著 的3-4倍增加（图1A)。显然，不同于许多之前的研究（图lB)(Heik 〇pp，Eur.J.Bi〇Chem 261: 81-84，1999;Trousdale，Fertil ? Steril ? 91:265-270，2009)，已发现新颖的新糖基化插入 片段不降低牛FSH 5R类似物的体外生物活性（图1C)。在N-端添加的相同的新糖基化位点降 低bFSH的体外生物活性，这类似于新糖基化对红细胞生成素的固有活性的衰减作用 (Elliott,Exp.Hematol.32:1146-1155,2004；E1liott,Nat.Biotechno1.21:4144-421, 2003;Sinclair，J.Pharm. Sci .94:1626-1635，2005)和许多其它延长半衰期方法(包括定点 聚乙二醇化）的作用（Fishburn，J.Pharm. Sci ? 97:4167-4183，2008;Uchiyama，Vet ? J. 184: 208-211，2010)。在小鼠中两天的PK筛选研究表明，相比bFSH-WT和F:dltr〇;pill?-V而言所有 新糖基化的牛FSH"5R"类似物都具有增加的终末半衰期（图2A和2B)。来自PK筛选测定的数 据表明，相比bFSH-WT、F〇lltr〇f)ili?-V和TR4401对照，由于在一个或两个引入的新糖基化位 点（插入片段1和2)的糖基化，因此血浆半衰期得到了大大地延长。观察到的水平与具有29 个氨基酸接头和4-5个0-连接的碳水化合物链的bFSH-单链分子相当。作为组合的超激动剂 和新糖基化插入片段制得的两种初始测试的类似物(称为"插入片段1和2"）具有与单独的 5R超激动剂对照相当的体外生物活性（图1C)，且仍然在小鼠中具有延长的半衰期（图2B)。 此类长效且不减少超激动剂活性的类似物是之前没有的，且在牛体内转化为预期的引人瞩 目的性能。
[0150] 使用烧瓶、振动器、滚瓶和生物反应器利用CH0细胞重组产生(rFSH或rTSH)几百毫 克不同的人FSH和TSH。在初始工作期间，将双顺反子逆转录病毒载体系统优化以用于在 CH0-DG44细胞中高水平表达FSH和TSH类似物。测试了人rFSH制剂。单一 60yg剂量的rFSH诱 导卵泡发育，产生大量良好质量的胚胎，其与之前优化的8次Folltropin?-v(300mg)的注射 (每天施用两次，历时4天)匹配，这进一步支持其独特的性质如肌内注射后延迟的吸收，以 及增加的FSH受体停留时间。参见图3和5-8。10邱剂量的rFSH超激动剂显示超常的能力来募 集生长卵泡和在12天内维持其增强的汇聚，特别是3-5_尺寸范围的卵泡，已知它们在人体 中也具有低FSH受体数量(数据未显示hrFSH出人意料地增强和支持小卵泡，这在之前优化 的对照F〇lltr〇piii?-V的给药中没有观察到，其提供了一种新的方式以在周期的任意阶段 募集FSH响应性卵泡以及在多个由降低的FSH受体数目或功能引起的差的响应者中增强成 功IVF和超数排卵的潜能（Perez Mayorga，J. Clin .Endocrinology 152:3268-3369,2000; Levallet，Arch.Med.Red.30:486-494,1999;Rannikko，Mol.Hum.Reprod.8:311-317，2002; Cai，Feril. Steril. 87:1350-1356，2007)。然而，由于在具有4个精氨酸取代的基于牛FSH的 a亚单位和基于人FSH的a亚单位之间存在40个氨基酸的差异，因此在相同的牛中观察到一 些来自之前用rFSH治疗的后续效应，这与之前的数据研究一致，之前的数据研究显示人FSH 在兔和猕猴中的免疫原性性质（Cai，Int.J. Toxicol .30:153-161，2011 ;De Castro， Theriogenology 72:655-662,2009)〇
[0151]之前已显示将精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基引入通常的a-亚单位的所选修饰许可 区在进化过程中能调节糖蛋白激素的活性(Szkudlinski，Nat.Biotechnol. 14:1257-1263， 1996; Szkudlinski，Physiol. Rev. 82:473-502，2002)，且在与位于糖蛋白激素受体的铰链 区的带负电荷群簇的静电相互作用方面起了重要作用（Mueller，Trends Endocrinol.Metab.21:111-122,2010；Mueller,J.Biol.Chem.284:16317-16324,2009； Mueller，Endocrinol. 