DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]基因导入系统在基因功能研究和基因治疗中有重要应用。目前使用的基因导入系统主要包括两大类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关载体，可高效地将治疗基因传递到细胞内，但其规模生产难度大，可递送的基因容量小，易引起免疫反应，有潜在的生物安全风险。非病毒基因载体包括脂质体、阳离子纳米粒、无机纳米粒子载体等，具有免疫原性低，安全性较好，易大规模生产等特点，是当前基因导入系统研究的热点。
[0003]甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxypoly (ethylene glycol)-poly (lactide)，简称mPEG-PLA)双嵌段聚合物是一种可降解、生物相容性好的两亲性聚合物，在生物医学领域有重要的应用。在20世纪90年代，含有PEG或PLA传输载体装载的药物已获得了美国FDA的批准应用于临床。mPEG-PLA共聚物含有亲水嵌段PEG和疏水嵌段PLA，可在水溶液中自组装成纳米颗粒，在药物、基因导入系统中有很好的应用前景。目前，mPEG-PLA双嵌段聚合物纳米粒载体包裹的紫杉醇制剂已在韩国和欧洲应用于乳腺癌的临床治疗，在美国也已进入II期临床试验。在将PEG-PLA纳米粒用于基因导入系统时，单纯采用mPEG-PLA纳米粒装载基因的难度大，且转染效率低。进一步对mPEG-PLA纳米粒进行物理或化学修饰，可制备出具有易装载基因、转染效率高、毒性低、可降解的新型纳米粒，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明所解决的技术问题是提供一种新的修饰手段用以修饰mPEG-PLA双嵌段共聚物，发明人采用D0TAP修饰两亲性mPEG-PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备得到新型的可降解性基因载体，即DOTAP-mPEG-PLA阳离子纳米粒，可简称为DPP纳米粒。本发明DPP纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。
[0005]本发明中所采用的两亲性阳离子物质D0TAP，化学命名为(2，3_二油氧基丙基)三甲基氯化铵，简称D0TAP。
[0006]本发明中所采用的两亲性mPEG-PLA共聚物，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，简称mPEG-PLA。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸纳米颗粒具有两亲性、良好的生物可降解性和生物相容性、避免了吞噬细胞吞■、增加了药物在血液中的循环时间和生物利用度，持续释放和靶向传递从而增加了药效、减小了副作用。mPEG-PLA纳米粒不仅可以作为化学药物、蛋白质和疫苗等的载体，同时也可以作为基因药物的载体。
[0007]本发明利用自组装的方法制备DOTAP-mPEG-PLA纳米粒，按照下述配比关系取原料、溶剂进行制备:
[0008]原料:mPEG-PLA共聚物与D0TAP的质量比为:mPEG_PLA共聚物70-99份、D0TAP1-30 份；
[0009]溶剂:二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷等易挥发的溶剂中的至少一种；
[0010]水化溶液:双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水；
[0011]制备方法:mPEG-PLA共聚物、D0TAP分别溶于溶剂中，然后将溶剂蒸发，加适量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即为DPP纳米粒溶液。
[0012]将所述透明液体干燥即得DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。
[0013]进一步优选的，本发明DPP纳米粒，按照下述配比关系取原料进行制备:
[0014]原料:mPEG-PLA共聚物与D0TAP的质量比为:mPEG_PLA共聚物85-95份、D0TAP5-15 份。
[0015]上述技术方案中，溶剂用量以能够溶解原料即可。
[0016]本发明DOTAP-mPEG-PLA纳米粒的平均粒径为73±6nm，平均电位为+46±2mV，具备良好的DNA结合能力。与金标转染材料PEI 25K相比，本发明DPP纳米粒具有更高的转染能力和较低的细胞毒性。
[0017]本发明DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可用于负载活性成分，尤其是基因、化学药物、蛋白质和疫苗，得到DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物。
[0018]DOTAP-mPEG-PLA纳米粒属生物可降解性阳离子纳米粒，是一种新型基因导入系统非病毒载体。该纳米粒能通过静电相互作用结合DNA，可以有效地将目的基因或化学药物、蛋白质和疫苗等活性成分导入肿瘤细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征。
[0019]如，可以采用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递水泡口炎病毒基质蛋白(VSVMP)基因质粒，即采用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载VSVMP得到VSVMP/DPP复合物。
[0020]本发明VSVMP/DPP复合物，包括下述配比关系的原料及辅料:
[0021 ]原料:DOTAP-mPEG-PLA 纳米粒与 VSVMP 质量比为:DOTAP-mPEG-PLA 纳米粒 1_99份，VSVMP 1 份；
[0022]渗透压调节剂适量，用量以配制所得VSVMP/DPP复合物达到生理渗透压即可；
[0023]溶剂:注射用水、双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水；
[0024]制备方法如下:
[0025]将上述原料及溶剂按照渗透压调节剂、溶剂、DOTAP-mPEG-PLA纳米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP复合物溶液，所得溶液达到生理渗透压。
[0026]进一步优化，本发明VSVMP/DPP复合物按照下述配比关系取原料进行制备:
[0027]所述VSVMP/DPP复合物，包括下述配比关系的原料及辅料:原料:DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP质量比为DOTAP-mPEG-PLA纳米粒90-99份，VSVMP 1-10份。
[0028]发明人发现利用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递VSVMP基因质粒可应用于体外和体内治疗卵巢癌:
[0029]在体外，发明人用MTT法检测VSVMP/DPP复合物对SK0V3卵巢癌细胞生长的抑制作用，并用流式细胞术检测VSVMP/DPP复合物诱导细胞凋亡情况。发明人发现利用DPP纳米粒介导VSVMP基因质粒进入SK0V3卵巢癌细胞中，DPP/VSVMP复合物通过诱导凋亡可以明显抑制SK0V3细胞的生长。
[0030]在体内，发明人建立人卵巢癌裸鼠腹腔种植瘤模型，比较各组裸鼠腹腔肿瘤结节的重量和数目，以及腹水产生的差异。发明人发现DPP/VSVMP复合物可以显著地减少小鼠肿瘤的负荷和腹水的产生。体外体内治疗数据表明，DPP纳米粒传递VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制人卵巢癌肿瘤细胞SK0V3的生长。
[0031]本发明通过自组装法制备出了一种新型的可降解阳离子纳米粒:DOTAP-mPEG-PLA,该纳米粒可通过静电相互作用结合DNA，可有效地将基因导入到肿瘤细胞中，具有基因转染率高、细胞毒性低等特点，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可介导基因等活性成分发挥疗效，如DOTAP-mPEG-PLA纳米粒介导VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制人卵巢癌细胞的生长。DPP纳米粒是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得VSVMP/DPP复合物为治疗卵巢癌提供了一种新的思路和潜在的选择。
【附图说明】
[0032]图1 (A) mPEG-PLA的分子结构式；(B) D0TAP的分子结构式。
[0033]图2 DPP纳米粒的结构示意图。
[0034]图3 DPP纳米粒的粒径及电位分布图:(A) DPP纳米粒的粒径分布图；(B) DPP纳米粒的电位分布图。
[0035]图4 DPP纳米粒