具有外显子跳跃效应的双链反义核酸的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种双链核酸，所述双链核酸具有改变编码RNA或非编码RNA的功能 的活性，且更具体地，涉及借助于反义效应和通过外显子跳跃（exon-skipping)带来的效 应等抑制靶基因表达的效应。所述双链核酸包含充当与细胞中的RNA互补的反义寡核苷酸 的一条链。这样的RNA可以是编码或非编码区域的一部分，或可以是外显子或内含子的一 部分。
【背景技术】
[0002] 近年来，寡核苷酸已经是正在进行的被称为核酸药物的药物产品的开发中感兴趣 的主题，且具体地，从靶基因的高选择性和低毒性的视角来看，利用反义方法的核酸药物的 开发在积极进行中。反义方法是一种通过将与靶基因的mRNA(有义链）部分序列互补的寡 核苷酸（反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，AS0))引入细胞中选择性改变由革巴 基因编码的蛋白的表达的方法。
[0003] 如图1 (上部）所示，当包含RNA的寡核苷酸作为AS0被引入细胞时，该AS0与靶 基因的转录产物（mRNA)结合，并且形成局部双链。已知此双链作为掩蔽物起作用以防止通 过核糖体的翻译，并且因此抑制了靶基因编码的蛋白质的表达。
[0004] 另一方面，当包含DNA的寡核苷酸作为AS0被引入细胞时，形成了局部DNA-RNA异 源双链体。因为RNA酶Η识别该结构，并且因此靶基因的mRNA被分解，抑制了靶基因编码 的蛋白质的表达。（图1，下部）。此外，还发现在许多情况下，与使用RNA的情况相比，使用 DNA作为AS0的情况下（RNA酶Η依赖途径）的基因表达抑制效应更高。
[0005] 在利用寡核苷酸作为核酸药物时，考虑到增强与靶RNA的结合亲和力、体内稳定 性等，已经开发了多种核酸类似物诸如锁核酸（LNA)(注册商标），其他桥接核酸等等。
[0006] 可以在前体mRNA加工期间应用反义寡核苷酸以引起外显子跳跃。在图2中阐述 了这个概念。该图示出了双链DNA区段，且该DNA的转录产生由外显子（编码区域）和内 含子（非编码区域）组成的前体mRNA。通常，在mRNA被翻译成肽（蛋白质）序列之前，细 胞加工前体mRNA以除去内含子区域。已知靶向并结合至前体mRNA的反义寡核苷酸能够诱 导细胞不包含（跳跃）外显子。如图2所示，前体mRNA包含外显子1、2、3和4。在正常操 作下，没有AS0存在，内含子将被除去且外显子1、2、3、和4将剪接在一起以产生全长mRNA。
[0007] 但是，在与靶位点结合的AS0的存在下，如此处以外显子2为例说明的，细 胞除了除去内含子还会除去外显子2,以产生外显子1、3、和4的截短的剪接-转换 (splice-switched)的mRNA。
[0008] 如本领域所公知的，外显子跳跃和剪接转换是用于治疗或改善基因突变效应所感 兴趣的。认为某些遗传疾病通过这类机制在基因水平上而非蛋白水平是可治疗的。两个实 例是杜氏肌营养不良和脊髓性肌营养不良（非专利文件1-4)。
[0009]siRNA和gapmer反义寡核苷酸起抑制基因表达的作用，而剪接-转换寡核苷酸 (splice-switchingoligonucleotide，SS0)则起修饰前体mRNA剪接的作用。这些寡核苷 酸能够"修复"原本不会被正确加工的RNA，或者，它们能够诱导形成新的蛋白质。因为剪接 变体蛋白质构成人类中蛋白质的很大一部分，诱导和/或调节剪接-转换的能力是非常令 人感兴趣的主题。
[0010] 为了增强与靶序列的结合亲和力，用作反义物质的寡核苷酸通常含有修饰的核苷 酸或核苷酸类似物。如图3所示，由于天然核酸（RNA或DNA)的糖部分具有四个碳原子和 一个氧原子的五元环，糖部分具有两种构象，N型和S型。已知这些构象从一个改变为另一 个，且因此，核酸的螺旋结构也采取了不同构象，A-型和B-型。因为充当上述AS0的靶的 mRNA采取了A-型螺旋结构，其具有主要为N-型的糖部分，从增加与RNA的亲和力的角度而 言，AS0的糖部分采取N-型是重要的。已经在该观念下开发出的产品是修饰的核酸，诸如 LNA(2' -0, 4' -C-亚甲基-桥接核酸（2'，4' -BNA))。例如，在LNA中，因为2'位置上的氧与 4'位置上的碳通过亚甲基桥接，构象被固定为N-型，且构象之间不再存在波动。因此，与以 常规天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过掺入若干单位的LNA合成的寡核苷酸具有对RNA 的很高亲和力和很高的序列特异性，并且还展示出优异的热耐受性和核酸酶耐受性（参见 专利文件1)。因为其他人工核酸也有如此特性，与反义方法等的利用相关的人工核酸得到 了很多关注（参见专利文件1至7)。
