抑制酪氨酸酶表达的双链rna寡核苷酸的利记博彩app

抑制酪氨酸酶表达的双链rna寡核苷酸的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及包含抑制酪氨酸酶表达的双链RNA寡核苷酸的组合物。本发明还涉及双链RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表达中的用途以及用于预防形成和/或消除色素形成斑，和/或老年斑，和/或用于增亮和/或漂白褐色皮肤和/或使褐色皮肤颜色均匀的用途。
【专利说明】
抑制酪氨酸酶表达的双链RNA寡核苷酸
[0001 ] 本申请是申请日为2006年9月20日的申请号为201210065389.9的题为"抑制酪氨 酸酶表达的双链RNA寡核苷酸"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及新的用于降低酪氨酸酶表达的双链RNA寡核苷酸，其在化妆和/或药学 目的上的用途，以及它与大小小于或等于lMiZ电势为10-80mV的阳离子型颗粒的缔合。
【背景技术】
[0003] 酪氨酸酶(单苯酚二羟基苯丙氨酸:氧氧化还原酶EC 1.14.18.1)是参与皮肤色素 形成机制的必需酶。它具体催化以下反应:依靠其羟化酶活性催化酪氨酸转变成多巴(二羟 基苯丙氨酸)并且依靠其氧化酶活性将多巴转化成多巴醌(dopaquinone)。酪氨酸酶只有在 某些生物因子的作用下处于成熟状态时才起作用。
[0004] 该酶在治疗如黑色素瘤（Riley等，J.Immunother. 2001，21，212-220)或者Vogt-Koyanagi-Harada病（Read等，Curr.Opin.Ophthalmol ?，2000，11，437_442)的疾病中也是有 利的。
[0005] 皮肤色素形成的形成机制，也就是黑色素的形成，是特别复杂的，且示意性地包括 下面的主要步骤：
[0006] 酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-黑色素
[0007] 因此，人类皮肤的色素形成是由树突细胞、黑色素细胞合成黑色素而导致的。后者 含有被称为黑素体的细胞器，其是黑色素生物合成的部位。黑素体在沿着树突迀移后，从黑 素细胞转移到角质形成细胞。然后在表皮分化过程中，角质形成细胞被转运到皮肤表面 (Gilchrest BA,Park HY,Eller MS,Yaar M,Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation.Photochem Photobiol 1996;63:1-10;Hearing VJ,Tsukamodo K， Enzymatic control of pigmentation in mammals.FASEB J 1991;5:2902-2909) 〇在黑素 原生成酶中，酪氨酸酶是催化黑色素合成前两个步骤的关键酶。酪氨酸酶的纯合突变导致I 型眼皮肤白化病，所述I型眼皮肤白化病特征是黑色素合成的完全丧失（Toyofuku K，Wada I,Spritz RA,Hearing VJ,The molecular basis of oculocutaneous albinism type 1 (0CA1)：sorting failure and degradation of mutant tyrosinases results in a lack of pigmentation.Biochem J.2001；355:259-269)〇
[0008] 由于着色过度紊乱是由黑色素生产的增加导致的，所以人们发现开发新的治疗方 法很重要，其原理是基于抑制酪氨酸酶的活性。
[0009] 大多数已知的亮肤(skin-lightening)化合物是酸类/儿茶酸类。这些化合物抑制 酪氨酸酶，但是这些化合物的绝大多数对黑色素细胞具有细胞毒性，这会导致皮肤的永久 性褪色。
[0010] 因此，看起来既高效又表现出好的耐受性的新的酪氨酸酶抑制化合物应用于人类 是有利的。
[0011] 最近，双链RNA dsRNA寡核苷酸，且更具体是siRNA寡核苷酸（12至40个核苷酸的） 的应用，使得在如皮肤护理或头发护理的化妆领域，以及皮肤病学领域和药学领域获得特 别的活性成为可能。
[0012] 然而，已知siRNA在体内应用存在各种困难。
[0013] 除了在局部应用这些SiRNA时，为使其到达靶细胞的这些SiRNA的穿透问题之外， 特别是由于穿过角质层的困难，经验已显示施用siRNA，如很多出版物报道的会触发干扰素 应答（Sledz CA等，Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol.2003;9:834_9.Katalin Karik6等，Small Interfering RNAs Mediate Sequence-Independent Gene Suppression and Induce Immune Activation by Signaling through Toll-Like Receptor 31.J.Immunol.2004；172:6545-6549.Judge AD 等，Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA.Nat Biotechnol .2005;23:457-62)，而且还会诱导或抑制非siRNA革巴向 的基因的表达（Jackson等，Expr ession profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol.2003;21:635-7)，这两种现象都是非常不合需要 的。
[0014] 专利申请US 2004/0215006描述了有抗酪氨酸酶活性的双链的和反义单链的RNA 寡核苷酸;所用的实施例只涉及反义单链RNA寡核苷酸。具体地，它没有证明与这些反义RNA 同源的siRNA是否有效。
[0015] 一些作者已强调，如siRNA的双链RNA寡核苷酸和反义单链RNA寡核苷酸具有不同 的革E1，且反义RNA的活性不能外推到相同序列的s iRNA (Xu等，Effective smal 1 interfering RNAs and phosphorothioate antisense DNAs have different preferences for target sites in the luciferase mRNAs.BBRC 2003;306:712-717)。
[0016] 此外，在该文献US 2004/0215006中，提出的siRNA的浓度是50-200nM。如上所指出 的，Jackson等已经描述了未被在浓度为100nM时使用的siRNA革E1向的基因的强的正调节和 负调节。
[0017] 类似地，在W0 2005/060536中，描述了特异性抑制酪氨酸酶的siRNA，其所提出的 浓度范围非常宽，且可能导致组合物中包含了非常大量的siRNA，由此会观察到非siRNA靶 向的基因的正调节和负调节。
[0018] 在化妆或治疗用途的范围内，这种非靶向基因的调节是不能接受的，特别是由于 它不可预见的特性。
[0019] 本
【申请人】已开发了特异性抑制酪氨酸酶表达的新的siRNA，从所述siRNA中选择展 示一定活性的siRNA，从而所述siRNA可在小于或等于InM的剂量下使用。
[0020] 除了解决涉及诱导非特异基因的问题之外，本
【申请人】已证实了这些siRNAs序列不 会诱导干扰素应答。
[0021 ]为此，按照Invitrogen公司销售的 "BLOCK-iT? RNAi Stress Response Control Kit(Human)for monitoring interferon-mediated stress response to double-stranded RNA in human cells"的手册中描述的方案，测量了已知受干扰素诱导的0AS-1 和IFIT-1 (干扰素诱导的三十四肽（tetratricopeptide)重复结构域)基因的表达（Stefan F.Wieland等，Searching for Interferon-Induced Genes that inhibit Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mouse Hepatocytes,J.of Virology 2003,77:1227-1236)。
[0022] 此外，这些酪氨酸酶特异性siRNA与大小小于或等于lwnZ电势为10-80mV的阳离 子型颗粒缔合，使得可能非常显著地提高所述siRNA向如皮肤的三维模型的靶细胞的穿透。 一旦穿透，酪氨酸酶特异性siRNA就变得有活性。
[0023] 穿透可通过与siRNA附着的荧光标记进行评价，且其活性可通过定量PCR对靶信使 进行定量或通过测定对应于靶信使的蛋白而进行评价。
[0024] 本发明的阳离子型颗粒可以是表面活性剂胶束、嵌段或非嵌段聚合物胶束、阳离 子脂质体和非离子表面活性剂微囊（niosome)、阳离子油质体、阳离子毫微乳剂 (nanoemulsion)、以及阳离子有机或无机颗粒和毫微胶囊(nanocapsule)。

【发明内容】

[0025]这样，本发明的第一个主题涉及一种选自寡核苷酸序列SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48，任选地经过修饰的双链1?祖寡核 苷酸(也称作dsRNA或siRNA)。
[0026] 利用dsRNA，且更具体是siRNA(短干扰RNA)，使得通过降解编码靶蛋白的mRNA而获 得特异性抑制该蛋白合成的活性成为可能。祀mRNA的降解通过RISC复合体(RNA诱导的沉默 复合体）的活化而实现，所述RISC复合体通过dsRNA的反义链与mRNA的结合而发挥其作用 (参见Tuschl T.Chem.Biochem.2001;2:239-245;Nykanen A&al，Cell 2001;107:309-321; Dorsett Y?和Tuschl T.Nat Rev Drug Discov.2004;3:318_329;Downward J.BMJ.2004; 328:1245-1248; Shanker P?等，JAMA 2005;293:1367-1373)。
