虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用
【专利摘要】本发明涉及虎杖苷在保护睾丸缺血再灌注损伤中的应用。睾丸扭转后复位是一个缺血再灌注损伤的过程，造成的损伤会影响男性生殖功能甚至导致不育，且缺乏有效的临床辅助治疗。虎杖苷在缺血再灌注损伤中抗氧化应激的活性被广泛研究，尤其是在心脏、脑和肺等组织中，但在睾丸缺血再灌注损伤中的作用和机制尚无报道。本发明公开了虎杖苷作为治疗睾丸缺血再灌注损伤药物的应用，可改善睾丸组织的损伤，调节睾丸缺血再灌注过程中脂质过氧化反应和酶促抗氧化防御体系，减轻睾丸缺血再灌注引起的生殖细胞凋亡，调节缺血再灌注睾丸中凋亡相关蛋白。虎杖苷具有保护睾丸缺血再灌注损伤的作用，拓宽了虎杖苷的研究和应用，并且为睾丸扭转的治疗提供新的思路。
【专利说明】
虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物应用，具体涉及虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 睾丸扭转是一种泌尿外科急症，最常见发生在新生儿、儿童和青少年男性，在25岁 以下的年轻男性中发病率为1/4000, 61%的患者年龄在21岁以下。睾丸扭转又称精索扭 转，患者通常伴随着突发的阴囊疼痛，同时会出现恶心、呕吐等症状。由于睾丸血管发生压 迫和阻塞，导致睾丸组织缺血甚至坏死，继而导致生殖功能下降甚至不育。症状出现后，必 须尽快实行手术复位以避免进一步损伤，一般6小时之内解除扭转可以避免睾丸功能完全 丧失，但如果扭转时间超过12小时，75%的患者需要接受睾丸切除术。许多研究表明，解除 扭转后，虽然可以避免睾丸的坏死，但继而会出现更为严重的组织损伤和生精功能损伤，且 目前尚无非常有效的预防和治疗方法。
[0003] 睾丸复位后损伤加重的机制在于复位造成的缺血再灌注损伤：睾丸复位后血流逐 渐恢复，同时睾丸组织产生大量的活性氧(ROS, reactive oxygen species)，脂质过氧化 作用增强，而抗氧化的酶系统受到攻击，从而造成氧化应激损伤，继而导致睾丸组织形态的 改变以及生殖细胞的凋亡。其中脂质过氧化被认为是睾丸缺血再灌注损伤中最原始、损害 最大的反应，丙二醛是一种重要的脂质过氧化物，由R0S转变而来并间接反映细胞内R0S的 水平。酶促抗氧化防御系统包括超氧化物歧化酶，过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶， 可以保护细胞免受R0S损伤，但是在缺血再灌注过程中抗氧化酶的活性受到抑制。一系列动 物研究发现，在睾丸缺血再灌注损伤中，氧化应激反应尤其是R0S的激增导致睾丸组织形态 学改变和生殖细胞特异性凋亡，继而导致实验动物生殖功能障碍甚至不育。因此，保护扭转 睾丸免受复位后的再灌注损伤是非常重要而棘手的问题。
[0004] 虎杖苷是从植物虎杖的根茎提取出来的一种单晶体的多酚类中药，具有一系列的 生物功能，包括抗菌和抗动脉粥样硬化等。近年来，虎杖苷在缺血再灌注损伤中抗氧化应激 的活性被广泛研究，尤其是在心脏、脑和肺等组织中，但虎杖苷在睾丸缺血再灌注损伤中的 作用和机制尚不明确。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，能够 在睾丸扭转复位的早期起到预防和治疗缺血再灌注损伤的作用，为睾丸扭转的防治提供一 种新型的有效药物。
[0006] 本发明所采用的技术方案为： 虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用。
[0007] 虎杖苷作为改善睾丸缺血再灌注过程中组织损伤的药物应用。
[0008] 虎杖苷作为调节睾丸缺血再灌注过程中脂质过氧化反应和酶促抗氧化防御体系 的药物应用。
[0009] 虎杖苷作为减轻睾丸缺血再灌注引起的生殖细胞凋亡的药物应用。
[0010] 虎杖苷作为调节缺血再灌注睾丸中凋亡相关蛋白的药物应用； 所述凋亡相关蛋白包括0&8口&86-3,0&8口&86-8,0&8口&86-9，？六1^ ：)，13(31-2以及1^叉〇
