牛蒡苷元在调节pp2a活性中的应用

牛蒡苷元在调节pp2a 活性中的应用
【专利摘要】本发明提供一种牛蒡苷元在制备调节PP2A活性的试剂中的应用。牛蒡苷元在制备调节PP2A活性试剂的应用中，还可以具有这样的特征：其中，牛蒡苷元的加入量为1～10μm，PP2A的活性在此范围内随着牛蒡苷元的加入量的增加而提高。ATG作为一个能高度结合PP2A且能影响其活性的天然小分子化合物，具有良好的应用前景。
【专利说明】
牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种牛蒡苷元在调节PP2A活性中的应用，属于中医药领域。
【背景技术】
[0002] 牛蒡苷元(ATG)是中药牛蒡子中的主要单体化合物。牛蒡子被临床广泛用于糖尿 病的治疗，但其作用机制和有效作用成分还不明确。本次研究发现ATG有明显的减少糖尿病 小鼠蛋白尿的作用。
[0003] PP2A是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，调节真核细胞中大部分的磷酸化酶。在信号转导 的级联反应中与其他磷酸化酶和激酶相互作用，构成调节大分子调控下游信号的转导。在 糖尿病肾脏疾病(DKD)中P65是导致炎症反应的关键通路。PP2A可以通过去磷酸化P65,来发 挥治疗DKD的作用。此外，目前有研究揭示PP2A与原癌基因 c-Myc之间有着密切的联系。PP2A 调节亚基Β56α选择性地与C-Myc的N端结合，引起c-Myc表达水平显著降低。利用shRNA解除 Β56α与c-Myc的结合，可导致c-Myc过度表达、c-Myc Ser62磷酸化水平的提高及c-Myc功能 的增强等现象，依此很容易联想到PP2A在细胞增殖分化调控中担当着某种关键的角色。ATG 与PP2A活性之间的关系在之前的研究中并未阐明。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种ATG在调节PP2A活性中的应用，是ATG的一种新应用。 [0005]本发明采用了如下技术方案：
[0006]本发明首先提供一种ATG在制备调节PP2A活性的试剂中的应用。
[0007]进一步，在ATG制备成调节PP2A活性试剂的应用中，还可以具有这样的特征:其中， ATG的加入量为1~10μπι，ΡΡ2Α的活性在此范围内随着牛蒡苷元的加入量的增加而提高。
[0008] 本发明还提供一种提高293Τ细胞中ΡΡ2Α活性的方法，其特征在于:包括加入ATG的 步骤。
[0009] 进一步，本发明的提高293Τ细胞中ΡΡ2Α活性的方法，还可以具有这样的特征：其 中，ATG的加入量是ΙμΜ~ΙΟμΜ。
[0010] 本发明还提供一种ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
[0011 ] 步骤一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激细胞。
[0012]步骤二，提取细胞并粉碎；
[0013] 步骤三，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0014] 步骤四，切下与ΡΡ2Α分子量相对应部分的凝胶条带，回收蛋白。
[0015]进一步，本发明的ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的应用，还可以具有这样的特征:其中，回 收蛋白时，将凝胶条带用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/块胶的缓冲液，在4摄氏度静 置10小时，然后5000-10000rpm离心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。
[0016]发明的有益效果
[0017] 本发明的ATG在调节PP2A活性中的应用，提供了 ATG在调节PP2A活性中的新用途， ATG作为一个能高度结合PP2A且能影响其活性的天然小分子化合物，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1是DARTS-western杂交的结果图。
[0019]图2是不同浓度的ATG刺激后的PP2A活性图。
【具体实施方式】
[0020]以下结合【具体实施方式】详细说明本发明的技术方案。
[0021] 1、ATG刺激293T的质谱分析
[0022]使用 2 9 3 T细胞，用M-PER mammalian protein extraction buffer (785〇lThermoFisher)和磷酸酶抑制剂（5〇mM NaF, ΙΟηιΜβ-glycerophosphate，5mM sodium pyrophosphate，2mM Na3V04)消化297T细胞。在细胞裂解液中加入1 OX TNC缓冲液（500mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl，100mM CaC12)并用bradford法（500-0006Bi〇-rad)测量蛋 白质浓度。在细胞裂解液中加或不加 ATG，加 ATG时尝试膻300μΜ，一起放在室温下培养lh。随 后在细胞裂解液放入不同浓度的链霉蛋白酶at 1:1000(10165921001, Roche)室温下放置 20分钟裂解蛋白质。两组裂解液行质谱检测比较差异，结果见图1。
