一种治疗结肠癌的药物组合物的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种药用组合物，具体涉及一种川芎乙醇提取物与低浓度血清的药物组合物。它包含川芎乙醇提取物和低浓度血清组合。本发明的优点是：所得药物组合物具有治疗结肠癌的作用，其疗效优于单独使用川芎乙醇提取物或低浓度血清。
【专利说明】
一种治疗结肠癌的药物组合物
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种用于治疗结肠癌的药物，更具体涉及 一种川芎乙醇提取物与低浓度血清的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一，位于胃肠道肿瘤的第二位，在恶性 肿瘤居第三位，且发病多在40岁以后。目前治疗手段仍以外科手术为首选，但是手术切除肿 瘤病灶难以根治并且费用昂贵。因此，探求高效、低毒、经济、符合患者需求的治疗结肠癌的 药物成为许多学者坚定不移的追求目标。中医认为结肠癌是由于机体正气不足、湿毒内结 凝滞而导致的，一般都会采用扶正固本、清湿消热等功能的中药配方进行治疗。近年来许多 学者使用中药提取物抑制体外培养结肠癌细胞系的增殖、影响细胞周期、促使细胞凋亡，研 制出多种植物来源型药物。
[0003] 川考系伞形科藁本属植物川考(Ligusticum Chuanxiong Hort)的干燥根莖，另|J名 为香果、京芎、马衔、贯芎等。其味辛微苦、药性温和，主要产于四川、贵州、云南等地，其中以 四川产者质优。川芎常被用于活血化瘀、开郁行气、疏风止痛，以及治疗月经不调、经闭痛 经、胸胁疼痛、头痛眩晕、跌打损伤等症，在临床治疗中主要用于心脑血管疾病及妇科疾病 等。川芎有效成分的提取方法主要有传统提取法、溶剂提取法和超临界萃取法等。传统提取 法主要有水煎法、回馏法、蒸馏法、渗漉法等，针对川芎这种含有不稳定成分的药材应该使 用更加温和的提取方法。超临界萃取等现代提取和分离技术由于具有获得提取物的纯度 高、环保节能等优点而优越性日益显著。但是，由于超临界萃取是使用的是新技术新设备， 目前局限性也比较大，还难以应用于提取川芎有效成分的工业化大规模生产。溶剂提取法 中常用的溶剂亲水性由低到高为石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇，甲醇。经检 索发现，乙醇和乙醚是川芎提取有效成分常用的溶剂，而乙醇因对有效成分的提取较完全 而更为常用，是效果较佳的溶剂。因此本发明采取的提取川芎有效成分的方法为乙醇提取 法（以下简称醇提法）。川芎主要的化学成分是阿魏酸、川考嗪、蒿本内酯、川考内酯等。阿魏 酸和川芎嗪是其主要的活性成分；蒿本内酯、川芎内酯、川芎酚等是其主要的挥发油类物 质;阿魏酸、大黄酚、瑟丹酸、亚油酸等是其主要的酸性成分;川芎嗪、黑麦草碱、L-β-丙烯酸 乙酯-7-醛基-β咔啉等是其主要的生物碱类。据研究发现，川芎具有一定的抗氧化作用。生 物碱类和酚酸类是活血祛瘀的主要活性成分。阿魏酸能抑制血小板的聚集，促进血小板的 解聚和抗血栓的形成，解除血管平滑肌的痉挛，抗氧化等。近年来，由于川芎提取物针对镇 静、抗菌和抗氧化有良好疗效，尤其是川芎的复方制剂能够抗帕金森病活性，因此其引起了 更加广泛的关注，也极大的拓宽了川芎的药用范围。针对川芎成分的分离提取与表征对于 加快川芎提取物新药的研究和开发以及提高人类的生活质量和生存质量具有重要意义。且 有研究证明川芎对肺癌、前列腺癌、脑肿瘤、溃疡性结肠炎等疾病均有良好的治疗效果。
[0004] 体外细胞培养在生物工程研究中占有着不可动摇的地位，可作为代替模型用于药 理和环境毒理学的研究。体外研究的优点在于可以减少实验动物的用量、节约实验时间、排 除体内其他因素的干扰，同时也可进行多种药物的药理试验。牛血清因含有丰富的细胞生 长所必须的营养物质，经常被用于动物细胞的体外培养。牛血清可以分为胎牛血清、新生牛 血清和小牛血清三种。而胎牛血清取自胚胎，其中所含有的抗体、补体等对细胞有害成分最 少，因而是品质最高的。胎牛血清是一种浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，是剖腹产 的胎牛的血浆经去除纤维蛋白原形成的一种成分复杂的混合物，其蛋白质的质量浓度为 3.5%~5.0%，血红蛋白的质量浓度小于或等于0.02%。据研究发现，胎牛血清除了能够提供基 本的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，还能够提供激素和各 种生长因子、结合蛋白、促接触和伸展因子，并且对培养中的细胞起到某些保护作用。胎牛 血清还提供作用尚不明确的高分子物质，这些高分子物质在细胞存活、酶促反应以及细胞 分裂等生物反应中起重要作用。