[0011] 本发明具有以下优点： 本发明通过构建大鼠睾丸缺血再灌注模型，首次探索了虎杖苷在预防和治疗睾丸缺血 再灌注损伤中的积极作用。实验证明，虎杖苷能够明显改善睾丸组织的损伤，体现在减轻间 质充血和出血、生殖细胞层退化、生精功能的减弱、曲细精管破裂和梗死，增加生殖细胞层 数增加，并且降低组织学损伤评分和Johnsen睾丸活检评分;此外，虎杖苷明显减轻睾丸缺 血再灌注中的氧化应激水平，表现在降低睾丸组织中丙二醛的水平，提高过氧化氢酶，超氧 化物岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性;通过减轻氧自由基损伤，虎杖苷明显降低曲细 精管中生殖细胞的凋亡，并且降低促凋亡蛋白（激活的caspase-3，caspase-8，caspase-9和 PARP)的表达同时提高Bcl-2与Bax的表达比值，进一步证明了虎杖苷保护睾丸缺血再灌注 损伤的作用。本发明首次提出并证明了虎杖苷具有保护睾丸缺血再灌注损伤的作用，拓宽 了虎杖苷的研究和应用，并且为睾丸扭转的治疗提供新的思路。另外，由于虎杖苷价格低 廉，易于获得，应用前景较为广阔，可用于开发富含虎杖苷的保健品和药物，对民众日常保 健，特别是对睾丸扭转的治疗有所裨益。
【附图说明】
[0012] 图1是各组大鼠睾丸组织HE染色图（100X，400X); 图中，31^111-假手术组，1'/1)(1：(^8；[011/(161：(^8；[011)-缺血再灌注组，1'/1)+?0-缺血再灌注 加虎杖苷治疗组。
[0013] 图2是各组大鼠睾丸组织中丙二醛的含量，以及过氧化氢酶，超氧化物岐化酶和 谷胱甘肽过氧化物酶的活性； 图中，A-丙二醛的含量，B-过氧化氢酶的活性，C-超氧化物岐化酶的活性，D-谷胱甘肽 过氧化物酶的活性;Sham-假手术组，T/D-缺血再灌注组，T/D+PD-缺血再灌注加虎杖苷治疗 组。
[0014] 图3是各组大鼠睾丸组织的凋亡检测结果； 图中，A-睾丸组织的TUNEL染色图（400 X )，B-凋亡阳性的曲细精管占总小管的百分 比；Sham-假手术组，T/D -缺血再灌注组，T/D+PD-缺血再灌注加虎杖苷治疗组。
[0015] 图4是各组大鼠睾丸组织中凋亡相关蛋白的表达； 图中，A-caspase-3，caspase-8，caspase-9 和 PARP 及其活性片段的表达，B-Bcl-2 和 Bax 的蛋白表达和Bel-2/Bax的统计结果;Sham-假手术组，T/D -缺血再灌注组，T/D+PD-缺血再 灌注加虎杖苷治疗组。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0017]本发明涉及虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，包括预防和治 疗两方面。具体作用包括： (1)虎杖苷在改善睾丸缺血再灌注过程中组织损伤的作用。
[0018] (2)虎杖苷调节睾丸缺血再灌注过程中脂质过氧化反应和酶促抗氧化防御体系的 作用。
[0019] (3)虎杖苷在预防睾丸缺血再灌注引起的生殖细胞凋亡中的作用，所述生殖细胞 凋亡采用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测。
[0020] (4)虎杖苷减轻缺血再灌注睾丸中凋亡相关蛋白的作用，所述凋亡相关蛋白包括 caspase-3，caspase_8，caspase_9，PARP，Bcl_2 以及 Bax〇
[0021] 以下通过具体的实验介绍，阐述本发明涉及的虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注 损伤药物中的应用的具体验证效果： 1.材料和方法 1.1虎杖苷注射液的制备及大鼠睾丸缺血再灌注模型(T/D)的建立 (1)虎杖苷注射液的制备 本发明中所使用之虎杖苷粉末为中国药品生物制品检定所提供，虎杖苷应用液的制备 方法如下:虎杖苷粉末置于五氧化二磷减压干燥器中干燥14小时，称取虎杖苷粉末20mg，避 光条件下以l〇〇yl二甲基亚砜(DMS0)溶解，制成虎杖苷储备液，置于-20°C保存;实验前用 10 ml生理盐水将储备液稀释成2 mg/ml的应用液，即为所需浓度的虎杖苷注射液。
[0022] (2 )大鼠睾丸缺血再灌注模型(T/D )的建立 实验所用雄性SD大鼠为第四军医大学实验动物中心提供，于温度25 ± 2°C，恒光周期 12 h light/12 h dark的环境下，以固体鼠粮和自来水饲养。选取18只体重在300-340g之 间的成年雄性大鼠，随机平均分为三组:假手术组，缺血再灌注组，虎杖苷治疗组。所有动物 均用0.2 %戊巴比妥(3 ml/kg)麻醉。
