将胸膜液分类的方法
【专利说明】将胸膜液分类的方法
[0001] 相关申请的交叉参考 本申请要求2013年7月18日递交的美国临时申请第61/847610号的权益。2013年7月18 日递交的申请第61/847610号通过引用而全部结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明通常涉及把胸膜液样品分类为漏出液或渗出液的方法以及这些方法辅助 疾病诊断的用途。
[0003] 发明背景 胸膜液(PF)为用作重要的生理润滑剂和机械屏障的胸膜腔的薄液层。PF的体积和流动 受到严格调节。在疾病状态下，PF流动的动力学受到损害，导致PF异常积聚。这种病症称为 胸腔积液。
[0004] 在临床实践中，调查胸腔积液病因的第一步一般地是把PF分类为渗出性的（高蛋 白）或漏出性的（低蛋白）。这种分类用于缩小根本原因的鉴别诊断（即病因学）。例如，渗出 性胸腔积液的原因包括肺癌(原发性或继发性）、感染(肺结核、非结核性肺炎或积脓症)和 自身免疫性疾病，而漏出性胸腔积液的原因包括充血性心力衰竭、慢性肾病和肝硬化。
[0005] PF可根据Light标准（Light，et al ·，Ann Intern Med ·，77(4) : 507-513 (1972))分类为渗出液和漏出液。简单地说，Light等实施了一项前瞻性研究，包括150个胸 膜液样品(47个漏出液和103个渗出液），并且得出结论，存在以下特征中的任何一种高度提 示为渗出性胸腔积液：（1)胸膜液蛋白与血清蛋白的比率大于〇.5;(2)胸膜液LDH大于200 IU;或者(3)胸膜液LDH与血清LDH的比率大于0.6。这套标准已经临床应用多于40年。
[0006] 然而，Porcel自2115名受试者总结出Light标准的诊断准确性，并且报道称灵敏度 在96.7%-98· 2%的范围内和特异性在69.4-77.7%的范围（Porcel，Respirology, 16(1): 44-52 (2011))。其它的前瞻性研究报道了65-86%的甚至更低的诊断特异性。Light标准的 非特异性会造成PF的错误分类。例如，漏出性PF可能会误诊为渗出性PF，导致受试者不必要 的检测和治疗。在一项包括249名患者的研究中，漏出液基于临场表现的分类可能产生42-44%的误分类率（Romero-Candeira, et al·，Chest, 122(5):1524-9 (2002))〇
[0007] 为了提高PF分类的诊断准确性，在PF的实验室评价中考虑其它生化标志物/方法。 其中例如，白蛋白梯度、NT-pro_BNP、BNP (Valdes, et al·，Arch Bronconeumol, 47(5): 246-51 (2011)、C-反应蛋白（CRP) (Porcel, et al·，Eur. J. Intern. Med.，23(5): 447-50 (2012))、细胞计数(红细胞和白细胞两者）、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨酶(ADA)活 性（Chen, et al, Clin. Chim. Acta., 341(1_2):101_7 (2004)、淀粉酶、胆固醇（Vaz, et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 7(4):183-6 (2001); Valdes, et al., Transl. Res·, 155(4):178-84))、甘油三酯（Valdes, et al, Lung, 188(6):483-9 (2010))、无细 胞DNA (Chan, et al·, Clin Chem. , 49(5):740_5 (2003))、蛋白区带电泳（Chen and Lam, Clin Chem., 45(10): 1882-5 (1999))。然而，这些检测没有一个可以实现灵敏度和 特异性两者大于90%。目前，没有单一的标志物具有令人满意的灵敏度和特异性两者。大多 数标志物在牺牲其特异性的情况下具有高的灵敏度，反之亦然。
[0008] 因此，本发明的一个目的是提供具有高的灵敏度和特异性两者的把胸膜液分类为 漏出液或渗出液的方法。
[0009] 本发明的另一个目的是提供诊断和治疗的方法，该方法包括具有高的灵敏度和特 异性两者的把胸膜液分类为漏出液或渗出液。
[0010] 发明概述 公开了将胸膜液分类的方法。这些方法一般地包括测定受试者胸膜液中的指示剂纳米 粒子，特别是造影剂或脂质的水平。例如，所述方法可包括测定受试者胸膜液中的脂质，特 别是大型脂质的水平。
[0011] 与对照相比较具有较高水平的大型粒子脂质的胸膜液一般地确定为渗出液;而， 与对照相比较具有较低水平的大型粒子脂质的胸膜液一般地确定为漏出液。对照可为通过 将已知渗出液和漏出液的大型粒子脂质的水平求平均值确定的平均阈值。阈值可采用与用 于测定胸膜液的大型脂质水平相同的测定大型脂质水平的方法进行测定。类似地，与对照 相比较具有较高水平的指示剂纳米粒子的胸膜液一般地确定为渗出液;而，与对照相比较 具有较低水平的指示剂纳米粒子的胸膜液一般地确定为漏出液。