[0005] 血清饥饿法是能够将细胞周期停滞于G0/G1期，同时又对细胞周期发育进程影响 较小的一种简便有效的方法。血清饥饿是指通过降低培养液中的血清浓度，使培养的细胞 因缺乏血清生长因子而无法分裂，经过一定时间后加入血清，从而使细胞能够同步分裂的 方法。正常培养细胞时的血清浓度为15-20%，当血清浓度低于15-20%时即为血清饥饿。现在 有关血清饥饿的研究主要是用于同步分裂，而本发明旨在利用一定浓度的血清饥饿来更大 的发挥川芎的药效。常见的结肠癌细胞系有HCT116，HCT8，HT29，LS174T，L0V0，SW480，SW6 20 等。徐修礼等研究发现川；素能够在一定程度上抑制moser大肠癌细胞的增殖、诱导肿瘤细 胞凋亡，并且具有增强化疗药物作用的功能。韩娇艳发现使用不同浓度的盐酸川芎嗪刺激 人前列腺癌PC-3细胞与人结肠癌HCT-116细胞后，发现PC-3肿瘤细胞与HCT-116肿瘤细胞 增殖明显受抑制(P〈〇.05)。房良华研究发现主要成分为川芎内酯，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，芒 柄花苷洋，毛蕊异黄酮，芒柄花黄素，黄芪甲苷，藁本内酯等的透脓散提取液可抑制人结肠 癌L0V0细胞的增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞停滞在G1期。但暂未发现使用川芎对HT29结肠 癌细胞做相关研究的报道。根据川芎活血化瘀、开郁行气、疏风止痛的特征，本发明以HT29 结肠癌细胞作为模型，使用不同浓度的川芎醇提物和低浓度胎牛血清培养HT29细胞，进行 细胞增殖、细胞凋亡、细胞迀移等相关实验研究。结果表明，仅用200^/ιΛ川芎的细胞存活 率为63.42%，凋亡率为13.27%;仅用5%血清的细胞存活率为90.05%，凋亡率为0.96%; 200yg/ mL川考醇提物与5%血清联用的细胞存活率为33.54%，凋亡率为28.62%，结肠癌细胞的迀移 能力显著降低，则这种药物组合效果显著，从而验证其有抑制结肠癌的效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种包含川芎醇提物和低浓度血清的药物组合物。
[0007] 本发明中的药物组合物为川芎醇提物和低浓度血清同时使用。
[0008] 作为优选，所述川芎醇提物为将川芎粉碎成粉末状后加入乙醇回流提取，冷冻干 燥后粉碎所得的粉末状固体，其浓度为200yg/mL。
[0009] 作为优选，所述血清为胎牛血清，其为剖腹产的胎牛的血浆经去除纤维蛋白原形 成的成分复杂的液体，其重量百分比为5 %。
[0010] 本发明利用所述药物组合可制备用于治疗肿瘤的药物。
[0011] 本发明所述的肿瘤为结肠癌。
[0012] 本发明的有益效果在于：（1)获得的药物组合物可抑制结肠癌细胞的增殖、促进 其凋亡、抑制其转移；（2)采用该方法安全可控，并且便于操作、保管、贮存和运输。
[0013]
【具体实施方式】： 为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例 来进一步介绍本发明的应用和技术效果。
[0014] 实施例1川芎醇提物的制备 首先称取适量川芎药材并将其粉碎成粉末状，然后加入药材重量10倍量的80%乙醇，加 热回流提取2次，每次30分钟，合并提取液后，经过200目筛网过滤并且蒸馏浓缩得到膏体， 再经冷冻干燥后粉碎即得川芎醇提物。