152:3268-3278,2011)。特异的 bFSH 超激动剂开发包括对4-5R和 / 或K 的最小取代以产生更有效力和更有功效的分子，该分子具有可能的延迟吸收以增加作用持 续时间，如本文数据以及其它对hFSH和其它糖蛋白激素类似物的研究所示（Szkudl inski， Physiol. Rev. 82:473-502，2002)。还研究了最小长度氨基酸插入片段，其含有一个或两个 碳水化合物新糖基化位点以增加半衰期来产生单一注入类似物而不降低所增加的超激动 剂效力/功效(参见图4)。对于进一步的分析，可以使用含有位于野生型序列的氨基酸6和8 之间的肽插入片段NVTINV、NVTINVT、NV和NVT的8种构建物。如本文的数据所示且不同于之 前的新糖基化和聚乙二醇化研究（Trousdale，Feril ? Steril ? 91:265-270，2009;Uchiyama， Vet J.184:208-211，2010;Perlman，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:3227-3235,2003)，可 设计最小长度的氨基酸插入片段，其含有复杂的碳水化合物以增加半衰期而不降低所增加 的超激动剂效力/功效。这些新颖的类似物可以通过使用优化的高表达系统方法使用PEI和 滚瓶在CH0-K1细胞中瞬时转染而表达。
[0152]通过瞬时转染表达的所选4-6种类似物的纯化可以通过以下进行:使用捕捉步骤 使用SP Sepharose柱，然后使用Mono Q离子交换色谱法选择类似物，然后使用凝胶过滤进 行最终精制(polishing) AFSH类似物的纯度可以大于98%。累积回收可达50%，且具有总 共50倍纯化。所有类似物都可以通过ELI SA免疫测定、使用CH0-FSHR细胞系的稳健体外cAMP 生物测定、SDS-PAGE电泳和等电点聚焦(IEF)凝胶分析而进行体外表征。所选的纯化类似物 还可以通过严格定量通过反相HPLC、碳水化合物组成分析以及稳定性和聚集状态评估而分 析。
[0153] 其它实验产生了牛FSH类似物TR55601(a亚单位:SEQ ID N0:7)，其包含在a亚单位 的151(、171(、181(、201(和241(取代为精氨酸(1〇以及在€[亚单位的6?和71'之间的附1'1爾(3￡0 10 N0:1)插入片段。生成了几个批次的TR55601且使用IEF和蛋白质印迹分析进行测试。图3A-D 显示该分析的示例性结果。图3A-3D部分证实TR55601/批次4和批次5展示最佳分布且验证 了突变在该批次的有效性。在动物治疗中使用批次4和5以及具有类似筛选结果的批次。例 如，在图3A-C中，IEF-蛋白质印迹分析显示了批次4和批次5的TR56001的优化酸性亚型。另 一方面，如图3A和3C中所示，批次3未被完全验证且未用于动物治疗中。还利用PK筛选测定 在小鼠中对bFSH类似物且特别是TR55601的样品进行了研究。对小鼠皮下注射所选的bFSH 样品且在注射后24、32和48小时获取血样。分离血浆且用&?311￡1134(￡11(10(^111 6 Technologies公司）分析。利用PK筛选测定确认TR55601样品的批次4的延长的半衰期。数据 未显不。
[0154] 所选候选类似物的完全药代动力学分布可以通过皮下施用单剂量的lOiig/大鼠且 在跨越分布期和消除期两者的1 〇个不同的血液收集时间（1、5、15、30min和1、2、6、24和48h) 进行。牛FSH血浆水平可以在血浆中使用bFSH-ELISA定量。可以进行完全的PK分析。
[0155] 选择类似物以用于构建双顺反子表达载体，且在CH0-DG44细胞中选择和扩增类似 物表达为在牛中进行大规模生产、纯化和超数排卵研究做准备。将CH0-DHFR(-)DG44细胞与 所述表达载体共转染且在含有逐步增加的甲氨蝶呤(MTX)的培养基中进行基因扩增。细胞 在恢复它们的多边形形态后（2-3周）有资格用于随后的扩增步骤。分泌水平>2pg/细胞/天 的克隆可以进行第二次处理，旨在扩增GS标记基因(MSX)。可以获得额外的2-5倍增加，达到 高达l〇pg/细胞/天的分泌水平。
[0156] 使用a亚单位类似物的制备和实验