[0023]假手术组:作腹部正中切口，沿着睾丸周围结缔组织轻轻地将右侧睾丸提出切口， 之后立即将睾丸还纳回阴囊，缝合切口； 缺血再灌注组:作腹部正中切口，沿着睾丸周围结缔组织轻轻地将右侧睾丸提出切口， 剥离附睾及周围结缔组织，沿精索长轴将睾丸顺时针扭转720° (开始计时），随后将睾丸还 纳回阴囊，用止血钳夹住切口，覆盖四层用生理盐水浸湿的无菌纱布；2小时后，打开切口， 将扭转的睾丸复位后还纳回阴囊，缝合切口；在睾丸解除扭转前30min，腹腔注射生理盐水， 注射剂量为l〇ml/kg。
[0024]虎杖苷治疗组:手术过程同缺血再灌注组，但在睾丸解除扭转前30min，腹腔注射 虎杖苷应用液，注射剂量为l〇ml/kg，虎杖苷剂量为20 mg/kg。
[0025]解除扭转后24小时，将大鼠脱颈处死，快速取出右侧睾丸，一半行组织学检测，另 一半进行生物化学检测。
[0026] 1.2组织学检测 将睾丸组织置于Bouin氏液中固定24小时，固定12小时的时候，将睾丸冠状切开;常规 梯度酒精脱水；二甲苯透明两次，每次半小时；石蜡包埋；制成5 M厚度的切片；常规HE染 色；显微镜观察。
[0027]组织损伤程度采用四个组织学指标评估:平均曲细精管直径，Cosentino组织学损 伤评分，平均生殖细胞层数和Johnsen睾丸活检评分。评估中，对三次独立实验的组织切 片，每张切片随机选取四个视野，平均曲细精管直径在400 X，其余三个指标是在200 X的 视野下进行观察。其中，平均曲细精管直径的测量方法为用显微镜测微尺测量视野下较圆 的曲细精管直径；组织学损伤指数根据Cosent ino等人描述的方法进行评估(Cosentino MJ， Nishida M， Rabinowitz R， Cockett AT. Histopathology of prepubertal rat testes subjected to various durations of spermatic cord torsion. J Androl 1986;7:23-31.);平均生殖细胞层数是对90°、180°、270°和360°四个轴位，从基膜到管腔 的生殖细胞层数进行平均所得;睾丸活检评分是根据生殖细胞的成熟程度进行评估，具体 的评分规则参考Johnsen等人提出的方法（Johnsen SG. Testicular biopsy score count-a method for registration of spermatogenesis in human testes: normal values and results in 335 hypogonadal males. Hormones 1970;1:2-25.) 1.3睾丸组织生物化学检测 (1)制备组织匀浆 准确称取组织重量，按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入冰生理盐水，冰水浴条件下 充分研磨，4°C，3000转/分离心十分钟，取上清，制备成10%的组织匀浆，并用BCA法测定匀浆 的蛋白浓度。使用前用冷生理盐水将组织匀浆稀释成适宜浓度。
[0028] (2)丙二醛含量的测定 丙二醛含量测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(A003-1，TBA法）。在95°C，酸 性环境下，脂质过氧化物丙二醛可以和硫代巴比土酸缩合，在532nm处检测红色产物的吸光 度值，丙二醛含量用纳摩尔/毫克蛋白表示。
[0029] (3)过氧化氢酶活力的测定 过氧化氢酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(A007-1，可见光法）。过氧化 氢酶分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵快速中止，钼酸铵可以和剩余的过氧化氢反应 生成淡黄色的络合物，并在405nm处，光径0.5cm，测定吸光度值。定义每毫克蛋白质每秒钟 分解1微摩尔过氧化氢的量为一个酶活力单位，过氧化氢酶活力用单位/毫克蛋白表示。
