一种叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明是一种功能化金纳米颗粒的制备方法，特别是一种叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，属于化学合成技术领域。
【背景技术】
[0002]金纳米颗粒是一种具有强吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性的纳米材料。单分散金纳米颗粒在溶液中呈现红色，当金纳米颗粒表明进行修饰或者聚集时，会引起颗粒间的等离子体耦合发生改变，导致其特征吸收峰发生位移或者吸收峰值下降。由于金纳米颗粒特殊的光学特性，且金纳米颗粒表面比较容易进行基团修饰(如自组装巯基、羧基等)，常将金纳米颗粒表面进行修饰，构建基于修饰金纳米颗粒的光学检测体系进行实际的分析检测应用。通过将金纳米颗粒表面修饰靶标物质特异性识别的物质，即可实现不同靶标物质，如小分子、重金属离子、蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病原体等的特异性检测。
[0003]癌症是危害人类健康的重大疾病之一，在2004年癌症导致死亡的人数已达到740万人，预计至2030年，全世界因癌症死亡的人数预估将达到1200万人。癌症之所以难以治愈，主要原因在于发病初期检测难度较大，而当癌症发展到后期被发现再进行治疗时已经很难治愈。因此，癌症的早期检测已成为拯救癌症患者的关键因素之一。近年来，研究发现，一种在正常组织中低表达或不表达的细胞表面受体叶酸受体(FR)，在癌症早期多种癌症细胞表面呈现表达上调。叶酸(FA)，一种水溶性维生素，广泛的存在于新鲜的水果、蔬菜、肉类食品中，参与机体组织的生长，是FR的天然配体与叶酸受体之间有高的亲和力。因此，通过制备叶酸修饰的金纳米颗粒，利用肿瘤细胞表面过表达的FR，即可实现早期癌症的诊断及治疗。
[0004]目前，叶酸修饰的金纳米颗粒的合成方法主要有2种。一种是以叶酸为还原剂与氯金酸在合适的条件下发生氧化还原反应，直接制备叶酸功能化的金纳米颗，另一种，是通过媒介分子，引入合适的基团，一步步的将叶酸分子缩合至金纳米颗粒表面。这两种方法在实际的应用中都有各自的缺点。第一种方式，是直接制备法，即叶酸修饰的金纳米颗粒的形成过程伴随着金纳米颗粒的合成。他对制备纳米颗粒的条件要求比较严苛，比如对反应器皿的洁净度要求高，反应的条件需要高温加热等；而第二种方式，是间接制备法，叶酸修饰的金纳米颗粒的形成是在金纳米颗粒的合成之后再加以修饰合成的。这种方法需要一步步的缩合，每步缩合反应的条件以及缩合效率，都会使得整个过程较为复杂。因此，建立一种简单的叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明基于金纳米颗粒的独特性能，利用配体交换原理，提出来一种简单的叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，制备的叶酸修饰的金纳米颗粒可用于FR过表达的癌细胞的识别。
[0006]本发明的技术方案:一种叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，首先制备金纳米颗粒；将叶酸与金纳米颗粒以一定比例混合，调整该混合液的pH值，基于配体交换使得叶酸修饰于金纳米颗粒表面；离心去除未与金纳米颗粒结合的叶酸分子，即可得到叶酸修饰的金纳米颗粒。
[0007]本发明包括以下步骤:金纳米颗粒的制备；叶酸修饰的金纳米颗粒的制备；
[0008](1)金纳米颗粒的制备
[0009]制备过程中所需的玻璃器皿都必须在新鲜配制的王水(HN03: HC1 = 3: 1)中浸泡30分钟后，用大量的双蒸水冲洗并在烘烤箱中烘干备用。制备过程中所需的原料，氯金酸和柠檬酸钠在使用之前均需要用0.22mm微米过滤器过滤。具体的纳米颗粒制备过程如下:配置100mL 0.01%的氯金酸，加入三颈瓶中，搅拌边加热至沸腾。待其煮沸后剧烈搅拌下迅速加入3.5mL 1%的柠檬酸钠，继续加热搅拌15分钟后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30分钟，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后，将制备好的金纳米颗粒存放于棕色试剂瓶中并放置在4°C冰箱保存。所得金纳米颗粒的直径为13nm，浓度3.5nM。
[0010](2)叶酸修饰的金纳米颗粒的制备
[0011]取上述步骤(1)中制备的金纳米颗粒溶液5mL与5mL含10 4M(20mM PBS)的叶酸溶液的混合后，用盐酸或氢氧化钠调节溶液pH值至6.2，室温(25°C)下搅拌孵育12小时，12000rpm离心20分钟，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS溶液(Ph 6.2)溶解洗涤沉淀，重复三次，去除多余的叶酸分子，再将其溶解于10mM PBS缓冲液(pH7.4)中备用。
【附图说明】