[0027]实现的分子结构包括由12-40个核苷酸，优选23-27个核苷酸组成的双链RNA片段。 [0028] 这些双链RNA寡核苷酸可优选地由同源的有义链以及与人酪氨酸酶mRNA(GenBank 登记号NM_000372)序列互补的反义链组成。该双链RNA寡核苷酸具有平头末端或者有2-6个 核苷酸的不配对末端。
[0029] 双链RNA寡核苷酸可通过多种手动的或自动的、体内的或体外的方法合成。
[0030] 体外合成方法可以是化学方法或者酶法，例如利用RNA聚合酶(例如通过，T3、T7或 者SP6)，其会对选定的DNA(或者cDNA)序列模型进行转录。
[0031] 下列文献中描述了许多种体内合成双链RNA的方法;它们可在各种细菌细胞类型， 或者高等生物细胞类型中进行（Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual， 第二版（1989)，DNA cloning，第I卷和第II卷，D.N.Glover(1985版），Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gaits(1984版），Nucleic Acid Hybridation，B.D?Hames和S?J?Higgins (1984版），Transcription and Translation B.D.Hames和S.J.Higgins(1984版），Animal Cell Culture，R.I?Freshney(1986版），Immobilized Cells and Enzymes,IRL Press (1986)，B.Pertal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)，Gene Transfer Vectors for Mammalian Ce11s，J?H?Mi 11er和M?P?Calos，Co Id Spring Harbor Laboratory(1987版），Methods in Enzymology，154卷，Wu和Grossman，以及155卷，Wu， Mayer和Walker(1987)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press，London，Scopes(1987)，Protein Purification：Principle and y Practice，第二版，Springer-Verlag，N.-Y?以及Handbook of Experimental Immunology, 第1-17卷，(：.0.如化和0：.813〇1^611(1986))。还可参考专利申请而01/36646、而01/ 75164以及US 2003/0088087中描述的合成方法。
[0032]优选地，本发明的双链RNA寡核苷酸通过在2 位置添加-0-甲基基团进行修饰。 [0033] 双链RNA寡核苷酸可进行各种修饰，所述修饰具体是如文献US 2004/014956中所 述的修饰。
[0034] 有利地，修饰会导致双链RNA寡核苷酸更为稳定，而且更优选地，导致双链RNA寡核 苷酸不会引起干扰素应答，这种性质对于体内应用是必需的。这些双链RNA寡核苷酸还可对 有义链进行修饰，从而使得其不能被整合入RISC，并从而不会引起副作用。
[0035] 优选地，将使用SEQ ID ^)3.1、2、4、13、16、35、37、40和42的双链1?祖寡核苷酸，按 照下文实施例2的方案所测量的，其在0.016nM时具有的酪氨酸酶mRNA降解效率大于50 %。 [0036] 本发明的主题还涉及包含至少一种选自寡核苷酸序列SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的双链1?熟寡核苷酸的组合物。
[0037] 在该组合物中，双链RNA寡核苷酸的存在浓度是小于或等于100iiM，优选小于或等 于10yM，且更优选小于或等于lyM。
[0038] 本发明的组合物优选适于局部施用于身体表面，也就是皮肤、体被、粘膜以及眼 睛。
[0039] 在本发明的一个优选的实施方案中，双链RNA寡核苷酸与大小小于或等于ImiZ电 势为10-80mV的阳离子型颗粒缔合。
[0040] 在该实施方案中，双链RNA寡核苷酸会粘附到颗粒的表面，后者用作为载体以使其 穿透进入皮肤结构和进入皮肤、粘膜或眼睛的靶细胞而用于化妆、皮肤病学和/或眼的应 用。
[0041] 本发明的阳离子型颗粒是这样的颗粒，其大小小于或等于1M1，优选小于或等于 500nm，更为优选小于或等于300nm，可能采用，例如Brookhaven公司的激光颗粒分级器的 BI90plus型测量所述大小，且G电势为10_80mV，所述电势可用Coultronics公司的（仪DELSA 440型进行测量。
[0042] 阳离子型颗粒可选自表面活性剂胶束，具体是非离子两亲型表面活性剂和阳离子 表面活性剂胶束，嵌段聚合物胶束，具体是阳离子两亲型嵌段聚合物胶束、非离子两亲型嵌 段聚合物和阳离子两亲型嵌段聚合物胶束和非离子两亲型嵌段聚合物和阳离子表面活性 剂胶束，非离子和阳离子表面活性剂脂质体，非离子表面活性剂微囊，油质体，毫微乳剂颗 粒，毫微胶囊，有机颗粒或无机颗粒。
【具体实施方式】
[0043]下面且以未穷尽的方式列举根据本发明可用的阳离子型颗粒。
[0044] 表面活性剂胶束
[0045]我们回想一下，胶束是当两亲型分子溶于水中或油中，在超过某一特定的称为临 界的:CMC浓度时自发形成的聚集体。
[0046] 可用于本发明范围内的胶束由至少一种阳离子表面活性剂组成。该阳离子表面活 性剂可与一种或多种非离子两亲型表面活性剂缔合。
[0047] 本领域技术人员可以从McCutcheons的 "emulsifiers and detergents" 1998版以 及其后的版本中方便地选择非离子和阳离子的表面活性剂。
[0048] 作为非限制性的例子，下面列出了本发明范围内可用的阳离子表面活性剂。
[0049]非限制地，可用的非离子表面活性剂是:PE0、甘油和聚甘油、氧乙烯化或未氧乙烯 化的山梨聚糖、蔗糖、氧乙烯化或未氧乙烯化的葡萄糖、麦芽糖、PP0-PEQ的烷基和聚烷基 (C6至C30，饱和的或未饱和的，分支的或未分支的)酯或醚。
[0050] 就非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的混合物来说，其各自的重量比将为 99/1至1/99。
[0051] 形成胶束的表面活性剂的量将取决于后者的CMC。然而，在本发明中，胶束表面活 性剂的浓度以其重量计算相对于组合物总重量为0.1-10%，且优选为0.2-5%。
[0052] 嵌段聚合物胶束
[0053]两亲型嵌段聚合物胶束可按照文献W0 04/035013中描述的方法进行制备。
[0054]用于制备与根据本发明的dsRNAs缔合的胶束的嵌段共聚物具体是两亲型嵌段聚 合物，其优选为非离子的，二嵌段或三嵌段，且其与水接触能形成胶束。它们具体是二嵌段 (A-B)或三嵌段(A-B-A)的类型，A对应于非离子亲水聚合物嵌段而B对应于疏水聚合物嵌 段。该聚合物的分子量可为1000至100 000,而A/B的比率可为1/100至50/1。
[0055]在本发明中，可用到三种类型的胶束：
[0056]-阳离子两亲型嵌段聚合物胶束；
[0057]-非离子两亲型嵌段聚合物与阳离子两亲型嵌段聚合物缔合的混合胶束;和 [0058]-非离子两亲型嵌段聚合物与阳离子表面活性剂缔合的胶束。
[0059] 非离子亲水聚合物嵌段可选自聚环氧乙烷(PE0)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
[0060]疏水聚合物嵌段可选自聚苯乙烯、聚（叔丁基苯乙烯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚 (丙烯酸乙酯）、聚（丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（乙酸乙烯酯）、聚己酸内酯、聚己 内酰胺、聚二甲基硅氧烷、聚(C 3_C6环氧烷）、聚(天冬氨酸）、聚(乳酸）、聚（乙醇酸）、聚亮氨 酸、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯。
[0061] 嵌段共聚物优选选自下列嵌段共聚物：
[0062] -聚环氧丙烷/聚环氧乙烷 [0063]-聚苯乙烯/聚氧乙烯
[0064]-聚（甲基丙烯酸甲酯)/聚氧乙烯
[0065]-聚（甲基丙烯酸丁酯)/聚氧乙烯
[0066]-聚氧化丁烯/聚氧乙烯
[0067]-聚己酸内酯/聚氧乙烯
[0068]-聚乙烯/聚氧乙烯
[0069]-聚氧乙烯/聚氧化丁烯/聚氧乙烯。
[0070] 在本发明中，有必要向胶束组合物中添加：
[0071] -阳离子两亲型嵌段聚合物，所述嵌段中的一种是阳离子的且举例来说可选自： [0072]-聚(聚甲基丙烯酸三甲基乙铵）；
[0073] -季铵化的聚（甲基丙烯酸二甲氨基乙酯）；
[0074] -聚甲基乙烯基咪唑:饑 (polymethyvinylimidazolium);
[0075] -聚（乙烯基苯甲基三甲基氯化铵）（po ly (viny lbenzy 1 tr imethy lammonium chloride))〇
[0076] 非离子两亲型嵌段聚合物与阳离子两亲型嵌段聚合物的缔合为使两者之间的比 率为99/1至1/99;
[0077] 和/或
[0078] -如下面所列的至少一种阳离子表面活性剂。
[0079] 在这种情况下，非离子两亲型嵌段聚合物与阳离子表面活性剂的各自比率将为 50/50至99/1。
[0080] 在本发明中，与阳离子表面活性剂缔合或未缔合的胶束嵌段聚合物的浓度，以其 重量计算相对于组合物的总重量将为0.1-10%，且优选0.2-5 %。
[0081] 在本明的一个变形中，也可能形成由如上所述的阳离子两亲型嵌段聚合物组成的 胶束。
[0082] 脂质体和非离子表面活性剂微囊
[0083]能够形成非离子脂质体的非离子两亲型脂质具体是专利申请EP 0 582 503中描 述的那些。