[0157] 尽管在单一肌内（I.M.)注射后rFSH诱导超数排卵响应，且60yg似乎非常接近最佳 剂量，但当母牛暴露于rFSH三次或更多次时，超数排卵响应显著降低。因此，设计实验以检 测一种新的rFSH制剂，称为TR 55601rFSH，其包含具有"5R"取代和在F6和T7之间的NVTINV 插入片段的a亚单位(SEQ ID N0:7)。目的是首先确定用rFSH单一或分次剂量治疗在肉用母 牛中诱导超数排卵响应的效果，然后进一步评价单一注射rFSH的超数排卵响应和确定当母 牛暴露于rFSH两次或三次时超数排卵响应是否保持较高。
[0158] 在大鼠体内使用经典Steelman-Pohley FSH生物测定分析TR55601FSH样品 (Steelman等人，Endocrinol ? 53:604-616，1953)。对雌性Sprague-Dawley大鼠（200_220g) 注射单一剂量的补充有40IU hCG的测试制品（例如bFSH)或媒介物。在给药后72小时测量卵 巢重量。参见图4。各组用hCG治疗以提供基线。TR55601bFSH在所有浓度均显著增加卵巢重 量。
[0159] 图5显示超数排卵、诱导排卵和固定时间人工受精的卵泡波同步方案，其中 Folltropin-VR(Bioniche)的8次注射用单次或两次注射TR55601代替。治疗包括在第0天插 入释放孕酮(P4)的阴道内设备和施用苯甲酸雌二醇(BE)。利用作为单一或两次注射给予的 TR55601在第4天开始超数排卵治疗。第二分次剂量注射与PGF 24^疗在第6天同时发生。在第 7天最后注射FSH后去除孕酮设备。在第8天供体接受猪LH且在12h和24h后在没有发情期检 测的情况下受精，或在第8天受精一次(pLH后16h)。在第15天非手术地收集卵细胞/胚胎(2， 3) jolltropin-V?用作对照;在8次肌内（IM)注射中给予总共300mg*，每天两次，历时4天 (mg*_基于高度不纯的NIH-FSH-P1参照标准）。
[0160]具体地说，基于之前的胚胎产生史将30只非泌乳Red Angus母牛分层且分组，并随 机分配至三个治疗组之一。对照组(n=10)中的母牛接受300mg Folltropin-V，每天两次以 逐渐降低剂量的方案肌内施用，历经4天的周期。具体地：第4天，3.0mL(am和pm);第5天， 2? 5mL(am和pm);第6天，1 ? 5mL(am和pm);和第7天，0? 5mL(am和pm) dFSH 60iig治疗组中的母 牛接受单一肌内注射60yg rFSH，且rFSH 40-20yg治疗组中的母牛在第4天接受肌内注射40 yg rFSH，然后在第6天再肌内注射20yg rFSH。
[0161] 然后，30只母牛中的25只再用Folltropin-V(对照）或单一注射60ygrFSH进行超刺 激。对照组(n= 10)中的动物保持在对照组中，且实验1中以rFSH 60yg治疗的10只母牛中的 8只再通过单一肌内注射rFSH而治疗。而且，之前用分次-单一注射rFSH治疗的10只母牛中 的7只用单一肌内注射rFSH治疗。胚胎收集之间的间隔为29天。
[0162] 第二实验中使用的25只母牛中的24只再用Folltropin-V(对照）或单一注射60yg rFSH进行超刺激。同样，对照母牛保持在对照组中且rFSH母牛保持在rFSH组中。胚胎收集之 间的间隔为30天。
[0163] 在第0天(实验开始），所有动物均接受5mg雌二醇-170加上50mg孕酮和充满孕酮的 阴道内设备(Cue_Mate，Bioniche Animal Health)。在第4天(卵泡波出现的预期天），所有 母牛根据上述组进行超刺激。单一肌内注射rFSH的60yg剂量构成了 7.5mL，且Fo 11 tropin-V 以降低剂量的方案在8次肌内注射中施用。所有动物均在第6天早上和晚上肌内接受500yg 氯前列醇(Cyclase，Syntex，Argentina) Xue-Mate在第6天晚上移除。在第8天早上，母牛接 受lOOyg戈那瑞林（gonadorelin)(Gonasyn，Syntex Argentina)且在 12和24小时后受精。所 有母牛均用来自同一公牛的冷冻精液受精。卵细胞/胚胎在第15天非手术收集且根据IETS 推荐进行评价。
[0164] 所有母牛均在第0天、第4天、第6天和第8天超声检查CL的存在以及卵泡尺寸和数 量且确定卵泡生长概况。在第15天通过超声波检查和直肠触诊计数CL和直径>10mm的卵泡 的数量而确认排卵响应。
[0165] 在各实验中，首先评价数据点的正态性和方差齐性。因为方差在组间不同，所以通 过平方根转换数据且通过单因素AN0VA进行分析。将通过双因素AN0VA对三次实验得出结论 后的总体响应进行分析以检测实验次数和治疗以及它们的相互作用的作用。通过受保护的 LSD测试比较平均值。通过MIXED程序分析卵泡数据以检测治疗、天数和它们的相互作用对 卵泡数和生长概况的作用。所有分析均使用Infostat Analytical软件（Universidad Nacional de Cordoba，Argentina)进行。