[0030] (4)超氧化物歧化酶活力的测定 超氧化物歧化酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(A001-1，WST-1法）。将 10%组织匀浆稀释150倍，在405nm处，吸光度值抑制50%所对应的酶量为一个酶活力单位，超 氧化物岐化酶的活力用单位/毫克蛋白表示。
[0031] (5)谷胱甘肽过氧化物酶的测定 谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(A005)。谷胱甘肽过 氧化物酶可以促进还原型谷胱甘肽与过氧化氢反应，剩余的还原型谷胱甘肽与二硫代二硝 基苯甲酸反应生成黄色产物，在412nm处，lcm光径，测定吸光度值，计算出还原型谷胱甘肽 的消耗，即可反应酶的活力。规定每毫克蛋白质，使反应体系中还原型谷胱甘肽浓度降低1 微摩尔/升为一个酶活力单位。
[0032] 1.4末端标记法检测生殖细胞凋亡(TUNEL) TUNEL试剂盒购于德国罗氏公司（Cat. No. 11684817910)。组织切片常规脱蜡、水合； 置于枸橼酸盐缓冲液，微波炉沸腾15分钟进行抗原修复;按照TdT:荧光素标记的dUTP液=1: 9的比例配置TUNEL反应混合液，处理组加50yl反应混合液，而阴性对照组仅加50 yl荧光 素标记的dUTP液，加盖封口膜37°C条件下在湿盒中反应1小时30分钟;PBS缓冲液清洗3次， 每次5分钟；DAPI(500 ng/yl)染核5分钟;PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟;荧光显微镜下观 察。
[0033] 评估凋亡指数时，对三次独立实验的组织切片，每张切片随机选取四个视野，计算 凋亡阳性的曲细精管占总小管数的百分比（100X)。
[0034] 1 ? 5 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达 BCA法检测睾丸组织的总蛋白含量;利用聚丙烯酰氨凝胶电泳将总含量为50 yg的蛋白 进行分离;随即将蛋白转到NC膜上;5%脱脂奶粉室温封闭1小时;一抗孵育过夜(4°C);PBS缓 冲液清洗3次，每次5分钟;二抗孵育1小时(室温）;PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟;发光仪检 测蛋白条带。
[0035] 2.结果 2.1虎杖苷给药后大鼠睾丸形态学的变化 如图1所示HE染色结果中，假手术组显示的为正常的睾丸结构和曲细精管结构，没有发 现异常的形态学改变;缺血再灌注组中，睾丸间质表现为严重的血管充血和出血，曲细精管 中，精子和精细胞明显减少，生殖细胞层严重退化，上皮细胞之间有空泡形成，部分曲细精 管管腔内充满未成熟的生殖细胞，还可发现小管破裂甚至完全梗死;虎杖苷治疗组中，绝大 多数曲细精管结构规则，精子发生正常，但有少数小管出现轻微的精子和精细胞的减少，未 成熟的生殖细胞脱落至管腔。
[0036]如表1显示，与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠的平均曲细精管直径，平均生殖 细胞层数和Johnsen睾丸活检评分均明显降低（非别为P〈0.05，P〈0.05，P〈0.01)， Cosentino组织学损伤评分显著升高(P〈0.01);与再灌注组对比，虎杖苷治疗可以显著增加 平均生殖细胞层数和Johnsen睾丸活检评分（P〈0.05)，同时降低组织学损伤评分（P〈 0.05)，但对平均曲细精管直径的改变没有统计学意义(P>0.05)。
[0037]以上结果提示，虎杖苷可以明显减轻缺血再灌注大鼠睾丸的组织损伤。
[0038] 2.2虎杖苷给药后睾丸组织脂质过氧化和抗氧化水平的变化 如图2所示，对三组大鼠睾丸组织的丙二醛含量，过氧化氢酶、超氧化物岐化酶和谷胱 甘肽过氧化物酶的活性进行统计学分析，缺血再灌注损伤明显升高组织中的丙二醛含量(P 〈0.01 )，降低过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性(P〈〇. 01 )，超氧化物岐化酶的变化 没有统计学意义;虎杖苷明显降低缺血再灌注大鼠睾丸丙二醛的含量(P〈〇.05)，同时提高 过氧化氢酶、超氧化物岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性(P〈〇. 05)。