[0084] 具体地，非离子两亲型脂质可由至少一种多元醇和至少一种脂肪酸的酯混合物组 成，其中所述多元醇选自含有1-60个环氧乙烷单元的聚乙二醇、山梨聚糖、具有2-60个环氧 乙烷单元的山梨聚糖、具有2-30个环氧乙烷单元的甘油、含有2-15个甘油单元的聚甘油、蔗 糖、具有2-30个环氧乙烷单元的葡萄糖，所述脂肪酸含有线性或分支的、饱和或不饱和的 C 5-Cn烷基链，每个多元醇基团的烷基链数目为1 -10。
[0085] 术语"酯混合物"不但包括不同化学族的纯酯的混合物，也包括以各种比例含有相 同族的多元醇的几种化学纯酯的任何产品。具体地，在其亲水部分具有统计学化学式的产 品就是这样，例如化学式C0-(0CH 2-CH0H_CH2)n-OH的聚甘油酯，其中n是统计学值，且其可含 有n=l，11 = 2，11 = 3，11 = 4等的各种比例的酯;在其亲脂部分含有几种烷基链的酯也是这样， 例如椰油酸酯，其含有(：5-& 7烷基链，或异硬脂酸酯，其中C17烷基链是同分异构形式的复杂 混合物；由相同多元醇的单_、二_、三-或聚酯的混合物组成的产品也是这样。需注意的是， 只含有能够形成小泡的单酯和另一种类型杂质的产品不能用于本发明。
[0086] 商品酯可单独地用于本发明，因为它们实际上是酯的混合物，它们为例如下述的：
[0087] - "ICI"公司出售的商品名为"SFAN 20，40，60和80"的山梨聚糖(或山梨糖醇酐)和 脂肪酸的偏酯；
[0088] -"NIKK0"公司出售的商品名为"SI 10 R NIKK0L"的异硬脂酸山梨聚糖酯；
[0089] -"ICI"公司出售的名为"TWEEN 61"的、具有4个环氧乙烷单元的硬脂酸山梨聚糖 酯；
[0090] -"ICI"公司出售的名为"MYR J 45"的、含有8个环氧乙烷单元的硬脂酸聚乙二醇 醋；
[0091] -"NIKK0"公司出售的名为"MYS 4"的化学式为EMI6.1的单硬脂酸聚乙二醇酯，其 中化学式n等于4;
[0092] -"UNICHEMA"公司出售的化学等级或生物技术生产的等级的分子量为400的硬脂 酸聚乙二醇酯；
[0093] - "H0ECHST"公司出售的名为"HOSTACERINE DGS"的、具有4个环氧乙烷单元的硬脂 酸二甘油酯；
[0094] -"NIKK0"公司出售的名为"TETRAGLYN 1S"的硬脂酸四甘油酯；
[0095] -"S0LVAY"公司出售的异硬脂酸二甘油酯；
[0096] -"NIHON"公司出售的名为"EMALEX DSG 2"的二硬脂酸二甘油酯；
[0097] -"CR0DA"公司出售的名为卞50小70^110和？1600?00￡51六"的单-、二-和三硬脂酸 棕榈酸蔗糖酯；
[0098] -"GRILL0"公司出售的名为"GRILLOTEN PSE 141G"的单硬脂酸棕榈酸蔗糖酯和二 硬脂酸棕榈酸蔗糖酯的混合物；
[0099] -"ICI"公司出售的名为"ARLAT0NE 2121"的硬脂酸蔗糖酯和椰油酸蔗糖酯的混合 物；
[0100] -"AMERCH0L"公司出售的名为"GLUCAM E 20DISTEARATE"的、具有20个环氧乙烷单 元的二硬脂酸甲基葡萄糖酯。
[0101] 当然，可以使用以上已经是混合物的产品相互之间的混合物，或者这些产品与纯 的广品的混合物。
[0102] 阳离子表面活性剂选自下文所列的，且从而它们赋予分散体的pH为5-8;在脂质相 中，非尚子两未型脂质的量与阳尚子表面活性剂的量的重量比为50/1到50/25，且分散体的 脂质相与水相的重量比为1/1000到300/1000。
[0103] 油质体
[0104]本发明涉及的油质体在专利申请EP 0 705 593中有描述。它们包括一种水包油类 型的乳剂，其由带有层状液晶包被的油质小球构成，分散在水相中，其特征是每个油质小球 作为一个单位，包被着单层的或多层的层(经冷冻断裂(cryofracture)后利用透射电子显 微镜术可以观测到1-10个薄片），所述层由至少一种亲脂表面活性剂、至少一种亲水的表面 活性剂以及至少一种阳离子表面活性剂得到，赋予乳剂的pH为5-8,所述被包被的油质小球 的平均直径小于500纳米。
[0105]亲脂表面活性剂和亲水表面活性剂各含有至少一种具有超过约12个碳原子的饱 和脂肪链。更为优选的是，该脂肪链含有16至22个碳原子。
[0106] 根据本发明的另一个优选的实施方案，亲脂表面活性剂的HLB为约2至约5。为大家 所熟知的是，术语HLB(亲水-亲脂平衡)用于指表面活性剂的亲水基团的大小和强度与亲脂 基团的大小和强度之间的平衡。
[0107] 这样的亲脂表面活性剂的例子是二硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸 四甘油酯、十硬脂酸十甘油酯、单硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸六甘油酯、五硬脂酸十甘油酯、 单硬脂酸山梨聚糖酯、三硬脂酸山梨聚糖酯、单硬脂酸二甘醇酯、棕榈酸和硬脂酸的甘油 酯、聚氧乙烯化的单硬脂酸酯20E(包含2个氧乙烯单元）、单山嵛酸甘油酯和二山嵛酸甘油 酯以及四硬脂酸季戊四醇酯。
[0108] 亲水表面活性剂优选具有约8至约12的HLB。
[0109] 作为这样的亲水表面活性剂例子，可提及下列化合物:聚氧乙烯化的山梨糖醇酐 单硬脂酸酯40E、聚氧乙烯化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯200E、聚氧乙烯化的单硬脂酸酯80E、 单硬脂酸六甘油酯、聚氧乙烯化的单硬脂酸酯100E、聚氧乙烯化的二硬脂酸酯120E以及聚 氧乙烯化的二硬脂酸甲基葡萄糖酯200E。
[0110] 阳离子表面活性剂可选自下文中描述的化合物。
[0111] 毫微乳剂
[0112] 阳离子型颗粒还可以选自水包油的毫微乳剂，其包含在水相中分散的油相，其油 质小球的数均大小小于l〇〇nm，特征是它们包含至少一种两亲型脂质，所述两亲型脂质含有 至少一种非离子两亲型脂质和一种阳离子两亲型脂质，油相和两亲型脂质存在的含量使得 油相/两亲型脂质的重量比为3到10。
[0113] 毫微乳剂一般具有透明至浅蓝色的外观。所述毫微乳剂的透明度通过在600nm下 处于10-90%的透射系数，或者通过浊度进行测量。本发明的组合物的浊度是60到400NTU， 且优选70到300NTU，所述浊度是利用型号为2100P的HACH便携式浊度仪在约25°C下测量的。
[0114] 本发明的毫微乳剂的油质小球的数均大小小于100nm，且优选20-80nm，且更优选 40-60nm。小球大小的降低使得可能促进活性剂穿透进入皮肤表面层(载体效应）。
[0115] 根据本发明的毫微乳剂优选在4-45°C的温度制备，且因此与热敏活性剂相容。
[0116] 这些分散体在下列申请中有具体的描述:EP 0728 460、EP 0 879 589、EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1 018 363、EP 1 025 898以及EP 1 120 102。在所有这些申请中都指明，为了提高颗粒的稳定性，可向非离子表 面活性剂(或混合物）中加入离子表面活性剂。
[0117] 在本发明的情况中，一种或多种阳离子表面活性剂将专门用作离子表面活性剂。
[0118] 上述参考文献中指出的比例予以保留，且以阳离子表面活性剂为例，选择列表中 对所有颗粒通用的。
[0119] 非离子表面活性剂，优选水溶性的或在水分散性的，含有至少一种疏水的嵌段和 至少一种亲水的嵌段。
[0120] 本发明的非离子两亲型脂质优选选自：
[0121] 1/硅氧烷表面活性剂，
[0122] 2/在温度低于或等于45°C时为液体的两亲型脂质，其选自至少一个多元醇或至少 一个脂肪酸的酯，其中脂肪酸含有至少一个线性或分支的、饱和或不饱和的，且具体是不饱 和的或分支的、C 8_C22烷基链，所述多元醇选自含有1至60个环氧乙烷单元的聚乙二醇、山梨 聚糖、含有2-30个环氧乙烷单元的甘油和含有2-15个甘油单元的聚甘油，
[0123] 3/脂肪酸和糖的酯以及脂肪醇和糖的醚，
[0124] 4/在温度等于45°C时为固体的表面活性剂，其选自脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨聚 糖酯以及氧乙烯化的脂肪酸山梨聚糖酯、乙氧基化的脂肪醚以及乙氧基化的脂肪酸酯，
[0125] 5/环氧乙烷(A)和环氧丙烷(B)的嵌段共聚物，以及这些表面活性剂的混合物。
[0126] 1/可根据本发明使用的硅氧烷表面活性剂是含有至少一个氧乙烯化的链-OCH2CH 2-和/或氧丙烯化的链-〇CH2CH2CH2-的硅氧烷化合物；可提及文献US-A-5，364，633和 US-A-5,411，744中描述的那些。
[0127] 优选地，根据本发明使用的硅氧烷表面表面活性剂是式(II)的化合物：
[0129] 其中：
[0130] {^、心和心彼此独立地代表^-以烷基自由基或者-"出^-⑶⑶:^出）^ (OCH 2CH2CH2)Z-0R4自由基，至少一个自由基Ri、R 2或R3不是烷基自由基;R4是氢、烷基自由基 或者酰基自由基；
[0131] A是0至200的整数；
[0132] B是0至50的整数;限定条件是A和B不同时等于零；
[0133] x是1至6的整数；
[0134] y是1至30的整数；
[0135] z是0至5的整数。
[0136] 根据本发明一个优选的实施方案，在式(X)的化合物中，烷基自由基是甲基自由 基，x是2-6的整数，且y是4-30的整数。
[0137] 作为式(II)的硅氧烷表面活性剂的例子，可以提及式(III)的化合物：
[0139] 其中A是20至105的整数，B是2至10的整数，并且y是10至20的整数。
[0140] 作为式(II)的硅氧烷表面活性剂的例子，还可以提及式(IV)的化合物：
[0141] H- ( OCH2CH2 ) y- ( CH2 ) 3- [ ( CH3 ) 2 S i 0 ] A- (cH2) 3- (OCH2CH2) y-OH (IV)
[0142] 其中A'和y是10至20的整数。