[0166] 超数排卵响应和卵细胞/胚胎数据汇总于表3中。尽管在卵细胞/胚胎收集当天CL 和具有< 2CL的母牛的平均数在组间没有差异，但分次-注射的rFSH导致更高(P〈0.05)数量 的未排卵卵泡。总卵细胞/胚胎、受精的卵细胞和可转移胚胎(1、2和3级）的平均数也没有差 异。
[0167] 表3显示使用单一或分次-单一剂量的TR55601(rFSH)的超数排卵。
[0168] 表3:在用单一 (60yg)或分次-单一 (40-20yg)肌内注射的rFSH(TR55601)或以每天 两次肌内注射给予的300mg F〇lltr〇Pin?-V(对照）治疗4天的肉用母牛中，黄体(CL)、直径〉 10mm的卵泡、在卵细胞/胚胎收集时具有< 2CL的母牛的数量、卵细胞/胚胎的数量、受精的 卵细胞的数量和1、2和3级胚胎(可转移胚胎）的数量的平均（±SEM)数。
[0170] 第二次给药的超数排卵响应和卵细胞/胚胎数据汇总于表4和5中。在卵细胞/胚胎 收集当天CL、>10mm的卵泡和具有< 2CL的母牛的平均数在组间没有差异。总卵细胞/胚胎、 受精的卵细胞和可转移胚胎(1、2和3级）的平均数在组间也没有差异。
[0171] 表4和5显示使用单一施用TR55601(rFSH)的超数排卵。
[0172] 表4.CL、直径>10mm的卵泡和在卵细胞/胚胎收集时具有< 2CL的母牛的数量的平 均（土SEM)数。母牛用单一（60yg)肌内注射的rFSH或以每天两次肌内注射给予的300mg Fo 11 tr op i n_V (对照）治疗4d。
[0174] 表5.在用单一（60yg)肌内注射的rFSH(TR55601)或以每天两次肌内注射的300mg Folltropin-V*8^对照)治疗4天的肉用母牛中，卵细胞/胚胎、受精的卵细胞和1、2和3级胚 胎(可转移胚胎）的数目的平均（土 SEM)数。
[0176] 对于最终给药实验，此时仅可得到卵泡数据。在受精前那天的卵泡生长概况和卵 泡数在rFSH组和Folltropin-V组之间没有显著差异。排卵和卵细胞/胚胎数据不久即可得 到且将对实验3单独呈现，然后与实验1和2组合。可得到实验3的卵泡数据且已将其与实验1 和2的数据组合并呈现在表6中。
[0177] 表6显示以30天的间隔使用TR55601(rFSH)的三次超数排卵。
[0178] 表6.在用单一 (60yg)或分次-单一 (40-20yg)肌内注射的rFSH(TR55601)或以每天 两次肌内注射给予的300mg Fo 11 tropin-V(对照）治疗4天的肉用母牛中，CL、直径> 10mm的 卵泡、在卵细胞/胚胎收集时具有< 2CL的母牛的数量、卵细胞/胚胎的数量、受精的卵细胞 的数量和1、2和3级胚胎(可转移胚胎）的数量的平均（±SEM)数。母牛以~30天间隔连续治 疗三次(组合3次实验）。
[0180]从治疗开始直到紧接人工受精之前的卵泡特征示于表7和图6-9中。
[0181] 表7显示非泌乳母牛在超数排卵模型中的卵泡数。卵泡发育(平均值土SEM)通过超 声波检查肉用母牛而检测，所述肉用母牛用通过单一肌内注射给予的60yg rFSH或每天两 次肌内注射给予的300mg Fol ltropin?-V治疗4天。
[0182] 表7.
[0184] 直径3至5mm的卵泡数在治疗组间没有差异（图6)。直径6至8mm的卵泡的数量（图 7)、>9mm的卵泡的数量(图8)或在历经所述治疗天数的平均卵泡直径（图9)也没有差异。
[0185] 该系列实验中所得的结果可以被解释为表明rFSH产物诱导的肉用母牛的超数排 卵响应与Folltropin-V的没有不同。当母牛被连续治疗三次时，相比Folltropin-V，超数排 卵响应也没有下降的迹象。最终给药中的超数排卵响应似乎类似于前两次给药，这将在卵 细胞/胚胎收集后得到确认。对于用rFSH治疗的母牛中更大量的未排卵（>10mm)卵泡（主要 是由于两头母牛中存在大量的未排卵的卵泡)存在关注，这需要进一步研究。还需要更多研 究来确定使肉牛和奶牛超数排卵的rFSH最佳剂量和确定用rFSH连续治疗三次以上的长期 效果。
[0186] 插入片段对改善的半衰期的特异性