[0012] 胸膜液中的指示剂纳米粒子比如造影剂和大型脂质的水平可与表明渗出液或漏 出液的标准值进行比较。例如，如果胸膜液中大型粒子脂质的水平在相应于渗出液的标准 值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为渗出液。如果胸膜液中大型粒 子脂质的水平在相应于漏出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定 胸膜液为漏出液。相应于渗出液的标准值可为两种或更多种已知渗出液的大型粒子脂质水 平的平均值，和相应于漏出液的标准值可为两种或更多种已知漏出液的大型粒子脂质水平 的平均值。类似地，如果胸膜液中指示剂纳米粒子的水平在相应于渗出液的标准值的5%、 10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为渗出液。如果胸膜液中指示剂纳米粒 子的水平在相应于漏出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜 液为漏出液。
[0013] 对照或标准值可采用与用于测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质水平相 同的测定指示剂纳米粒子比如造影剂和大型脂质水平的方法进行测定。在优选的实施方案 中，指示剂纳米粒子比如脂质的水平通过核磁共振(NMR)，比如质子匪R (1H-NMR)测定。在 一些实施方案中，所述方法包括通过测量相应于一个或多个选自以下的脂质信号的NMR信 号测定大型粒子脂质的水平：甲基质子(-CH 3)、亚甲基质子（（-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH= CH-)。例如，脂质甲基质子(-CH3)对应于匪R光谱上0.84 ppm ± 0.15的信号，脂质亚甲基 质子（（-CH2-)n)对应于NMR光谱上1.26 ppm ± 0.15的信号，和脂质甲叉基质子(-CH=CH-) 对应于NMR光谱上5.29 ppm ± 0.15的信号。在其它优选的实施方案中，指示剂纳米粒子比 如脂质的水平通过计算机断层扫描(CT)测定。对于CT方法，采用造影剂作为指示剂纳米粒 子为优选的。
[0014] 某些方法包括另外的包括但不限于根据Light标准分析的测定，或者测量：白蛋白 梯度、NT-pro-BNP、BNP、C-反应蛋白（CRP)、胸膜液的细胞计数、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨 酶(ADA)活性、淀粉酶、胆固醇、甘油三酯、无细胞DNA、蛋白区带电泳、或其任何组合。另外的 测定或分析为除了大型脂质的测量以外。
[0015] 在一个实施方案中，对得自受试者的胸膜液样品体外实施测定胸膜液中指示剂纳 米粒子比如大型脂质的水平。在其它的实施方案中，采用磁共振波谱学(MRS)体内实施测定 胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质的水平。在还其它的实施方案中，采用计算机断层 扫描(CT)体内实施测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质的水平。胸膜液可分类为渗 出液或漏出液，灵敏度为85%、90%、95%、99%或者更高，选择性为85%、90%、95%、99%或者更高， 或其组合。
[0016] 所公开的方法可与诊断受试者患有疾病、障碍或病症的方法相结合。例如，如果胸 膜液确定为漏出液，那么受试者可诊断为心力衰竭、肝硬化或肾病。如果胸膜液确定为渗出 液，那么受试者可诊断为肺炎、恶性肿瘤或血栓栓塞。
[0017] 所公开的方法任选地包括一种或多种另外的诊断方法。另外的诊断方法包括但不 限于胸膜液的细胞计数;差别葡萄糖(differential glucose)或腺苷脱氨酶(ADA)分析;胸 膜液的细胞学分析、细菌培养、PH测量、或其组合，或者支气管镜检、用于组织学检查的胸膜 闭式穿刺活检、胸腔镜检查、螺旋CT、正电子发射断层扫描(PET)、或其任何组合。所述方法 任选地包括治疗存在胸膜液或者所诊断的疾病或障碍的受试者。
[0018] 附图简述 图1为采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)成像顺序得到的胸膜液渗出液和漏出 液的代表性600 MHz 1H-核磁共振(1H-NMR)光谱的覆盖图（overlay)。
[0019] 图2A和2B为胸膜液渗出液和漏出液的NMR光谱的主要成分分析（PCA)的得分图 (2A)和负荷图（2B)。
[0020] 图3A和3B为胸膜液渗出液和漏出液的匪R光谱的潜在结构投影的判别分析(PLS-DA)的得分图（3A)和负荷图（3B)。
[0021] 图4A和4B为脂质1、2、3、脂质平均、乳酸酯和葡萄糖（4A)或者仅有脂质1和脂质2 (4B)的接受者操作特征(ROC)曲线下面积，用于自胸腔积液的漏出性NMR光谱分辨渗出性。
[0022] 图5为脂质1和脂质2 NMR光谱信号的框-须图（Box-whisker plot)，用于自胸腔积 液的漏出性NMR光谱分辨渗出性。
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