[0143] 作为硅氧烷表面活性剂，可具体使用由Dow Corning公司出售的名为DC 5329、DC 7439-146、DC 2-5695和Q4-3667的产品。化合物DC 5329、DC 7439-146和DC 2-5695是式 (XI)的化合物，其中分别地，A是22，B是2并且y是12 4是103,8是10并且7是12 4是27,8是3 并且y是12。
[0144] 化合物Q4-3667是式（IV)的化合物，其中A是15并且y是13。
[0145] 2/在温度低于或等于45°C时为液体的两亲型脂质具体地可选自：
[0146] -UNICHEMA公司出售的名为Prisorine 3644的、分子量为400的异硬脂酸聚乙二醇 酯（CTFA名：PEG_8Isostearate);
[0147] -S0LVAY公司出售的异硬脂酸二甘油酯；
[0148] -S0LVAY公司出售的名为单月桂酸二甘油酯(Diglycerin-mono laurate)的、含有 两个甘油单元的月桂酸聚甘油酯（月桂酸聚甘油-2酯）；
[0149] -ICI公司出售的名为SPAN 80的油酸山梨聚糖酯；
[0150] -NIKK0公司出售的名为NIKK0L SI 10R的异硬脂酸山梨聚糖酯；
[0151] -ULICE公司出售的a-丁基葡糖苷椰油酸酯或者a-丁基葡糖苷癸酸酯。
[0152] 3/根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的脂肪酸和糖的酯，优选 在温度低于或等于45°C时为固体，并且具体地选自C 8_C22脂肪酸与蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或 者果糖形成的酯或酯的混合物，以及C14-C22脂肪酸与甲基葡萄糖形成的酯或酯的混合物。
[0153] 形成用于本发明的毫微乳剂的酯的脂肪单元的C8-C22SC14_C 22脂肪酸含有饱和或 不饱和的线性烷基链，其分别具有8-22或14-22个碳原子。酯的脂肪单元具体地可选自硬脂 酸、山嵛酸、花生四烯酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸及其混合物。优选使用硬脂酸。
[0154] 作为脂肪酸与蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或者果糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及 单硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物，例如Croda公司出售的名 为Crodesta ?50^70^110和？160的产品，其111^(亲水-亲脂平衡)分别是5、7、11和16;且作 为脂肪酸和甲基葡萄糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及Goldschmidt公司出售的名为 Tego-care 450的二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯。还可以提及葡萄糖或麦芽糖的单酯，例 如〇-十六烷酰-6-D-葡糖苷甲酯和〇-十六烷酰-6-D-麦芽糖苷甲酯。
[0155] 根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的脂肪醇和糖的醚，在温度 低于或等于45°C时为固体，且具体地选自C8_C 22脂肪酸与蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或者果糖形 成的醚或醚的混合物，以及〇14_(：22脂肪酸与甲基葡萄糖形成的醚或醚的混合物。具体地是 烷基聚葡糖苷。
[0156] 形成用于本发明的毫微乳剂的醚的脂肪单元的C8_C22或者014_(： 22脂肪醇含有饱和 或不饱和的线性烷基链，其分别具有8-22或14-22个碳原子。醚的脂肪单元具体地可选自癸 基、鲸蜡基、二十二烷基、二十烷基、硬脂基、棕榈基、肉豆蔻基、月桂基、辛基和十六烷酰单 元，以及它们的混合物，例如鲸錯硬脂基(cetearyl)。
[0157] 作为脂肪醇和糖形成的醚的例子，可以提及如癸基葡糖苷和月桂基葡糖苷的烷基 聚葡糖苷，其例如由Henkel公司分别以商品名Plantaren 2000和Plantaren 1200出售的产 品，任选作为与十六醇十八醇混合物的混合物的鲸錯硬脂基葡糖苷，其例如由Seppic公司 出售的Montanov 68、Goldschmidt公司出售的Tego-care CG90以及Henkel公司出售的 Emulgade KE3302,以及二十烷基葡糖苷，例如Seppic公司出售的名为Montanov 202的花生 醇和山嵛醇与二十烷基葡糖苷的混合物的形式。
[0158] 作为这种类型的非离子两亲型脂质，更具体地使用单硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗 糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物、二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯和烷基聚葡糖苷。
[0159] 4/根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的甘油脂肪酸酯，在温度 低于或等于45°C时为固体，具体地可选自由至少一种含有16-22个碳原子的饱和线性烷基 链的酸和1-10个甘油单元形成的酯。一种或多种这样的甘油脂肪酸酯可用于本发明的毫微 乳剂。
[0160] 这些酯具体地选自硬脂酸酯、山嵛酸酯、花生酸酯、棕榈酸酯及其混合物。优选使 用硬脂酸酯和棕榈酸酯。
[0161] 作为可用于本发明的毫微乳剂的表面活性剂的例子，可以提及单硬脂酸十甘油 (10个甘油单元)酯、二硬脂酸十甘油（10个甘油单元)酯、三硬脂酸十甘油（10个甘油单元） 酯和五硬脂酸十甘油（10个甘油单元）酯（CTFA名：Polyglyceryl-lOstearate、 Polyglyceryl-10distearate、Polyglyceryl_10tristearate、Polyglyceryl-lOpentastearate)，例如Nikko公司分别以名称Nikkol Decaglyn 1-S、2_S、3_S和5-S出售 的产品，以及单硬脂酸二甘油酯(CTFA名：Polyglyceryl_2stearate)，例如Nikkol公司以名 Nikkol DGMS出售的产品。
[0162] 根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的山梨聚糖脂肪酸酯，在温 度低于或等于45°C时为固体，具体地可选自由C 16_C22脂肪酸和山梨聚糖形成的酯以及由 C16_C22脂肪酸和山梨聚糖形成的氧乙烯化的酯。它们是由至少一种含有至少一条分别具有 16-22个碳原子的饱和线性烷基链的脂肪酸和山梨糖醇或乙氧基化的山梨糖醇形成的。氧 乙烯化的酯一般含有1-100个环氧乙烷单元，且优选2-40个环氧乙烷(E0)单元。
[0163] 这些酯可具体地选自硬脂酸酯、山嵛酸酯、花生酸酯、棕榈酸酯及其混合物。优选 使用硬脂酸酯和棕榈酸酯。
[0164] 作为可用于本发明的毫微乳剂的山梨聚糖脂肪酸酯以及氧乙烯化的山梨聚糖脂 肪酸酯的例子，可以提及ICI公司以名Span 60出售的单硬脂酸山梨聚糖酯（CTFA名： Sorbitan stearate)，ICI公司以名Span 40出售的单棕榈酸山梨聚糖酯（CTFA名：Sorbitan palmitate)，以及ICI公司以名Tween 65出售的三硬脂酸山梨聚糖酯20E0(CTFA名： Polysorbate 65)。
[0165] 根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的乙氧基化的脂肪族醚，在 温度低于或等于45°C时为固体，优选为由1-100个环氧乙烷单元和至少一个具有16-22个碳 原子的脂肪醇链形成的醚。醚的脂肪族链具体选自二十二烷基、二十烷基、硬脂基和鲸蜡基 单元及其混合物，如鲸蜡硬脂基。作为乙氧基化的脂肪族醚的例子，可以提及含有5、10、20 和30个环氧乙烧单元的山箭醇酿（CTFA名：Beheneth-5、Beheneth-10、Beheneth_20、 Beheneth-30)，例如Nikko公司以名Nikkol BB5、BB10、BB20和BB30出售的产品，以及含有两 个环氧乙烷单元的硬脂醇醚(CTFA名：Steareth-2)，例如ICI公司以名Brij 72出售的产品。
[0166] 根据本发明，可用作毫微乳剂中的非离子两亲型脂质的乙氧基化的脂肪酸酯，在 温度低于或等于45°C时为固体，是由1-100个环氧乙烷单元和至少一个具有16-22个碳原子 的脂肪酸链形成的酯。酯的脂肪族链具体选自硬脂基、二十二烷基、二十烷基和棕榈基单元 及其混合物。作为乙氧基化的脂肪酸酯的例子，可以提及含有40个环氧乙烷单元的硬脂酸 酯，例如ICI公司以名Myrj 52(CTFA名:PEG-40stearate)出售的产品以及含有8个环氧乙烷 单元的山箭酸酯（CTFA名：PEG_8behenate)，例如Gattefosse公司以名Compritol HD5AT0出 售的产品。
[0167] 5/根据本发明，可用作毫微乳剂的非离子两亲型脂质的环氧乙烷和环氧丙烷的嵌 段共聚物，具体地可选自式(V)的嵌段共聚物：
[0168] M0 (C2H4O) x (C3H60) y (C2H4O) zH (V)
[0169] 其中x、y和z是整数，从而x+z的范围为2-100，y的范围为14-60,以及它们的混合 物，且更具体选自HLB为2-16的式(V)的嵌段共聚物。
[0170] 这些嵌段共聚物可具体选自泊洛沙姆，且具体选自泊洛沙姆231，如ICI公司以名 Pluronic L81出售的式(V)(其中x = z = 6，y = 39)(HLB 2)的产品；泊洛沙姆282,如ICI公司 以名Pluronic L92出售的式(V)(其中x = z = 10，y = 47)(HLB 6)的产品；以及泊洛沙姆124， 如ICI公司以名Pluronic L44出售的式(V)(其中x = z = ll，y = 21)(HLB 16)的产品。