[0187] 为了确定观察到的改善的半衰期是否对SEQ ID NO: 1插入片段的序列特异，对具 有该插入片段的人a亚单位进行修饰以去除氨基终末缬氨酸。然后将这两者与缺少该插入 片段的类似物一起测试它们产生cAMP的能力。研究显示该插入片段是序列特异的且赋予a 亚单位优异的结合和半衰期(参见图10)。然后在各种生长条件下检查产生条件以针对最大 产生进行优化(参见表8)。
[0188] 表8显示人a亚单位的产生的优化。
[0190] 然后将该插入片段与牛的对应物一起进行检查，且确认增加的半衰期是插入片段 的序列所特异的(参见图11)
[0191] 示例性eCG类似物
[0192] 基于野生型马亚单位构建突变的马a亚单位样品。使用所述突变的马a亚单位产生 功能性eCG。下表9显示所述马a亚单位中的取代(用下划线标记)和插入(用下划线和斜体标 记）。基于所述突变a亚单位的eCG类似物被标记为类似物2号、3号和4号。
[0193] 表9
[0194]
[0195] 使用eCG的LH受体测定
[0196] 进行实验以检查马CG类似物对于表达黄体化激素(LH)受体的细胞的作用。
[0197] 图12显示在表达啮齿动物LH受体的293细胞中通过野生型马CG和突变的马CG进行 cAMP刺激3小时。具体地说，在刺激前24小时将CHO-rLHR细胞平铺于96孔板中。然后将所述 细胞与稀释于补充有ImM异丁基甲基黄嘌呤（IBMX)的生长培养基中的不同浓度的eCG制备 物和阴性对照Gonal-F(纯化的人FSH)在37°C孵育3小时。通过商品化cAMP ELISA(cAMP EIA Kit，Cayman Chemical)测量培养基中积累的cAMP。使用CH0-K1细胞中的瞬时转染产生所有 类似物。使用马CG Elisa(Endocrine Technologies)确定使用来自EMD Millipore的 Centriprep YM-10，10kDa过滤的培养基中的类似物浓度。通过使用偏磷酸的pH分馏法和两 步乙醇沉淀获得PMSG(妊娠母马血清促性腺激素，马CG)。
[0198] 图13显示基于在表达大鼠LH受体(rLHR)的MLTC-1细胞中的孕酮刺激的eCG类似物 (2号、3号和4号）的体外LH生物活性。具体地说，在刺激前24小时将MLTC-1-rLHR细胞平铺于 96孔板中。然后将所述细胞与稀释于补充有ImM异丁基甲基黄嘌呤（IBMX)的生长培养基中 的不同浓度的eCG制备物和阴性对照Gonal-F(人FSH)在37 °C孵育6小时。通过商品化孕酮 ELISA(EIA Kit,DRG Instruments)测量培养基中积累的孕酮。使用CH0-K1细胞中的瞬时转 染产生所有类似物。使用马CG Elisa(Endocrine Technologies公司）确定使用来自EMD 皿;1111。〇^的〇6111：1^。代。￥11-10，101^^过滤的培养基中的类似物浓度。计算生物活性与免 疫反应性之比(B/1)并与对照PMSG制备物的B/1比较。
[0199] 如图12-13中所示，野生型马CG和突变的马CG能够激活啮齿动物LH受体。图12-13 还显示包含在15、18、20和24位置处的取代的突变的马CG与野生型马CG和PMSG相比展示增 强的生物活性。
[0200] 使用eCG的FSH受体测定
[0201 ]进行实验以检查马CG类似物对于表达促卵泡激素(FSH)受体的细胞的作用。
[0202] 图14显示基于在稳定表达野生型人FSH受体(hFSHR)的CH0细胞中的cAMP刺激的 eCG类似物(2号、3号和4号）的体外FSH生物活性。通过使用偏磷酸的pH分馏法和两步乙醇沉 淀获得PMSG(妊娠母马血清促性腺激素，马CG)。具体地说，在刺激前24小时将CH〇-hFSHR细 胞平铺于96孔板中。然后将所述细胞与稀释于补充有ImM异丁基甲基黄嘌呤（IBMX)的生长 培养基中的不同浓度的eCG制备物和对照Gonal-F(高度纯化的人FSH)在37 °C孵育2小时。通 过商品化cAMP ELISA(cAMP EIA Kit,Cayman Chemical)测量培养基中积累的孕酮。使用 CH0-K1细胞中的瞬时转染产生所有类似物。使用马CG Elisa(Endocrine Technologies)确 定使用来自EMD Millipore的Centriprep YM-10, lOkDa过滤的培养基中的类似物浓度。 [0203] 如图14中所示，野生型马CG和突变的马CG能够激活人FSH受体。图14还显示包含在 15、18、20和24位置处的被取代的突变的马06与野生型马06和?1^6相比展示增强的生物活 性。
【主权项】
