微粒组合物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种微粒组合物。更具体地但非排他地本发明设及一种适用于对选定 分子部分进行超声成像的微粒组合物。
【背景技术】
[0002] 诊断超声波检查（超声检查）是一种W超声为基础的诊断成像技术，对于可能的 病理或病灶，其用于可视化包括肌腫、肌肉、关节、血管和内部器官等组织。常见的例子是在 怀孕之间日常使用的产科超声检查。然而，到目前为止，超声成像限于确定解剖结构和运动 W及血液流动。
[0003] 另一方面，超声分子成像，通过祀向微泡的方法，促使目标给定分子部分 (moiety)/多个分子部分（moieties)的成像（表达），而祀向微泡包括颗粒外壳上祀向配 体（分子结合单元）1。运一方法通过祀向微泡的静脉（iv)给药来工作，祀向微泡随后循环 和在表达目标分子的区域累积。微泡的累积可W描述在超声图像上，作为亮斑信号的区域， W定位分子。
[0004] 运一技术允许在动物模型中的体内分子成像。然而，超声分子成像还没有在人体 中执行，部分原因是关于它的安全性和有效性的不确定性，包括：
[0005] (1)生物素-(链霉）亲合素共辆化学的传统应用是使祀配体（分子结合单元）粘 结到微泡外壳，链霉亲合素和亲和素是免疫蛋白，最好避免人类的应用；
[0006] (2)高超声功率成像技术的传统应用包括"瞬时"颗粒破坏1'2,其提升了安全考虑 3。此外，该技术使分子祀（目标的分子部分）的实时床边可视化变得困难，和用于评估屯、 脏不停跳的连续成像或使用微泡单次推注的多平面成像变得不可能；和
[0007] (3)低程度的超声分子成像，降低其作为临床诊断工具的应用。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供一种非免疫性的微粒组合物，因此，其适合用于人类 受试者和动物受试者超声分子成像中。进一步，本发明的目的在于提供一种体内特异性和 有效性的微粒组合物，用于在一个或多个组织/器官中对目标分子部分进行高效定量和实 时的超声分子成像。运样制备的微粒在体内可W具有一个或多个有利的特征，其包括但不 限于，使用单次推注微粒给药，无毒、足够稳定地用于连续和/或多平面成像，其对于目标 分子部分的高效定量分析具有良好的动力学和声学响应，对目标分子部分具有足够高的祀 向特异性和有效性，和在组织中缺少非特异性结合/持久性而不表达目标的分子部分（祀 分子）（除了网状内皮系统（RE巧的组织中，例如肝脏、脾脏，其是身体内微粒消除的常用途 径）。
【发明内容】
[0009] 本发明的一方面，提供了一种用于分子成像的微粒组合物。所述组合物包括微粒， 其中，该微粒包括：具有中屯、区域和外壳的核屯、微粒结构，W及其中，该核屯、微粒结构包括： (i)憐脂酷胆碱脂质；（ii)包括至少一个马来酷亚胺部分（moiety)的憐脂酷乙醇胺脂质； 和（iii)烷氧基脂肪酸。
[0010] 该组合物提供了一种天然的微粒结构，其可W被修饰为适用于选定分子祀（目标 分子部分（moiety)/多个部分（moieties))的成像。因此，该微粒进一步可W包括至少一 个分子结合单元，其中，该至少一个分子结合单元共价地粘附在核屯、微粒结构的外壳上。