[0171] 作为非离子两亲型脂质，还可提及文献EP-A-705593中所述的非离子表面活性剂 的混合物，此处将所述文献引入作为参考。
[0172] 在非离子两亲型脂质中，可具体使用：
[0173] -PEG 400异硬脂酸酯或PEG-8异硬脂酸酯(含8mol环氧乙烷），
[0174] -异硬脂酸二甘油酯，
[0175] -含有2单元甘油的单月桂酸聚甘油酯和含10单元甘油的硬脂酸聚甘油酯，
[0176] -油酸山梨聚糖酯，
[0177] -异硬脂酸山梨聚糖酯及其混合物。
[0178] 根据本发明，非离子两亲型脂质在毫微乳剂中的含量相对于组合物的总重量为 0.2重量％至12重量％，且优选为0.2重量％至8重量％，且更优选为0.2重量％至6重量％。
[0179] 阳离子两亲型脂质选自下文所列的那些。
[0180] 它们在本发明的毫微乳剂中存在的浓度，优选为相对于毫微乳剂的总重量的0.01 至6重量％，且更优选为0.2至4重量％。
[0181] 油：
[0182] 根据本发明的毫微乳剂的油相中含有至少一种油。可用于本发明的毫微乳剂中的 油优选自：
[0183] -动物或植物来源的油，其由脂肪酸和多元醇的酯构成，具体是液态的甘油三酯， 例如葵花油、玉米油、大豆油、鳄梨油、霍霍巴油、骨髓油、葡萄子油、芝麻油、榛子油、鱼油和 glyceryl tricaprocaprylate，或式为Rg⑶ORio的植物或动物油，其中R9代表含有7至29个 碳原子的高级脂肪酸残基，并且R 1Q代表含有3至30个碳原子的线性的或分支的基于烃的链， 具体是烷基或链烯基，例如puree 11 in油或液体霍霍巴木蜡；
[0184] -天然的或合成的精油，例如桉叶油、杂熏衣草油、熏衣草油、韦惕蔚油、山苍子油、 柠檬油、檀香油(sandlewood oil)、迷迭香油、春黄菊油、香薄荷油、肉豆蔻油、肉桂油、海索 草油(hyssop oil)、f蒿子油、橙油、香叶醇油、杜松油和香柠檬油；
[0185] -合成油，例如parleam油、聚稀经和液体羧酸酯；
[0186] -矿物油，例如十六烷、异十六烷和石蜡油；
[0187] -卤代油，具体是碳氟化合物，例如氟代胺(f luoroamine)，如全氟三丁胺，氟代烃， 例如全氟代十氢化萘(perfluorodecahydro-naphthalene)、氟代酯和氟代醚；
[0188] _挥发性或非挥发性的硅油。
[0189] 可用作合成油的聚烯烃具体是聚a-烯烃，且更具体是那些氢化的或未氢化的聚丁 烯类型，且优选氢化的或未氢化的聚异丁烯类型。
[0190] 可用作合成油的液体羧酸酯可以是单羧酸酯、二羧酸酯、三羧酸酯或四羧酸酯。酯 的总碳数目一般大于或等于10,且优选小于100,且更优选小于80。它们具体是饱和或不饱 和的、线性的或分支的Q-C26脂族酸与饱和或不饱和的、线性的或分支的&-C26脂族醇形成 的单酯，酯的总碳数目一般大于或等于10。也可以使用C 4-C22二羧酸或三羧酸与Q-C22醇形 成的酯，以及一羧酸、二羧酸或三羧酸与C2-C 26二羟基、三羟基、四羟基或五羟基醇形成的 酯。
[0191] 在上面所述的酯中，优选使用棕榈酸烷基酯，例如棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯、棕 榈酸2-乙基己酯、棕榈酸2-辛基癸酯；肉豆蔻酸烷基酯，例如肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸丁 酯、肉豆蔻酸鲸蜡酯、肉豆蔻酸2-辛基十二醇酯;硬脂酸烷基酯，例如硬脂酸己酯、硬脂酸丁 酯、硬脂酸异丁酯;苹果酸烷基酯，例如苹果酸二辛酯；月桂酸烷基酯，例如月桂酸己酯和月 桂酸2-己基癸酯;异壬酸异壬酯；辛酸鲸蜡酯。
[0192] 有利地，根据本发明的毫微乳剂含有至少一种分子量大于或等于400的油，具体是 400至10 000，更好地是400至5000，或甚至为400至2500。分子量大于或等于400的油可选自 动物或植物来源的油、矿物油、合成油和硅油，以及它们的混合物。作为这种类型的油，举例 来说，可以提及棕榈酸异鲸蜡酯、硬脂酸异鲸蜡酯、鳄梨油和霍霍巴油。
[0193] 根据本发明的毫微乳剂包含一定量的油相(除两亲型脂质之外的油和其它脂肪物 质），所述量优选相对于毫微乳剂的总重量为2-40重量％，且更具体是4-30重量％，且更优 选是4-20重量％。
[0194] 油相和两亲型脂质（非离子和离子的两亲型脂质）优选在根据本发明的毫微乳剂 中按照油相的量和两亲型脂质的量的重量比为3至10存在，且更为优选的范围是3至6。术语 "油相的量"在本文中指的是这种油相的成分的总量，不包括两亲型脂质的量。根据本发明 的毫微乳剂除了上述式（I)的尿素衍生物之外，如果必要的话，还可含有溶剂，具体用于提 高组合物的透明度。
[0195] 这些溶剂优先选自：
[0196] -CrCs低级醇，例如乙醇；
[0197] -二元醇，例如甘油、丙二醇、1，3-丁二醇、一缩二丙二醇或者含有4至16个，且优选 8至12个环氧乙烷单元的聚乙二醇；
[0198] -糖类，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖或者蔗糖。
[0199] 这些溶剂可作为混合物使用。当它们存在于本发明的毫微乳剂中时，可使用的浓 度优选相对于毫微乳剂的总重量为0.01-30重量％，且更好地为相对于毫微乳剂的总重量 的5-20重量％。醇和/或糖的量相对于毫微乳剂的总重量优选为5-20重量％，并且二元醇的 量相对于晕微乳剂的总重量优选为5_15重量％。
[0200] 制备方法：
[0201] 制备上面所限定的毫微乳剂的方法是，将含有尿素衍生物的水相和油相在温度范 围10°C-8(TC下通过强烈搅拌进行混合，在大于5X10 7Pa的压力下进行高压匀浆步骤，且任 选地加入所用的聚合物。根据本发明优选的实施方案，随后在大于5X10 7Pa的压力下再进 行另外一个高压匀浆步骤。高压匀浆优选在压力为6X107Pa至18X10 7Pa下进行。剪切优选 为2 X 106s-1至5 X 108s-1，且更好地是1 X 108s-1至3 X 108s-Hs-1表示秒-4。该方法使得可能 生产出与热敏的活性化合物相容的毫微乳剂，它可以含有油和具体的香料，其中含有脂肪 物质，而不会使其变性。
[0202] 毫微胶囊
[0203] 本发明的毫微胶囊是专利申请EP 0 447 318、EP 0 557 489、EP 0 780 115、EP 1 025 901、EP 1 029 587、EP 1 034 839、EP 1 414 390、FR2 830 776、EP 1 342 471、FR 2 848 879和FR 04/50057所描述的那些。
[0204] 毫微胶囊是具有油质芯和聚合物壳的芯-壳颗粒。上述的各个申请涉及各族聚合 物以及各种获得它们的方法。胶囊的大小总是小于lMi，且其可能具有小于80nm的大小。这 些颗粒可用层状液晶相包被，所述液晶相最常见由卵磷脂或聚二甲基硅氧烷共聚醇组成。 包被必须由在与水接触时能够自发形成层状液晶相的两亲型脂质组成。向这种能够形成层 状相的两亲型脂质加入能够赋予颗粒(毫微胶囊)正G电势的阳离子表面活性剂。形成层状 相的两亲型脂质与阳离子表面活性剂的重量比为99/1-75/25。
[0205]可用的阳离子表面活性剂如下文中所列。
[0206] 有机颗粒
[0207] 本发明的有机颗粒是固体毫微球体(nanosphere)，其不具有内腔，可通过各种方 法形成(在水中分散、毫微沉淀(仙11(^^(^口；^31：；[011)、微乳剂等），并且由至少一种聚合物 或者至少一种共聚物，或者它们的混合物组成。由于聚合物或共聚物是阳离子的，或者由于 它(们)是非离子的且使用了如下文所述的阳离子表面活性剂，所以颗粒是阳离子的，具有 上文限定的G电势。阳离子表面活性剂的量相对于聚合物为0-25%。
[0208] 无机颗粒
[0209 ]本发明的阳离子无机颗粒举例来说，可以基于硅石、T i02、ZnO、氧化铝等。例如，可 以提及如Nalco公司的Nanomer 2颗粒的水中胶体分散体中的氧化错颗粒。Clariant和 Grace也提供这种类型的颗粒。
[0210] 可用于制备本发明的阳离子型颗粒的阳离子表面活性剂
[0211] 可根据本发明使用的阳离子表面活性剂在下文列举，该列举是非限制性的。
[0212] 阳离子两亲型脂质优选选自季铵盐和脂肪族胺及其盐。
[0213]季铵盐举例来说为：
[0214]-具有如下式（IV)的那些：
[0216]其中自由基RlSR4,可以是相同的或不同的，代表线性的或分支的含有1至30个碳 原子的脂族自由基，或者芳族自由基，例如芳基或烷基芳基。脂族自由基可以含有杂原子， 例如具体是氧、氮、硫或卤素。例如，脂族自由基选自下列自由基:烷基、烷氧基、聚氧化(C2-C 6)烯、烷基酰胺、（C12-C22)烷基酰胺_(C2_C 6)烷基、乙酸(C12-C22)烷基酯、羟烷基，其含有约1 至30个碳原子;X是选自卤化物、磷酸根、乙酸根、乳酸根、（C 2-C6)烷基硫酸根以及烷基-或烷 基芳基磺酸根的阴离子，
[0217]-咪唑啉懲盐的季铵盐，例如，具有如下式(V)的那些：
[0219] 其中他代表含有8至30个碳原子的链烯基或烷基自由基，例如衍生自动物脂肪酸 的自由基，R6代表氢原子、Q-C4烷基自由基或者含有8至30个碳原子的链烯基或烷基自由 基，R7代表Q-C4烷基自由基，Rs代表氢原子或者(^-〇4烷基自由基，且X是选自卤化物、磷酸 根、乙酸根、乳酸根、烷基硫酸根以及烷基-或烷基芳基磺酸根的阴离子。优选地，R#PR 6代表 含有12至21个碳原子的链烯基或烷基自由基的混合物，例如由动物脂肪酸衍生而来的那 些，R7表示甲基，且Rs表示氢原子。举个例子来说，所述产品是由REW0公司以名"REWOQUAT W 75"出售的产品。
[0220] -具有式(VI)的季二铵盐（quaternary diammonium):
[0222] 其中R9代表含有约16到30个碳原子的脂族自由基，-、如几^如和心^可以相同 或不同，选自氢或含有1至4个碳原子的烷基自由基，且X是阴离子，其选自卤化物、乙酸根、 磷酸根、硝酸根以及甲基磺酸根。这样的季二铵盐具体包括丙烷动物脂联铵二氯化物 (propanetallowdiammonium dichloride)；