1. 一种被修饰的糖蛋白激素，其包含在α亚单位的α-Ll环中具有至少一个碱性氨基酸 取代并且在所述α亚单位的Ν-末端附近具有一个或多个插入片段的氨基酸序列，其中与野 生型糖蛋白激素相比所述插入片段向所述α亚单位中引入NXlNXASNNXsX*糖基化位点， 并且Χι、X 2、X3和X4独立地为任何氨基酸。2. 根据权利要求1所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的每一个均包含 NXdSNXA，并且XjPX2独立地为除脯氨酸以外的任何氨基酸。3. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的每 一个均包含ΝΧιΤ。4. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段在所述 野生型糖蛋白激素 α亚单位的F6和T7之间，并且所述野生型糖蛋白选自由SEQ ID NO: 2、3、 4、5、47和50组成的组。5. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中存在单一插入片段并 且所述插入片段是似"丫似:且丫为V或I。6. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段是 NVTINV(SEQ ID Ν0:1)〇7. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中XdPX2独立地为V、I或 Α〇8. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段向所述 α亚单位中引入两个ΝΧιΤ糖基化位点。9. 根据权利要求8所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述两个N&T糖基化位点由单一氨 基酸V或I分开。10. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述插入片段中的 每一个均包含NN并且X3和X4独立地为T或S。11. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中Χ3Χ4为ΤΤ、TS、ST或 SS〇12. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述 NNX3X4糖基化中的至少一个氨基酸不是所述插入片段的一部分。13. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15、17、18、20或24氨基酸位置处包含至少一个碱性氨基酸取代。14. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15、17、18、20或24氨基酸位置处包含至少两个碱性氨基酸取代。15. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15、17、18、20或24氨基酸位置处包含至少三个碱性氨基酸取代。16. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15、17、18、20或24氨基酸位置处包含至少四个碱性氨基酸取代。17. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15、17、18、20和24氨基酸位置处包含五个碱性氨基酸取代。18. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置处包含至少一个碱性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID N0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。19. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置处包含至少两个碱性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。20. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置处包含至少三个碱性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。21. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K或24K氨基酸位置处包含至少四个碱性氨基酸取 代，其中所述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID Ν0:2、3、4、5、47、50、53、55、57、 59、61、63、67和69的氨基酸序列。22. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K和24K氨基酸位置处包含五个碱性氨基酸取代，其 中所述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID勵:2、3、4、5、47、50、53、55、57、67和69 的氨基酸序列。23. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的15K、17K/17G/17L、18K/18E和24K氨基酸位置处包含四个碱性氨基酸取代，其中所 述野生型糖蛋白激素 α亚单位具有选自SEQ ID ΝΟ:59、61和63的氨基酸序列。24. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其在野生型糖蛋白激素 α 亚单位的12Κ、14Κ、15Ε、17Ν和21Κ氨基酸位置处包含五个碱性氨基酸取代，其中所述野生型 糖蛋白激素 α亚单位具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列。25. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其进一步包含黄体化激 素(LH)的β亚单位。26. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其进一步包含绒毛膜促 性腺素(CG)的β亚单位。27. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其进一步包含促卵泡激 素(FSH)的β亚单位。28. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其进一步包含甲状腺刺 激激素(TSH)的β亚单位。29. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述碱性氨基酸是 精氨酸。30. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述α亚单位源自哺 乳动物α亚单位。31. 根据权利要求30所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述α亚单位源自人、牛、犬、猫、 马、猪、绵羊、虎、狮、熊猫、负鼠或兔α亚单位。32. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述α亚单位源自鸟 类α亚单位。33. 根据前述权利要求中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素，其中所述α亚单位源自鱼 类α亚单位。34. -种用于在动物中刺激糖蛋白激素受体的方法，其包括向所述动物施用权利要求 1-33中任一项所述的被修饰的糖蛋白激素。35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物是牛、猪、马、绵羊、羊驼、白臀野 牛、野牛、胳盤、猫、鹿、狗、虎、狮、熊猫、斑马、驴、大额牛、山羊、天竺鼠、美洲盤、兔、驯鹿、水 牛或牦牛。37. 根据权利要求34所述的方法，其中所述动物是鸟类。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述鸟类是鸡、鸭、火鸡、鹅、鸽子、珍珠鸡或鸵 鸟。39. 根据权利要求34所述的方法，其中所述动物是鱼类。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述鱼类是鲤鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲈鱼、 鲷或石斑鱼。
【文档编号】A61K38/16GK105873602SQ201480071711
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年11月5日
【发明人】M·斯库德林斯基, B·D·温特劳布
【申请人】特洛佛根股份有限公司