[0011] 此外，当寡核苷酸被应用于药物时，能够以高特异性和高效率将相关寡核苷酸递 送到革E位点是重要的。当细胞穿透肽（cell-penetratingpeptide)，诸如短的、带正电荷的 富含精氨酸的肽P007和B肽缀合至寡核苷酸时，能够提高寡核苷酸摄入到细胞中（非专利 文件5)。即使寡核苷酸进入了细胞，为了令其具有剪接-转换效应，寡核苷酸需要进入细胞 核。递送剪接-转换的寡核苷酸跨越核膜仍是个挑战（非专利文件6)。本发明的目的是提 供双链核酸物质，所述双链核酸物质提供了反义寡核苷酸进入细胞核内的增强的递送。本 发明的另外的目的是提供寡核苷酸，所述寡核苷酸提供增强水平的外显子跳跃和/或前体 mRNA的可变剪接的加工。
[0012] 此外，作为用于将寡核苷酸递送至某些身体区域的方法，已经开发了一种利用脂 质，诸如胆固醇和维生素E的方法（非专利文件7和8)，一种利用受体-特异性肽诸如 RVG-9R的方法（非专利文件9)，和一种利用靶位点特异性的抗体的方法（非专利文件10)。
[0013] 引用文献列表
[0014] 专利文件
[0015] {PTL 1}JP 10-304889 A
[0016] {PTL 2}WO 2005/021570
[0017] {PTL 3} JP 10-195098 A
[0018] {PTL 4}JP 2002-521310 ff
[0019] {PTL 5}W0 2007/143315
[0020] {PTL 6}WO 2008/043753
[0021] {PTL 7}WO 2008/029619
[0022] 非专利文件
[0023] {NPL 1}非专利文件l:Ryszard Kole等人，Nature Reviews, Vol. 11, 125-140(2012)
[0024]{NPL 2}Nathalie M. Goemans等人,N e w England J.Med. ,Vol. 364, 1513-1522(2011)
[0025] {NPL 3}RebeccaJ.Fairclough等人，Nature Rev. Genetics, doi:10.1038/ nrg3460, 2013年4月23日，6页·
[0026] {NPL 4} Sebahattin Cirak等人，Lancet, Vol. 378, 595-605 (2011)
[0027]{NPL5}HaiFangYin等人,HumanMolecularGenetics,V ol. 17(24), 3909-3918(2008)
[0028]{NPL 6} Pedro M. D. Moreno等人，Nucleic Acids Res.，Vol.37, 1925-1935 (2009)
[0029] {NPL 7} Kazutaka Nishina等人，Molecular Therapy, Vol. 16, 734-740 (2008)
[0030]{NPL8}JurgenSoutscheck等人，Nature,Vol. 432, 173-178 (2004)
[0031] {NPL 9} Kazutaka Nishina等人，Molecular Therapy, Vol. 16, 734-740 (2008)
[0032] {NPL 10} Dan Peer等人，Science, Vol. 319, 627-630 (2008)
[0033] 发明概述
[0034] 技术问题
[0035] 本发明的目的是提供能够改变编码RNA或非编码RNA的功能的双链核酸物质。 [0036]问题解决方案
[0037] 在某些实施方案中，双链核酸复合体包含引起RNA的剪接-转换变体的反义核酸。 在一些实施方案中，反义核酸改变编码RNA或非编码RNA的功能。在一些实施方案中，反义 核酸调节RNA的加工。在一些实施方案中，双链核酸复合体以高特异性和高效率将反义核 酸链递送至靶区域。在一些实施方案中，以高效率将反义核酸递送至细胞核内。