[0015] 实施例2 1%胎牛血清与不同浓度川芎醇提物共孵育HT29结肠癌细胞 将HT29结肠癌细胞解冻复苏后加入含有10%胎牛血清(FCS)的DMEM培养基制成细胞悬 液，分种于培养瓶中并置于5% C02,饱和湿度，37°C培养箱中培养。正常培养时约每天更换1 次培养液，等到细胞生长融合度达到70%_80%时进行传代培养;传代培养时首先弃去培养瓶 中的旧培养液，加入37 °C磷酸缓冲盐溶液（PBS)洗瓶2次，在25 cm2培养瓶中加入2mL约 0.25%的胰蛋白酶进行消化。然后在倒置显微镜下仔细随时观察，当发现细胞质回缩、细胞 间隙变大时终止消化。接下来弃去胰酶溶液，加入含15%血清的DMEM培养基，之后用吸管轻 柔吹打使贴壁细胞悬浮。紧接着将含悬浮细胞的培养液转移至10mL离心管中，1500r离心 5min，弃上清液。将细胞重新悬浮于5mL含15%胎牛血清的完全培养基中。细胞计数结束，选 择合适浓度将细胞分装到新的无菌培养瓶进行培养。接种6h后可见细胞贴壁，以后每2-3天 换液次，待细胞长滿瓶底70%-80%后再次消化传代。
[0016] 取4-6代的生长良好，融合度约为60%-70%的细胞进行细胞实验。呈亚融合状态的 细胞，轻柔吹打配成单细胞悬液并接种于96孔培养板，24孔培养板以及Tranwel 1小室铺板， 具体分组情况如下： ①对照组(共设3组）： 空白对照组:用无血清DMEM培养液孵育细胞24 h; 川芎醇提物对照组:无血清DMEM培养液中仅加入终浓度为200yg/mL的川芎醇提物孵育 细胞24 h; 低浓度血清对照组:DMEM培养液中仅加入终浓度为5%胎牛血清孵育细胞24 h。
[0017] ②处理组(共设3组）： 每组用含1 %胎牛血清的DMEM培养液培养HT29结肠癌细胞，同时加入不同终浓度（100， 200，300yg/mL)的川芎醇提物。
[0018]实施例3 5%胎牛血清时不同浓度川芎醇提物共孵育HT29结肠癌细胞 具体的细胞培养方法，以及3组对照组(空白对照组、低浓度血清对照组、川芎醇提物对 照组）的设置均同实施例2。
[0019] 处理组(共设3组）:每组用含5%胎牛血清的DMEM培养液培养HT29结肠癌细胞，同时 加入不同终浓度（100，200，300yg/mL)的川芎醇提物。
[0020] 实施例4 10%胎牛血清时不同浓度川芎醇提物共孵育HT29结肠癌细胞 具体的细胞培养方法，以及对照组（空白对照组、低浓度血清对照组、川芎醇提物对照 组)的设置均同实施例2。
[0021] 处理组:每组用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HT29结肠癌细胞，同时加入不同 终浓度（100，200，300yg/mL)的川芎醇提物。
[0022]实施例5 MTT方法检测药物组合物对HT29结肠癌细胞增殖活性的作用 MTT分析法是一种检测细胞存活和生长的常用方法，以活细胞代谢物还原剂3-(4,5_ dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide assay (MTT)噻唑蓝为基 础。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜 (formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此formazan结晶的生成量仅与活细胞 数目成正比。二甲基亚砜(DMS0)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测 定其吸光值(0D值），可间接反应活细胞数目。 实验中MTT溶液的配置方法为称取250mg MTT并放入小烧杯中，然后加入50mL PBS (0.01111〇1凡4!17.4)后使用电磁力搅拌机搅拌3〇111；[11保证其充分溶解。最后用直径为0.224111 的微孔过滤器经除菌，分装后，在4°C保存，并在两周内使用完毕。 分别取实施例2,3,4的96孔培养板药物组合物共孵育72h后的细胞，每孔加入20yL的 MTT溶液后再培养4h，离心去培养液。每孔加入150yL二甲基亚砜，震荡lOmin使之充分溶 解，在酶联免疫检测仪上选择在波长490nm处测定吸光值(A值），比色时空白孔调零，测定各 孔光吸收值(0D值），实验至少重复三次。记录结果，计算存活率。