[0039] 图中，林P〈〇.〇l，T/D vs Sham;# P〈0.05，T/D+PD vs T/D。
[0040] 以上结果提示，虎杖苷能明显降低缺血再灌注损伤引起的脂质过氧化反应，并提 高酶促抗氧化防御系统的抗氧化能力，从而改善睾丸组织的氧化应激损伤。
[0041] 2.3虎杖苷给药后生殖细胞凋亡的变化 研究表明，睾丸扭转对睾丸间质细胞和支持细胞没有影响，但可以引起生殖细胞特异 性凋亡（Turner TT, Tung KS, Tomomasa H, Wilson Lff. Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat. BIOL REPR0D 1997; 57:1267-7.)。如图3所示，与假手术组相比，缺血再灌注组出现凋亡的曲细精管的百分比明显增加(P 〈0.01 )，凋亡阳性小管中出现凋亡的生殖细胞数也显著增加；而虎杖苷的治疗可以明显改 善生殖细胞的凋亡。
[0042] 图中，**P〈〇.〇l，T/D vs Sham;## P〈0.01，T/D+PD vs T/D;TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)-末端标记法显不凋亡细胞核，DAPI (4'，6_diamin〇-2-phenylindole)-DAPI核酸染料显示细胞核，Merge- TUNEL染色和DAPI染色的合并图。
[0043]以上结果进一步证实了虎杖苷对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用，这可能与 虎杖苷能够降低睾丸组织中氧自由基含量有关。
[0044] 2.4虎杖苷给药后大鼠睾丸中凋亡相关基因表达的变化 如图4所示，缺血再灌注组caspase-3，caspase-8，caspase-9和PARP的裂解片段较假手 术组明显增加，经统计学分析，Bcl-2与Bax的表达比值显著降低(P〈0.05);虎杖苷治疗组可 以降低caspase-3，caspase-8，caspase-9和PARP的激活，并显著提高Bcl-2与Bax的表达比 值(P〈0.01)〇
[0045] 图中，*P〈〇.〇5，T/D vs aam;## P〈0.01，T/D+PD vs T/D 以上结果提示，虎杖苷抑制生殖细胞凋亡是通过caspase途径，并可抑制促凋亡相关基 因的表达，促进抗凋亡基因的表达，以达到抗凋亡的作用。
[0046]综上所述，本发明发现中药活性成分虎杖苷对大鼠睾丸缺血再灌注损伤具有积极 的治疗作用，体现在虎杖苷可以减轻睾丸的组织损伤、平衡脂质过氧化与抗氧化酶系统之 间的平衡、减轻生殖细胞的凋亡以及调节凋亡相关蛋白的表达。虎杖苷易取得，成本低，并 且虎杖苷注射液现在国内处于lib期临床人体研究阶段，因此虎杖苷在治疗睾丸缺血再灌 注损伤方面具有较为广阔的应用前景。
[0047]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书 而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于： 虎杖苷作为改善睾丸缺血再灌注过程中组织损伤的药物应用。3. 根据权利要求1所述的虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于： 虎杖苷作为调节睾丸缺血再灌注过程中脂质过氧化反应和酶促抗氧化防御体系的药 物应用。4. 根据权利要求1所述的虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于： 虎杖苷作为减轻睾丸缺血再灌注引起的生殖细胞凋亡的药物应用。5. 根据权利要求1所述的虎杖苷在制备保护睾丸缺血再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于： 虎杖苷作为调节缺血再灌注睾丸中凋亡相关蛋白的药物应用； 所述凋亡相关蛋白包括 caspase-3，caspase-8，caspase-9，PARP，Bcl_2 以及 Bax。
【文档编号】A61K31/7034GK105853447SQ201610306517
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】李臻, 乔慧莲, 陈浩, 曹碗君
【申请人】中国人民解放军第四军医大学