[0011] 关于成像，已经发现，该特异性组合物产生足够反射声波和稳定的微粒，该微粒缺 少非特异性结合，将不会在体内立即产生副反应。该微粒通过分子结合单元连接到核屯、微 粒结构的外壳上，也有利于流动条件下高效的祀向结合。该微粒良好的动力学和声学响应 允许在体内形成高效定量实时超声分子成像。
[0012] 术语"分子成像"指的是分子部分的成像，例如但不限于，分子、细胞、或颗粒（包 括位于人工/植入材料，例如冠脉支架、人工屯、瓣、或封堵器上的金属、聚合物或药物）。因 此，术语"分子成像"可W用来指表型的成像（检测表型的存化不存化和/或程度），其 方式是通过祀向具有该微粒的分子部分的一个或组合。表型的示例包括但不限于，生理状 态、病理状态、病理生理状态、疾病状态、或运行状态（例如，装置的）。例如，使用微粒祀向 E-选择素巧sel)(-种内皮细胞黏附分子，其在炎症内皮细胞活化期间表达）的分子成像 可W用于成像检测和评估Esel的表达程度，W及内皮激活和/或炎症。非祀向微粒，例如 含有，或完全不含有非相关分子结合单元的微粒，可W用于分子成像，经常作为阴性对照， 或用于评估非特异性微粒结合/粘附/保留在组织/器官/受试者/系统中的程度，或作 为成像信号校准的试剂（例如，微粒超声成像信号强度-微粒浓度的校准），或用于评估灌 注或描述血液-组织的边界，等等。
[0013] 术语"微粒"指的是小颗粒，表现为就它们传输和性能而言的整个单元，其典型地 表现为范围在0.1-10ym(优选1-5ym)的平均颗粒尺寸直径（例如，通过显微镜、电区感 应、或激光衍射技术来检测）。术语"微泡"与术语"微粒"可W是同义使用的。脂质体是一 类典型的微粒，被认为是由脂质双层构成的人工制备的囊泡。类似的，胶束是一类微粒，被 认为是由亲水外壳和疏水核构成的人工制备的颗粒。
[0014] 本发明的所述微粒包括具有中屯、区域和外壳的核屯、微粒结构。所述核屯、微粒结构 由主要基于脂质的组合物构成，其包括：（i)憐脂酷胆碱脂质；（ii)包括至少一个马来酷亚 胺部分的憐脂酷乙醇胺脂质；和（iii)烷氧基脂肪酸。运些组分容易发生自组装W形成稳 定的微粒核屯、结构。
[0015] 根据组分（i)和（ii)，本发明所述的憐脂酷胆碱和憐脂酷乙醇胺脂质分别为典型 的中性憐脂质。因此，它们是包括含憐酸基的亲水性头基和疏水性尾基的脂质。在此所使 用的术语"中性"指的是在选定抑下，存在不带电或中性两性离子形式的实体。例如，合适 的抑可W是7. 4+/-0. 5。
[0016] 另外，根据组分（i)和（ii)，本发明所述的憐脂酷胆碱和憐脂酷乙醇胺脂质，分别 典型地具有修饰亲水性头基的饱和或非饱和疏水性尾基。优选地，疏水疏水性尾基为饱和 脂肪酸或其衍生物。术语"脂肪酸"指的是直链或支链、饱和或不饱和的包括C, 24碳链的簇 酸或其衍生物。典型地，饱和脂肪酸包括。。24的碳链，更优选地C1。2。。
[0017] 所述组分（i)的憐脂酷胆碱脂质优选为包括C,24,更优选Cs22,最优选Cl。2。脂肪酸 碳链的憐脂酷胆碱脂质。例如，所述脂质的具体示例包括，二油酷憐脂酷胆碱值0PC)、二栋 桐酷憐脂酷胆碱值PPC)、栋桐酷油酷憐脂酷胆碱（POPC)、和二硬脂酷憐脂酷胆碱值SPC)。 可W相信，当所述脂质的脂肪酸链在Cl。2。的范围时，形成更稳定的微粒。更优选地，所述组 分（i)的憐脂酷胆碱脂质为饱和。。2。憐脂酷胆碱脂质，例如二硬脂酷憐脂酷胆碱值SPC; 1，2-二硬脂酷-Sn-甘油-3-憐酸胆碱）。