[0038] 本发明人研究了寡核苷酸物质至细胞核的递送，并且发现双链反义寡核苷酸而非 单链寡核苷酸可具有从胞液到细胞核内的细胞内转移机制。图4中显示了比较双链物质对 比单链物质的基因沉默效应的实验的结果。在下面的实施例1中详细描述了该实验。简 言之，制备了革G向ΑροΒ前体mRNA的内含子的LNA/DNAgapmer反义寡核苷酸。还制备了 互补的2'-〇MeRNA/RNAgapmer，并退火至LNA/DNAgapmer以产生双链核酸物质。使用 LipofectamineRNAiMAX用双链核酸物质（dsASO)或单链LNA/DNAgapmer(ssASO)转染人 细胞。测量表达的ΑροΒ的量，针对表达的GAPDH的量标准化。出人意料地，dsASO物质抑 制了表达的ΑροΒ的量，而单链物质对表达水平几乎没有影响（图4)。虽然RNAiMAX能够将 寡核苷酸运输至细胞中，其对于将寡核苷酸携带到细胞核中是无效的。因此，观察到的双链 物质和单链物质之间的对于抑制ΑροΒ表达的差异被认为是由于dsASO的更强的跨越核膜 的能力。
[0039] 因此，本发明人设想了使用双链核酸物质将反义寡核苷酸递送至细胞核以提高 AS0的（治疗）功效。
[0040] 某些实施方案涉及具有通过反义效应调节RNA加工的活性的双链核酸。在某些实 施方案中，提供了以下内容。
[0041] (1) 一种用于改变编码RNA或非编码RNA的功能的方法，所述方法包括使双链核酸 复合体与细胞接触，所述双链核酸复合体包含：
[0042] 退火至第二核酸链的第一核酸链，其中：
[0043]所述第一核酸链包括（i)独立地选自天然DNA核苷酸、修饰的DNA核苷酸和核苷 酸类似物的核苷酸，（ii)没有具有4个或更多个连续的天然DNA核苷酸的区域，（iii)所述 第一核酸链中天然DNA核苷酸、修饰的DNA核苷酸和核苷酸类似物的总数为8至100,并且 (iv)所述第一核酸链能够与细胞内的RNA杂交；并且
[0044] 所述第二核酸链包含独立地选自天然RNA核苷酸、修饰的RNA核苷酸和核苷酸类 似物的核苷酸。
[0045] (2)如项目（1)所述的方法，其中所述第一核酸链包含至少一个由2个或3个连续 的天然DNA核苷酸组成的区域。
[0046] (3)如项目⑵所述的方法，其中所述第一核酸链包含桥接核苷酸/DNAmixmer寡 核苷酸。
[0047] (4)如项目（2)或（3)所述的方法，其中所述桥接核苷酸独立地选自LNA、 cEt-BNA、酰胺BNA(AmNA)和cMOE-BNA。
[0048] (5)如项目（1)-⑷中任一项所述的方法，其中所述第一核酸链中的天然核苷酸 中的至少一个或核苷酸类似物中的至少一个被硫代磷酸化（phosphorothioated)。
[0049] (6) -种用于改变编码RNA或非编码RNA的功能的方法，所述方法包括：
[0050] 使双链核酸复合体与细胞接触，所述双链核酸复合体包含：
[0051] 退火至第二核酸链的第一核酸链，其中：
[0052] 所述第一核酸链⑴选自吗啉代寡核苷酸、2'-0-甲基修饰的寡核苷酸、 2'-0-(2-甲氧基乙基）修饰的寡核苷酸或桥接核苷酸寡核苷酸，（ii)所述第一核酸链中核 苷酸总数为8至100,并且（iv)所述第一核酸链能够与细胞内的RNA杂交；并且
[0053] 所述第二核酸链包含独立地选自天然RNA核苷酸、修饰的RNA核苷酸和核苷酸类 似物的核苷酸。
[0054] (7)如项目（6)所述的方法，其中所述第一核酸链中的核苷酸中的至少一个被硫 代磷酸化。
[0055] (8)如项目（1)-(7)中任一项所述的方法，其中所述第二核酸链包含至少一个具 有2' -0-甲基的修饰的RNA核苷酸，并且在治疗性寡核苷酸区域的3'末端和5'末端处的 至少一个核苷酸间联接比天然核苷酸间联接更为耐受核酸酶。
[0056] (9)如项目（1)-⑶任一项所述的方法，其中所述第二核酸链包含3'翼区和5'翼 区。
[0057] (10)如项目（8)或（9)所述的方法，其中所述第二核酸链包含一个或更多个位于 5'末端和3'末端处的硫代磷酸化的核苷酸。
[0058] (11)如项目（9)或（10)所述的方法，其中所述第二核酸链的3'翼区和5'翼区各 自包含至少一个具有2' -0-甲基的核苷酸。
[0059] (12)如项目（1)-(11)任一项所述的方法，其中所述第一核酸链和/或所述第二核 酸链还包含功能部分，所述功能部分具有选自标记功能、纯化功能和祀向递送功能的功能。
[0060] (13)如项目（1)-(12)任一项所述的方法，其中所述双链核酸复合体还包含第三 核酸链，所述第三核酸链退火至所述第一核酸链或所述第二核酸链。
[0061] (14)根据项目（13)所述的方法，其中所述第三核酸链包含PNA核苷酸。
[0062] (15)根据项目（13)或