[0023] 细胞存活率(％)=处理组平均0D值/对照组平均0D值X 100%。
[0024] 表1 1%胎牛血清时MTT法检测HT29结肠癌细胞存活率
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 表2 5%血清时MTT法检测HT29结肠癌细胞存活率
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 表3 10%血清时MTT法检测HT29结肠癌细胞存活率
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 由表1可知，1%血清浓度细胞培养72h后，100yg/mL，200yg/mL和300yg/mL川芎醇提物组 的细胞存活率分别是79.71%，40.67%，39.42%;在使用200yg/mL川芎醇提物组时，细胞的存 活率较lOOyg/mL川芎醇提物组显著降低，降至40.67%，而其后随着浓度的增加，细胞存活率 的下降趋势又趋于平缓，300yg/mL川芎醇提物组细胞存活率为39.42%，与200yg/mL处理组 无统计学差异，因此200yg/mL川芎醇提物组是抑制细胞增殖活性的较佳剂量组。由表1，表 2，表3可以观察得出lOOyg/mLj I丨芎醇提物与5%血清浓度联用时抑制细胞增殖活性最佳，其 细胞存活率为33.54%。因此200yg/mL川芎醇提物和5%血清浓度组合是最佳药物组合物。
[0025]实施例6流式细胞术检测细胞凋亡 分别取实施例2，3，4的24孔板细胞经药物作用24h后使用0.25%胰蛋白酶消化、离心， 弃掉上清液并用冷PBS洗两次，70%乙醇固定细胞24h。上机测定之前经离心去乙醇，使用PBS 洗两次，加 lOOyg/mL核糖核酸酶（RNase)消化30min(37°C)。在使用碘化丙锭(propidium 1〇虹(16，？1)5(^8/11^染色3〇1^11，并且经尼龙网过滤后，用?403了41^&1让1^型流式细胞仪 (Becton Dickinson，CA，USA)测定。实验结果经计算机软件ModFit LT3.0分析软件分析细 胞周期细胞数，每组实验至少重复3次。
[0026]表格4血清浓度为1%时川芎醇提物作用24h后HT29结肠癌细胞周期与凋亡率的变 化
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 表格5血清浓度为5%时川芎醇提物作用24h后HT29结肠癌细胞周期与凋亡率的变化
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 表格6血清浓度为10%时川芎醇提物作用24h后HT29结肠癌细胞周期与凋亡率的变化
*表示与对照组比较差异显著(P〈〇.05) 结果表明，1%血清浓度时使用100，200，300yg/mL川考醇提物作用细胞24h后，细胞周期 产生了明显的变化，尤其是200yg/mL川芎醇提物与HT29结肠癌细胞作用24h后，细胞周期中 S期的细胞显著增加，G2/M期含量为6.56%。20(^8/11^川芎醇提物处理后HT29结肠癌细胞凋 亡率为20.62%，川芎醇提物处理组浓度增加到300yg/mL后凋亡率为20.97%，上升趋势趋于 平缓，与200yg/mL川芎醇提物组无统计学差异，可见200yg/mL川芎醇提物组是川芎促使细 胞凋亡的的较佳剂量组，结果见表4。由表4，表5，表6可以观察得出200yg/mL川芎醇提物与 5%血清浓度联用时促使细胞凋亡能力最强，凋亡率为28.62%。因此200yg/mL川芎醇提物和 5%血清浓度组合是最佳药物组合物。
[0027]实施例7 Transwell侵袭实验检测川芎醇提物和血清药物组合物对细胞侵袭能力 的影响 细胞迀移实验是将Transwe 11小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称下室， 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的肿瘤细胞种在上室内，下室加入含FBS或某些特 定的趋化因子的培养液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迀 移，计数进入下室的细胞数量就能反应细胞的迀移能力。