[0018] 所述组分（ii)的憐脂酷乙醇胺脂质优选地包括：含有C, 24,更优选Cs22,最优 选。。2。脂肪酸碳链的憐脂酷乙醇胺脂质。例如，所述脂质包括基于二油酷憐脂酷乙醇胺 值OP巧、栋桐酷油酷憐脂酷乙醇胺（POP巧、和二硬脂酷憐脂酷乙醇胺值SP巧的结构。可 W相信，当所述脂质的脂肪酸链在。。2。的范围时，形成更稳定的微粒。更优选地，所述组 分（ii)的憐脂酷乙醇胺脂质为饱和。。2。憐脂酷乙醇胺脂质，例如二硬脂酷憐脂酷乙醇胺 值SP巧。
[0019] 在本发明优选的方面，所述组分（ii)的憐脂酷乙醇胺脂质是聚乙二醇修饰的。术 语"聚乙二醇修饰的"指的是实体，通常是基于聚合物或脂质的实体，其共价地结合到聚乙 二醇（PEG)聚合物链上。PEG链具有分子式[2。成。+20。+1和低于2000克/摩尔的分子量。在 运种情况下，马来酷亚胺部分粘附至PEG聚合物链，更优选地，PEG聚合物链提供了马来酷 亚胺部分和所述憐脂酷乙醇胺脂质部分间的共价连接。
[0020] 因此，所述组分（ii)的憐脂酷乙醇胺脂质优选地包括分子量至少为500,例如至 少1000、1500、或2000的聚乙二醇链。根据自组装，1500-2500分子量的聚乙二醇链是优选 的。
[0021] 所述组分（ii)的憐脂酷乙醇胺脂质包括至少一个马来酷亚胺部分，马来酷亚胺 部分是具有通式H2C2(CO) 2NH的化学实体，其可W用W下结构来表示。
[0022]
[0023] 优选地，潜在地通过阳G聚合物链，所述述组分（ii)的马来酷亚胺部分的NH基共 价地结合到所述憐脂酷乙醇胺部分。
[0024] 特别优选地，所述微粒组合物的憐脂酷乙醇胺脂质是1，2-二硬脂酷-Sn-甘 油-3-憐酸乙醇胺-N-[马来酷亚胺（聚乙二醇）-2000](简称DS阳-PEGz(XK)-Mal)。
[00巧]特别地，马来酷亚胺部分作为所述分子结合单元手柄的应用不同于通常在制备该 颗粒中的免疫（链霉）亲合素-生物素的配位化学。尽管可W使用其他配位化学，让人惊 奇地是，马来酷亚胺键产生具有低水平免疫的微粒。而且，所述马来酷亚胺键的抑稳定性 在W下方面具有优势：防止所述分子结合单元的降解，W及通过防止体内所述分子结合单 元与所述微粒外壳的解离，防止制备期间所述微粒的降解。
[0026] 根据本发明组分（iii)的所述烷氧基脂肪酸可W包括直链的或支链的、饱和的或 不饱和的脂肪酸基。而且，所述脂肪酸链可W是C, 24链，更优选CS22链，最优选C1。2。链。如 此，包括直链、饱和或不饱和的（优选饱和的）Ci。2。链的脂肪酸链是优选的。所述烷氧基 (例如，与脂肪酸基形成醋的基团）可W是单独地结合到所述脂肪酸的氧上的直链或支链 的烷基（优选ClW烷基或C1 24烷基），締基（优选C1 5。締基或C1 24締基），或聚乙二醇基。
[0027] 本文所用术语y烷基"指的是含有x-y个碳原子的直链或支链的饱和控基。例 如，Cl5。烷基指的是含有1-50个碳原子的直链或支链的饱和控基。CI5。烷基的例子包括甲 基、乙基、正丙基、异丙基、正T基、异T基、仲T基、叔T基、正戊基、异戊基、新戊基、己基、 异己基、1，1-二甲基下基、2, 2-二甲基下基、3, 3-二甲基下基、2-乙基下基、庚基、辛基、壬 基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、=十烷基、四十烧 基、和五十烷基。