[0223]-包含至少一种酯功能的季铵盐
[0224]可根据本发明使用的包含至少一种酯功能的季铵盐是，例如，具有下式(VII)的那 些：
[0226] 其中：
[0227] -R15选自&-C6烷基自由基和&-C6轻烷基或二羟烷基自由基；
[0228] -R16选自：
[0229] -自由基
[0231 ]-基于线性或分支的、饱和或不饱和的C1-C22经的自由基R20，
[0232] -氢原子，
[0233] -R18选自：
[0234] -自由基
[0236] -基于线性或分支的、饱和或不饱和的Ci_C6烃的基团R22，
[0237] -氢原子，
[0238] _Rl7、Rl9和R21，可以相同或不同，选自基于线性或分支的、饱和或不饱和的C7-C21烃 的自由基；
[0239] -n、p和r，可以相同或不同，是2至6的整数；
[0240] -y是1至10的整数；
[0241] -x和z，可以相同或不同，是0至10的整数；
[0242] -X-是简单或复杂的有机或无机阴离子；限制条件是x+y+z的和是1至15,当x是0 时，Rl6代表R2Q，且当Z是0时，R18代表R22。
[0243] 烷基自由基R15可以是线性或分支的，且更具体是线性的。
[0244] 优选地，R15代表甲基、乙基、羟乙基或二羟丙基自由基，且更具体是甲基或乙基自 由基。有利地，x+y+z的和是1至10。
[0245] 当R16是基于烃的自由基R2Q时，它可以是长的且含有12至22个碳原子，或者是短的 且含有1至3个碳原子。
[0246] 当R18是基于烃的基团R22时，它优选含有1至3个碳原子。
[0247] 有利的是，R17、R19和R21，可以相同或不同地，选自基于线性或分支的、饱和或不饱 和的Cn_C21经类的自由基，且更具体是选自线性或分支的、饱和或不饱和的Cn_C2^基或链 烯基自由基。
[0248] 优选地，x和z，可以相同或不同地，是0或1。
[0249] 有利地，y等于1。
[0250] 优选地，n、p和r，可以相同或不同地，是2或3,且更具体等于2。
[0251 ]阴离子优选地是卤化物(氯化物、溴化物或碘化物)或者烷基硫酸根，更具体是甲 基硫酸根。然而，可以使用甲磺酸根、磷酸根、硝酸根、甲苯磺酸根、衍生自如乙酸根或乳酸 根的有机酸的阴离子，或者任何其它与包含酯功能的铵相容的阴离子。
[0252 ]阴离子)T更具体地是氯化物或甲基硫酸根。
[0253]更具体地使用具有式(VII)的铵盐，其中：
[0254] -R15代表甲基或乙基自由基，
[0255] -x 和 y 等于 1;
[0256] -z 等于〇或 1;
[0257] n、p和r 等于2;
[0258] -R16选自：
[0259] -自由基
[0261] -甲基、乙基或基于&4-C22经的自由基；
[0262] -氢原子；
[0263] -R18选自：
[0264] -自由基
[0266] -氢原子：
[0267] Rl7、Rl9和R21，可以相同或不同，选自基于线性或分支的、饱和或不饱和的C13-C17烃 的自由基，且更具体选自线性或分支的、饱和或不饱和&3-&7烷基或链烯基自由基。
[0268] 有利地，基于烃的自由基是线性的。
[0269] 例如，可以提及具有式(VII)的化合物，如二酰基乙氧基二甲铵、二酰基乙氧基羟 基乙基甲基胺、单酰基乙氧基二羟乙基甲基胺、三酰基乙氧基甲铵和单酰基乙氧基羟基乙 基二甲胺盐(具体是氯化物或甲基硫酸盐)及其混合物。酰基自由基优选含有14至18个碳原 子，且更优选衍生自如棕榈油或葵花油的植物油。
[0270] 当化合物中含有几个酰基自由基时，后者可以是相同或不同的。
[0271] 这些产品可通过以下方式获得，例如，通过三乙醇胺、三异丙醇胺、烷基二乙醇胺 或烷基异丙醇胺在动物或植物来源的脂肪酸或脂肪酸的混合物中进行的直接酯化，任选地 进行烷氧基化，或通过对它们的甲酯进行酯交换作用。酯化后使用烷化剂，例如卤代烷(优 选甲基或乙基卤）、硫酸二烷基酯（优选硫酸甲酯或硫酸乙酯）、甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲 酯、氯乙二醇(glycol chlorohydrin)或氯甘油(glycerol chlorohydrin)进行的季铵化作 用。
[0272] 这些化合物举例来说，为HENKEL公司出售的DEHYQUART、STEPAN公司出售的 STEPANQUAT、CECA公司出售的N0XAMIUM以及REW0WITC0公司出售的REWOQUAT WE 18。
[0273] 根据本发明的组合物优选含有季铵单酯、二酯和三酯盐的混合物，其中按重量计 大部分是二酯盐。
[0274] 作为铵盐的混合物，例如，可以使用含有按重量计15-30 %的酰基乙氧基乙基二羟 基乙基甲基铵硫酸甲酯，45-60 %的二酰基乙氧基羟基乙基甲基铵硫酸甲酯和15-30 %的三 酰基乙氧基甲基铵硫酸甲酯的混合物，其中酰基自由基含有14至18个碳原子并且衍生自任 选部分氢化的棕榈油。也可使用专利US-A-4 874 554和US-A-4 137 180中所述的包含至少 一种酯功能的铵盐。
[0275] 在具有式（IV)的季铵盐中，优选的是，首先，四烷基氯化铵，例如，二烷基二甲基氯 化铵或烷基三甲基氯化铵，其中烷基自由基含有约12至22个碳原子，具体是二十二烷基三 甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、鲸蜡基三甲基氯化铵或者苄基二甲基硬脂基氯化铵， 或者其次，VAN DYK公司以名"CERAPHYL 70"出售的硬脂酰胺丙基二甲基（乙酸肉豆蔻酯)氯 化铵。
[0276] 根据本发明，二十二烷基三甲基氯化铵或者二十二烷基三甲基溴化铵以及CTAB (鲸蜡基三甲基溴化铵)是最优选的季铵盐。
[0277] 本发明的脂肪族胺符合式：
[0279] -心是基于分支或不分支的、饱和或不饱和的烃的链，含有8至30个碳原子，且优选 10至24个碳原子。
[0280] -办和办独立地选自分支或不分支的、饱和或不饱和的烃，含有1至10个碳原子，且 优选1至4个碳原子。
[0281] -R#PR3还可以相互独立地对应于氢原子H。
[0282] -M为1至10,并且优选为1至5。
[0283]作为非限制性的例子，可提及:硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇酰胺、硬脂基二乙醇酰 胺、硬脂二亚乙基三胺、硬脂酰胺丙基二甲胺、硬脂酰胺丙基二乙胺、硬脂酰胺乙基二乙胺、 硬脂酰胺乙基二甲胺、棕榈酰胺丙基二甲胺、棕榈酰胺丙基二乙胺、棕榈酰胺乙基二乙胺、 棕榈酰胺乙基二甲胺、山嵛酸酰胺丙基二甲胺、山嵛酸酰胺丙基二乙胺、山嵛酸酰胺乙基二 乙胺、山嵛酸酰胺乙基二甲胺、花生酸酰胺丙基二甲胺、花生酸酰胺丙基二乙胺、花生酸酰 胺乙基二乙胺和花生酸酰胺乙基二甲胺。
[0284] 作为商购可得的脂肪族胺，可提及Croda所售的Incromine BB、Nikkol所售的 Amidoamine MSP以及Inolex所售的Lexamine。
[0285] 至于其它的脂肪族胺，可提及例如硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇酰胺、硬脂基二乙醇 酰胺以及硬脂二亚乙基三胺，其中尤其是Sabo公司销售的Sabomina系列。
[0286] 还可以提及如Kao Corp.的Acetamine系列的脂肪族胺乙酸盐。
[0287] 这些脂肪族胺也可以被乙氧基化，如Berol 380、390、453和455，Akzo Nobel的 Ethomeens或者Condea Chemie的Marlazin L10、0L2、0L20、T15/2、T50〇
[0288] 本发明的颗粒还可以为了化妆、皮肤病学或眼的目的而引入到任何药学载体中。 可提及例如洗剂、血清、凝胶和所有类型的乳剂。
[0289] 根据本发明的组合物可以是通常用于局部施用的任何药学形式，例如溶液，凝胶， 洗剂或血清类型的分散体，具有液体或半液体乳型稠度的乳剂，其由脂相分散于水相中（0/ W)或反过来(W/0)而得到，或者具有软的半固体的或固体的乳膏或凝胶类型稠度的悬浮液 或乳剂，或者微乳剂，微胶囊，微粒或者离子和/或非离子类型的泡状分散体。这些组合物通 过常规的方法制备。
[0290] 根据本发明的组合物也可以包含任何正常用于化妆或药学领域的添加剂。
[0291] 当然，本领域技术人员会注意这样选择这种或这些任选的额外的化合物，和/或其 量，从而使根据本发明的组合物的有利的特性不会或基本上不会被削弱。
[0292] 具体地，人们会注意保证这种引入不会损害与siRNA缔合的阳离子型颗粒的稳定 性。
[0293] 根据本发明的组合物具体地可以包含化妆的或药学活性的试剂。优选包括脱色 剂、防晒剂。
[0294] 可掺入该组合物的脱色剂包括，例如下列化合物：曲酸;鞣花酸；熊果苷及其衍生 物，如申请EP-895 779和EP-524 109中所描述的那些;氢醌;氨基苯酚衍生物，例如申请TO 99/10318和W0 99/32077所描述的那些，且具体是N-胆留醇基氧羰基-对-氨基苯酚和N-乙 基氧羰基-对-氨基苯酚;亚氨基苯酚衍生物，具体是在申请W0 99/22707中所描述的那些； L-2-氧代四氢噻唑-4-羧酸或前半胱氨酸，及其盐或酯;抗坏血酸及其衍生物，具体是抗坏 血酸葡糖苷；以及植物提取物，具体是甘草、桑树和黄芩的提取物，该列举不具有限制性。
[0295] 防紫外线辐射剂可选自有机的防UV剂或无机的防UV辐射剂。
[0296] 根据本发明的有机的防UV剂可以是水溶性的、脂溶性的或者在平常的化妆溶剂中 不溶的。它们可具体选自邻氨基苯甲酸盐；肉桂衍生物;二苯甲酰甲烷衍生物;水杨酸衍生 物，樟脑衍生物；如在专利申请US 4,367,390、EP 863 145、EP 517 104、EP 570 838、EP 796 851、EP 775 698、EP 878 469和EP 933 376中所描述的三嗪衍生物；二苯甲酮衍生物， 具体是在申请EP 1 046 391和DE 10012408中所描述的那些；丙烯酸0，0'_二苯基酯衍生 物，苯并三唑衍生物，苯并咪唑衍生物；imadazolines ;bisbenzoazolyl衍生物，例如在专利 EP 669 323和US 2,463,264中所描述的那些;对氨基苯甲酸(PABA)衍生物;如在申请US 5， 237,071、US 5，166,355、GB 2303549、DE 19726184和EP 893 119所描述的亚甲基双（羟苯 基苯并三唑）衍生物;遮蔽聚合物和遮蔽硅氧烷，具体是在申请W0 93/04665中所描述的那 些;如在专利申请DE 19855649中描述的a-烷基苯乙烯衍生的二聚体;和如在专利申请EP 0 967 200和DE 19755649中所描述的4,4_二芳基丁二烯衍生物。