[0012]图1为金纳米颗粒以及叶酸修饰的金纳米颗粒的紫外表征图
[0013]图2为金纳米颗粒以及叶酸修饰的金纳米颗粒的透射电镜图
[0014]图3为金纳米颗粒以及叶酸修饰的金纳米颗粒的Zeta电位图
[0015]图4为叶酸修饰的金纳米颗粒靶向肿瘤细胞的紫外表征图
【具体实施方式】
[0016]实施例1.金纳米颗粒的制备
[0017]配置lOOmL 0.01 %的氯金酸，加入三颈瓶中，搅拌边加热至沸腾。待其煮沸后剧烈搅拌下迅速加入3.5mL 1%的柠檬酸钠，继续加热搅拌15分钟后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30分钟，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后，12000rpm离心20分钟后，溶解于10mM PBS缓冲液(pH7.4)，测定紫外-可见光谱、透射电镜图谱以及Zeta电位分布。如图1中A所示，制备的金纳米颗粒大约在520nm处出现特征可见吸收峰，证实金纳米颗粒制备成功。
[0018]实施例2.叶酸修饰的金纳米颗粒的制备
[0019]取5mL金纳米颗粒溶液与5mL含10 4M(20mM PBS)的叶酸溶液的混后，用盐酸或氢氧化钠调节溶液pH值至6.2，室温(25°C )PBS下搅拌孵育12小时后，12000rpm离心20分钟，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS缓冲液(pH6.2)溶解洗涤沉淀，重复三次，最终溶解于10mM PBS缓冲液(pH7.4)，测定紫外-可见光谱、透射电镜图谱以及Zeta电位分布。如图1中B所示，制备的叶酸修饰的金纳米颗粒的特征吸收峰出现位移，证实了金纳米颗粒表面叶酸的成功修饰。对比金纳米颗粒的透射电镜图(图2A)，叶酸修饰金纳米颗粒的透射电子显微镜图(图2B)，颗粒与颗粒间的排斥力变大(颗粒之间间隙变大)，因此更为稳定。同样的，对比修饰叶酸分子前后的Zeta电位分布图，发现叶酸分子修饰的金纳米颗粒表面的电荷负电性更高，也同样证实了叶酸分子的成功修饰。
[0020]实施例3.叶酸修饰的金纳米颗粒的细胞靶向
[0021]在37°C，5% C02的条件下用1640培养基(含10%的胎牛血清)培养细胞系A549 (细胞表面不表达FR)以及KB (细胞表面FR高表达)。用磷酸缓冲液冲洗细胞后，用
0.25%胰酶处理细胞5分钟，之后lOOOrpm离心5分钟，用磷酸缓冲液悬浮细胞，配置成105个细胞/mL的细胞悬浮液，放置于冰上备用。将A549及KB细胞悬浮液分别和叶酸修饰的金纳米颗粒等体积的混匀，放置于冰上30分钟后，测紫外-可见吸收光谱。如图4所示，当叶酸修饰的金纳米颗粒与细胞高表的KB细胞共孵育时，叶酸修饰的金纳米颗粒与KB细胞(曲线A)表面高表达的叶酸受体结合，使得其特征的紫外可见吸收峰发生明显下降。
【主权项】
1.一种叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法，其特征在于基于金纳米颗粒，利用配体交换原理，通过控制溶液pH值，建立了一种简单的叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法，该叶酸修饰的金纳米颗粒可用紫外-可见光谱表征区分FR过表达的癌细胞。方法包括以下步骤:首先用经典的柠檬酸钠还原法制备直径13nm的金纳米颗粒；将叶酸与金纳米颗粒以一定比例混合，调整该混合液的pH值，基于配体交换使得叶酸修饰于金纳米颗粒表面；离心去除未与金纳米颗粒结合的游离叶酸分子，即可得到叶酸修饰的金纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法，其步骤如下 采用经典的柠檬酸钠还原法制备直径13nm的金纳米颗粒；取金纳米颗粒溶液5mL与5mL含10 4M的叶酸溶液(20mM PBS缓冲液溶解)的混合后，用盐酸或氢氧化钠调节溶液pH值至6.2，室温(25°C )下搅拌孵育12小时，使得叶酸充分修饰；12000rpm离心20分钟，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS溶液(Ph 6.2)溶解洗涤沉淀，重复三次，彻底去除未结合游离叶酸；再将其溶解于10mM PBS缓冲液(pH7.4)中储存备用。
【专利摘要】一种叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法，属于化学合成领域。本发明通过经典的柠檬酸钠还原法制备直径13nm的金纳米颗粒，基于配体交换原理，通过控制溶液pH值，建立了一种简单的叶酸修饰金纳米颗粒的制备方法，该叶酸修饰的金纳米颗粒可用紫外-可见光谱表征叶酸受体过表达的癌细胞。
【IPC分类】A61K47/22, A61K49/00, A61P35/00
【公开号】CN105396146
【申请号】CN201510788476
【发明人】许媛媛, 张源淑, 张瑜娟
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月13日