[0023]图1:ATG干预后质谱比较结果 [0024]
[0025]
[0026] 分析质谱结果显示，结合最多的2个蛋白是微管蛋白，由于本身细胞内微管蛋白的 含量很高，所以我们认为是非特异性的。且由于正常状态下PP2A在细胞中的含量很低，所以 我们认为ATG和PP2A的结合率很高。
[0027] 2、ATG与PP2A结合的western blot实验。
[0028] ATG刺激293T细胞。选择链霉蛋白酶最佳浓度为1:1000后，我们选择了不同浓度的 ATG刺激293T细胞，来观察ATG与PP2A的结合量能否随着ATG浓度的增高而加大。根据ATG的 刺激浓度不同分为3组:01^0、10(^]\1，30(^]\1、100(^]\1。加入链霉蛋白酶的浓度为1 :1000。故 Western Blot-共分5组:空白组(未加链霉蛋白酶）、DMS0(链霉蛋白酶1:1000)、ATG100yM (链霉蛋白酶1:1000)、ATG300yM(链霉蛋白酶1:1000)、ATG1000yM(链霉蛋白酶1:1000)。结 果发现在链霉蛋白酶1:1000的条件(链霉蛋白酶可以消化蛋白，但是它消化未与ATG结合的 蛋白比消化已经与ATG结合的蛋白多。我们测试了不同浓度的链霉蛋白酶，结果发现1:1000 的浓度能够帮助我们很好的发现与ATG结合和不与ATG结合蛋白的差异，这种用来研究小分 子化合物的结合蛋白的方法叫DARTS】。可以发现随着ATG浓度的增加，PP2A结合也随之增 加，结果见图2。
[0029] 图2:DARTS-western blot证实ATG与PP2AB结合，PP2A有3个结构单元，ATG结合的 是催化剂单元。这个催化剂单元的蛋白叫PP2AB，基因叫PPP2CB。
[0030]如果需要提取PP2A蛋白，则不加链霉蛋白酶，采用如下步骤：
[0031] 步骤一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激细胞。
[0032]步骤二，提取细胞并粉碎；
[0033]步骤三，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0034]步骤四，切下与PP2A分子量相对应部分的凝胶条带，回收蛋白。回收蛋白时，将凝 胶条带用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/块胶的缓冲液，在4摄氏度静置10小时，然后 5000-10000rpm离心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。采用此种方法的蛋白回收率是70%。 [0035]步骤中的细胞可以是293T细胞，也可以是其它种类的细胞。
[0036] 3、ATG对PP2A活性的影响
[0037] 用浓度分别为0、1. Ομπι、3.3μπι、ΙΟμπι的ATG刺激293T细胞，刺激时间为1小时，利用 ΡΡ2Α活性试剂盒（R&D systems，DYC3309-2)检测ΡΡ2Α活性，结果发现随着ATG浓度增加， PP2A的活性也随之增加，结果见表1和图3。可见ATG能有效增加 PP2A的活性。随着ATG用量的 增加，PP2A的活性也随之增加。
[0038] 表1:PP2A活性值
[0039]
[0040] 注:P值是与DMS0比较。
【主权项】
1. 牛蒡苷元在制备调节PP2A活性的试剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于： 其中，所述牛蒡苷元的加入量为1~l〇wn，PP2A的活性在此范围内随着牛蒡苷元的加入 量的增加而提高。3. -种提高293T细胞中PP2A活性的方法，其特征在于： 包括加入牛蒡苷元的步骤。4. 如权利要求3所述的提高293T细胞中PP2A活性的方法，其特征在于： 其中，所述牛蒡苷元的加入量是ΙμΜ~ΙΟμΜ。5. 牛蒡苷元在回收ΡΡ2Α蛋白中的应用，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，加入1〇〇μΜ~ΙΟΟΟμΜ的牛蒡苷元刺激细胞。 步骤二，提取细胞并粉碎； 步骤三，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 步骤四，切下与ΡΡ2Α分子量相对应部分的凝胶条带，回收蛋白。6. 如权利要求5中的牛蒡苷元在回收ΡΡ2Α蛋白中的应用，其特征在于： 其中，回收蛋白时，将凝胶条带用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/块胶的缓冲液， 在4摄氏度静置10小时，然后5000-10000rpm离心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。
【文档编号】A61K31/365GK105832719SQ201610278529
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】钟逸斐
【申请人】上海中医药大学附属龙华医院