[0297] 无机遮蔽剂一般是有涂层或无涂层的金属氧化物的色素或毫微色素 (nanopigment)(初级颗粒的平均大小：一般为5nm至100nm，优选10nm至50nm)，例如，氧化钛 毫微色素(非晶态或晶态的金红石和/或锐钛矿形式）、氧化铁毫微色素、氧化锌毫微色素、 氧化锆毫微色素或者氧化铈毫微色素，它们本身都是广为人知的UV光保护剂。另外，常规的 涂层剂是氧化铝和/或硬脂酸铝。具体地，这些有涂层或无涂层的金属氧化物毫微色素可见 于专利申请EP 0 518 772和EP 0 518 773的描述。
[0298] 根据本发明的防辐射剂在根据本发明的组合物中存在的比例一般是相对于组合 物总重量的0.1-20重量％，且优选为相对于组合物总重量的0.2-15重量％。
[0299] 根据另一个目的，本发明还涉及至少一种选自SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的双链8祖寡核苷酸在抑制酪氨酸 酶表达中的用途。
[0300] 具体地，根据本发明的寡核苷酸可用作皮肤的漂白剂和/或抗褐变剂。
[0301] 根据本发明的双链RNA寡核苷酸还可以用于制备局部的、化妆品的或者皮肤病学 的组合物，以用于降低黑色素合成，具体是以治疗着色过度、色素形成斑以及皮肤变色为目 的，或者用于毛囊漂白，由于黑色素细胞机能亢进而导致的局部着色过度，例如特发性黑斑 病，发生于妊娠期间（"孕斑(pregnancy mask)"或者褐黄斑)或者oestro-progestin避孕期 间，由于良性黑色素细胞机能亢进和增殖而导致的局限性着色过度，例如称为光化性着色 斑的老年色素形成斑，可能由于损伤后伤口愈合或者光敏作用而造成的偶发性着色过度， 以及白斑病的特定形式，例如白癜风。对于后者(伤口愈合可能导致疤痕，这使皮肤呈现浅 色外观），由于不可能使损伤的皮肤再次着色，那么通过使剩余的正常皮肤区进行脱色而完 成所述方法，从而使皮肤整体呈现均一的白色。
[0302] 本发明的另一个目的涉及化妆方法，其用于使肤色漂白和/或增亮和/或使褐色皮 肤颜色均匀，其包括局部施用至少一种选自SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的双链1?熟寡核苷酸。
[0303]优选地，寡核苷酸在局部组合物中以小于或等于InM的浓度配制。
[0304] 更优选地，寡核苷酸与大小小于或等于lMi"电势为10-80mV的阳离子型颗粒缔 合，所述颗粒选自上面所述的表面活性剂胶束、嵌段聚合物胶束、非离子和阳离子表面活性 剂脂质体、非离子表面活性剂微囊、油质体、毫微乳剂颗粒、毫微胶囊、有机颗粒或无机颗 粒。
[0305]为了化妆、皮肤病学、眼或药物护理的目的，要避免侵入性方法，例如皮下或眼注 射。与根据本发明的siRNA缔合的阳离子型颗粒可以以悬浮液形式或掺合到化妆上可接受 的载体，例如洗剂、血清、乳化的或非乳化的凝胶、油/水型乳剂、水/油型乳剂或多重型乳 剂、微乳剂等形成，局部施用于皮肤或粘膜或眼内。
[0306]为促进与siRNA缔合的颗粒的穿透，可修改水的渗透性；这样，就有可能通过用 〇31^61七6(：1111〇1〇87的16￥&1116七61'1]\1210或〇61'1]1&1&13测量1￥]^(不显性失水)来控制水的渗透 性。
[0307] 举例来说，可使用以下方法：
[0308] -在施用根据本发明的组合物之前进行剥离(corneodisc，"涂剂"）、化学去皮或机 械皮肤磨擦术；
[0309]-用一种或多种具有脱脂效果的溶剂混合物预处理；
[0310]-用去污剂发泡产品清洁皮肤；
[0311] -例如，通过用不透水的合成膜(例如，Blenderm)覆盖要处理的皮肤表面或者通过 应用一层凡士林进行封闭预处理和/或封闭后处理。其作用是阻断皮肤天然的IWL并导致表 皮脂质的水合过度而变得更加可通透。
[0312] 在施用本发明的组合物之后，还可使用本领域技术人员公知的方法，所述方法促 进皮肤中分子的穿透，例如，离子电渗疗法或电穿孔法。
[0313]在体外皮肤模型的情况中，可应用下述处理：
[0314] -在沉积根据本发明的组合物之前，可通过改变介质(0.10-0.75mM代替1.5mM)或 通过加入螯合剂而降低Ca2+含量。其效果是降低膜间的粘附，这样就提高了皮肤的渗透性 (Effects of extra-and intracellular calcium concentration on DNA replication， lateral growth ? and differentiation of human epidermal cells in culture.Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol.1990；59(1)：17-25)；
[0315] -利用离子电渗疗法、电穿孔法以及公知的任何方法来改变该模型的渗透性。
[0316] 实施例1-配方
[0317] 阳离子胶束
[0318] -实施例1:辛基-0-葡糖苷/十六烷基三铵溴化物按摩尔比5/1
[0319] El:100mM溶于蒸馏水中
[0320] E2:50mM溶于蒸馏水中
[0321] E3:25mM溶于蒸馏水中
[0322] E4:12.5mM溶于蒸馏水中
[0323] 将2种表面活性剂(非离子+阳离子)溶于蒸馏水中。将SEQ ID N0.1的siRNA的悬浮 液(20yM)以体积比（siRNA:胶束)1:1至1:9加入，从而按比例降低胶束浓度。
[0324] -实施例2:把癸基-0-葡糖苷/二十二烷基三铵氯化物胶束按摩尔比5/1溶于蒸馏 水中。按前面实施例中的相同浓度制备。
[0325] 这两种悬浮液可应用于皮肤来治疗色素形成斑和皮肤变色或者用于漂白毛囊。
[0326] 阳离子脂质体
[0327] -实施例1:"液体"小泡
[0328] PEG 400异硬脂酸酯 5.5%
[0329] 二十二烷基三铵氯化物0.5%
[0330] 蒸馏水 qs 100
[0331] -实施例2:"刚性"小泡 棕榈酸山梨聚糖酯 2.75%
[0332] 胆固醇 2.75% 二十二烷基三铵氯化物 0.5%
[0333] 蒸馏水 qslOO
[0334] 这些脂质体悬浮液的例子是通过透析而实现的。把构成小泡的脂质溶于辛基-0-葡糖苷的水溶液中。然后使该溶液对水透析72小时。
[0335] 然后加入SEQ ID N0.4的siRNA悬浮液，使浓度相对于小泡约为3%的脂质。该非离 子脂质体悬浮液可以施用于皮肤以用于治疗色素形成斑和皮肤变色或者用于漂白毛囊。
[0336] 阳离子油质体
[0337] -油相 St6amineries Dubois所售的单硬脂酸鹿糖醋 0.45% 硬脂酸山梨聚糖醋 4EO (Tween 61 Uniquema.) 0.30% 二十二烷基三铵氯化物 0.21 % 乙酸维生素 E 0.5% 霍霍巴油 0.5%
[0338] 庚酸十八酯 1% 挥发性桂油 1% 维生素 E甘油酯 0.5% 防腐剂 0.02% BHT 0.01%
[0339] -水相
[0340] 蒸馏水 qs 100
[0341] 防腐剂 0.1%
[0342] 该分散体通过高压匀浆实现，目的是使颗粒大小约170nm。然后以1:1至1:20 (siRNA/油质体)的比例加入SEQ ID N0.16的siRNA悬浮液UOyMhsiRNA就会与颗粒的表面 复合。
[0343] 阳离子毫微胶囊
[0344] -有机相 聚己酸内酯（MW: 50000) 1% 维生素 E 1%
[0345] 聚二甲基硅氧烷共聚醇DC2 5695 (Dow Coming) 0.5% 二十二烷基三铵氯化物 0.21%
[0346] 丙酮 200 ml
[0347] -水相
[0348] Pluronic F68 0.5%
[0349] 蒸馏水 200ml
[0350]把有机相在搅拌下引入水相中。然后使丙酮和100ml水相蒸发掉，从而得到毫微胶 囊的悬浮液，其大小是220nm。然后以1:1至1: 20 (s iRNA/毫微胶囊）的比例加入SEQ ID 奶.37的811?嫩悬浮液(2〇1^)。于是811?嫩就会与颗粒的表面复合。
[0351 ] 有机纳米颗粒(nanoparticle)
[0352] -有机相 聚己二酸亚乙基酯（ScientificPolymer产品） 2% 聚二甲基硅氧烷共聚醇DC25695 (DowComing) 0.5%
[0353] 二十二烷基三铵氯化物 0.21% 丙酮 200 ml
[0354] -水相
[0355] Pluronic F68 0.5%
[0356] 蒸馏水 200ml
[0357] 把有机相在搅拌下引入水相。然后使丙酮和100ml水相蒸发掉，从而得到纳米颗粒 的悬浮液，所述纳米颗粒的大小是180nm。然后以1:1至1: 20(siRNA/纳米颗粒）的比例加入 SEQ ID从).40的8丨1?熟悬浮液(2(^]\〇。于是811?熟就会与颗粒的表面复合。
[0358] 阳离子毫微乳剂
[0359] -油相 Uniqema所售PEG 400异硬脂酸酯 1 % 二十二烷基三铵氯化物 1%
[0360] 鳄梨油 1% 霍霍巴油 3% 环五甲基桂氧烷 2%
[0361] -水相
[0362] 蒸馏水 30%
[0363] -缩二丙二醇 10%
[0364] -稀释相
[0365] 蒸馏水 qs 100%
[0366] 防腐剂 0.1%
[0367] 乳剂通过将油相在非常强烈的搅拌下分散在水相中制备。然后将得到的悬浮液使 用非常高压力的匀浆器在压力约1200b下匀浆几次。颗粒的大小达到50nm量级并且悬浮液 是透明的。然后加入稀释相。