[0028]①分别取实施例2,3,4的Transwell铺板细胞，细胞的终浓度大小约5 X105个/mL; ② 24孔板的下室内加入500 yL的含20%胎牛血清的DMEM，在Transwel 1小室内加入100 yL的细胞悬液，常规培养24 h; ③ 24 h细胞培养完成后，轻提Transwell小室，倾倒室内的培养基，用适量的PBS将细胞 洗涤2遍，使用4%的多聚甲醛固定细胞15 min，PBS再清洗3次，每次5 min，再使用0.1%的结 晶紫染色细胞30 min，用roS洗涤3次，每次5 min，使用超纯水轻轻冲洗湿润小室表面的细 胞，最后用湿润棉签轻轻擦去未迀移过膜的细胞，风机风干； ④倒置Transwell小室，显微镜进行观察和拍照。于显微镜下随机选取5个视野观察细 胞，并计数迀移细胞数。
[0029] 结果表明（见附图1，2,3)，血清浓度为5%与川芎醇提物浓度为200yg/mL的药物组 合处理组的HT29结肠癌细胞相对对照组及其它处理组的迀移能力显著降低。
[0030] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的 描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0032] 图1是1%血清时Transwell细胞迀移检测细胞迀移能力图 注：1，空白对照组;2，5%血清对照组;3，200yg/mL川芎醇提物对照组;4，100yg/mL川芎 醇提物与1%血清组合处理组;5，200yg/mL川芎醇提物与1%血清组合处理组;6，300yg/mL川 芎醇提物与1%血清组合处理组。
[0033] 图2是5%血清时Transwell细胞迀移检测细胞迀移能力图 注：1，空白对照组;2，5%血清对照组;3，200yg/mL川芎醇提物对照组;4，100yg/mL川芎 醇提物与5%血清组合处理组;5，200yg/mL川芎醇提物与5%血清组合处理组;6，300yg/mL川 芎醇提物与5%血清组合处理组。
[0034] 图3是10%血清时Transwell细胞迀移检测细胞迀移能力图 注：1，空白对照组;2，5%血清对照组;3，200yg/mL川芎醇提物对照组;4，100yg/mL川芎 醇提物与10%血清组合处理组;5，200yg/mL川芎醇提物与10%血清组合处理组;6，300yg/mL 川芎醇提物与1 〇%血清组合处理组。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其特征在于:包含川芎乙醇提取物和低浓度血清。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于:川芎乙醇提取物和低浓度血清同时 使用。3. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于:所述川芎乙醇提取物为将川芎粉碎 成粉末状后加入乙醇回流提取，冷冻干燥后粉碎所得的粉末状固体，其终浓度为200yg/mL。4. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于:所述血清为胎牛血清，其为剖腹产 的胎牛的血浆经去除纤维蛋白原形成的液体，其重量百分比为5%。5. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于:利用所述药物组合制备用于治疗肿 瘤的药物。6. 根据权利要求5所述的治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌。
【文档编号】A61P35/00GK105832795SQ201610413660
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】孔晶, 周亚楠, 单丽蓉
【申请人】淮阴工学院