[0368] 如前面的例子一样，然后以1 : 1至1 : 20 (s iRNA/毫微乳剂）的比例加入SEQ ID 奶.42的811?嫩悬浮液(2〇1^)。于是811?嫩就会与颗粒的表面复合。
[0369] 实施例2-根据本发明的s iRNA的活性测量
[0370] 根据本发明的序列为SEQ ID N0S 1-47的47种siRNA的有效性利用Invitrogen开 发的"pSCREEN-iT?系统"测试进行评价，该系统用于评价对酪氨酸激酶抑制的有效性 (GenBank登记号M27160)。
[0371] 测试的实验方案：
[0372] ?在48孔板中接种2X104A549细胞/孔并培养过夜。
[0373] ?用2ug/ml的Lipofectamine 2000(Invitrogen)与下面的三种试剂复合一式三 份地进行共转染5小时：
[0374] ?与LacZ基因偶联的酪氨酸酶pScreen-iT?载体-10ng/孔
[0375] ?萤光素酶报告质粒_20ng/孔
[0376] ? InM Stealth? RNA(表1中给出的序列）
[0377] ?将细胞在转染后24小时进行裂解，并测量半乳糖苷酶（P-Gal)和萤光素酶 (Luc)的活性。P-Gal/Luc的比率决定了酪氨酸酶抑制的百分比。
[0378] 表1I给出了得到的结果。
[0379] 表1I:对47种双链RNA寡核苷酸降解酪氨酸酶mRNA(GenBank登记号M27160)的有效 性的测定。
[0381] 其次，对于20种最有效的序列，也就是其在InM下有效性大于91 %的序列测定了剂 量效应。结果在表1II中给出。
[0382] Table III:用0.0016nM至InM的剂量通过剂量效应对20种选择的序列的有效性的 测定。
[0384] 本发明的siRNAs中20种最有效的序列在InM时表现出的有效性超过94% ^测试的 最低剂量是〇.〇16nM，其对应于降解编码酪氨酸酶的mRNA的有效性为72%。
[0385] 实施例3-对根据本发明的siRNA引发的可能干扰素类型应答进行的评价
[0386] 本发明主题的siRNAs经证实不会引发干扰素类型的应答。为此，利用定量PCR (qPCR)测量了 0AS-1和IFIT-1(干扰素诱导型三十四肽重复结构域)基因的表达，它们是公 知的由干扰素诱导的（Wieland SE等，Searching for Interferon-Induced Genes That Inhibit Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mouse Hepatocytes，J.of Virology 2003；77：1227-1236〇Persengiev SP^ ? Nonspec if ic ? concentration-dependent stimulation and repression of maminalian gene expression by small interfering RNAs(siRNAs).RNA 2004;10:12_18〇Bridge AJ等，Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.Nature Genet.2003；34： 263_264〇Scacheri PC等，Short interfering RNAs can induce unexpected and divergent changes in the levels of untargeted proteins in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，101:1892_1897〇Sledz CA等，Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol?2003;9:834-9〇 Patzwahl R等，Enhanced expression of interferon-regulated genes in the liver of patients with chronic hepatitis C virus infect ion:detection by suppression-subtractive hybridization. J.Virol .2001 ;75:1332-1338。），测量的方法 按照由 Invitrogen销售的 "BLOCK-iT? RNAi Stress Response Control Kit(human)for monitoring interferon-mediated stress response to double-stranded RNA in human cells"中所描述的方案。
[0387] hOAS-1基因表达水平的测量:
[0388] hOAS-1基因的表达水平与GAPDH参考基因表达水平相关。
[0390]~结果：只有阳性对照（lkb的长dsRNA)诱导了hOAS-1基因表达的明显提高。测试的-序列（SEQ ID N0S.1、2、4、13和46)都没有明显地提高hOAS-1基因的表达。
[0391] hIFIT-1基因表达水平的测量

[0393] 结果：只有阳性对照（lkb的长dsRNA)明显诱导了hIFIT-1基因的表达，其在约25的 阈周期值检测到。测试的序列（SEQ ID NOS. 1、2、4、13和46)诱导hIFIT-1基因表达的阈周期 值只有约32-36,也就是说7-11个周期的差异对应于信使的量低了 102-103倍。
[0394]这些测定使得可能推断，根据本发明的dsRNA不会诱导干扰素类型的应答。
【主权项】
1·组合物，其包含至少一种选自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46或47的序列的双链1?祖寡核苷酸，所述寡核苷酸与大小小于或等于以111、 ζ电势为10_80mV的阳离子型颗粒缔合。2. 根据权利要求1的组合物，其特征在于该双链RNA寡核苷酸存在的浓度小于或等于 100μΜ〇3. 根据权利要求1或2的组合物，其特征在于该阳离子型颗粒选自表面活性剂胶束、嵌 段聚合物胶束、非离子和阳离子表面活性剂脂质体、非离子表面活性剂微囊、油质体、毫微 乳剂颗粒、毫微胶囊、有机颗粒或无机颗粒。4. 根据权利要求1-3任一项的组合物，其特征在于该阳离子型颗粒的大小小于或等于 500nm〇5. 根据权利要求1-4任一项的组合物，其特征在于该阳离子型颗粒的大小小于或等于 300nm〇6. 根据权利要求1-5任一项的组合物，其特征在于该阳离子型颗粒是非离子两亲型表 面活性剂和阳离子表面活性剂形成的胶束。7. 根据权利要求1-5任一项的组合物，其特征在于该嵌段聚合物胶束选自阳离子两亲 型嵌段聚合物胶束、非离子两亲型嵌段聚合物和阳离子两亲型嵌段聚合物形成的胶束以及 非离子两亲型嵌段聚合物和阳离子表面活性剂形成的胶束。8·至少一种选自SEQIDN0S·3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 或47的序列的双链RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表达中的用途。9·至少一种选自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46或47的序列的双链RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表达中的用途，其特征在于所述的寡 核苷酸与大小小于或等于1μπι、ζ电势为10-80mV的阳离子型颗粒缔合。10. 根据权利要求8或9的用途，作为用于皮肤的漂白剂和/或作为抗褐变剂。11. 根据权利要求8-10任一项的用途，用于预防形成和/或消除色素形成斑，和/或老年 斑，和/或用于增亮和/或漂白褐色皮肤和/或使褐色皮肤颜色均匀。12. 至少一种选自 SEQ ID N0S.3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 或47的序列的双链RNA寡核苷酸在制备用于皮肤脱色的组合物中的用途。13·至少一种选自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46或47的序列的双链RNA寡核苷酸在制备用于皮肤脱色的组合物中的用途，其特征在于 所述的寡核苷酸与大小小于或等于1μπι、ζ电势为10-80mV的阳离子型颗粒缔合。14. 根据权利要求13的用途，其特征在于该组合物用于治疗特发性黑斑病、妊娠或者 oestro-progestin避孕相关的着色过度、偶发性着色过度、由白斑病和/或白癜风引起的着 色过度。15. 用于漂白和/或增亮肤色和/或使褐色皮肤颜色均匀的化妆方法，其包括局部施用 至少一种选自 SEQ ID N0S.3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47的 序列的双链RNA寡核苷酸。16. 用于漂白和/或增亮肤色和/或使褐色皮肤颜色均匀的化妆方法，其包括局部施用 至少一种选自 SEQ ID N0S.1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或 47的序列的双链RNA寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸与大小小于或等于1μπι、ζ电势为 10-80mV的阳离子型颗粒缔合。17. 根据权利要求15或16的方法，其特征在于所述的寡核苷酸以小于或等于100μΜ的浓 度配制在局部组合物中。18. 根据权利要求15-17任一项的方法，其特征在于局部施用前进行选自剥离、化学去 皮、机械皮肤磨擦术、施用一种或多种具有脱脂效果的溶剂以及用去污剂发泡产品清洁皮 肤的皮肤预处理。19. 根据权利要求15-18任一项的方法，其特征在于局部施用后进行封闭的后处理。
【文档编号】C12N15/113GK105854028SQ201610183232
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2006年9月20日
【发明人】C.科林－迪詹戈恩, J.-T.斯蒙纳特
【申请人】莱雅公司