[0028]本文所用术语y締基"指的是含有一个或多个碳碳双键和具有x-y个碳原子的 直链或支链的控基。Cl5。締基的例子包括乙締基、1-丙締基、2-丙締基、2-甲基-1-丙締 基、1- 了締基、2- 了締基、3- 了締基、3-甲基-2- 了締基、1-戊締基、2-戊締基、3-戊締基、 4-戊締基、4-甲基-3-戊締基、1-己締基、3-己締基、5-己締基、庚締基、辛締基、壬締基、癸 締基、^^一碳締基、十二碳締基、十立碳締基、十五碳締基和十六碳締基。
[0029] 术语"控"指的是只有氨和碳构成的实体，所述实体可W是饱和或不饱和，支链或 直链的。
[0030] 在优选的方面，所述烷氧基脂肪酸是聚乙二醇脂肪酸。因此，例如，合适的烷氧基 脂肪酸可W是。。2。饱和聚乙二醇脂肪酸醋。在微粒稳定性方面，特别优选的聚乙二醇脂肪 酸醋是PEG4。硬脂酸醋。
[0031] 除非另外指出，组分（i)-(iii)或任何在本文中所述的进一步组分可WW盐的形 式，W及游离形式（酸或碱）而存在。
[0032] 根据本发明的所述微粒组合物可W包括至少一个结合到所述核屯、微粒结构外壳 上的分子结合单元。在运种方法中，生成的祀向微泡对于选定分子部分是有特异性的（表 达），例如，特异性粘附在选定分子部分上。在一个优选实施例中，所述至少一个分子结合单 元是通过所述至少一个马来酷亚胺部分共价粘附到所述核屯、微粒结构上。而且，所述微粒 组合物可W包括一个或多个不同的分子结合单元W祀向一个或多个分子部分（表达）。
[0033] 所述分子结合单元可W是任何能够结合到互补分子部分的无机或有机分子。所述 分子结合单元的精确识别和本性依赖于待所述微粒识别和成像的目标分子部分。例如，所 述分子部分可W是分子、蛋白质、受体、颗粒或细胞，其包括存在于人工或植入材料上。所述 分子部分可W存在于细胞的表面。所述分子结合单元可W是任何能够结合到所述目标分子 部分的合适的单元。所述分子结合单元应该特异性结合到所述目标分子部分，从而其不能 结合到其他分子部分。因此，合适的分子结合单元可W包括但不限于，蛋白质、多肤、核酸、 糖、脂质、无机部分、或小有机部分（例如，药物分子）。在一些实施例中，所述分子结合单元 可W是金属（例如，儀、钻、儀或锋的离子，其结合到组氨酸标记）。4在一些特定的实施例 中，所述分子结合单元可W是结合蛋白质、亲合体、或抗体分子。
[0034] 术语"结合蛋白"指的是任何能够特异性结合到分子的蛋白质（W下称之为它的 "结合配对物"）。特异性结合蛋白具有结合位点，在该结合位点上，其结合至它的结合配对 物。所述结合蛋白通常在运一位点上只是高亲和性地结合至它的结合配对物和与该结合配 对物具有类似结构的其他分子。与所述结合配对物不相似的分子将低亲和性地结合，即使 有的话。结合蛋白为本领域相关技术人员所熟知的。结合蛋白的例子包括但不限于，T细 胞受体、HLA蛋白、细胞表面受体和酶。5术语"结合蛋白"也包括上述的功能片段或任何其 他能够特异性结合的分子。功能片段是上述结合蛋白仍然能够高亲和性地特异结合到它的 结合配对物的一部分。
[0035] 术语"亲合体"指的是基于58个氨基酸残基蛋白质结构域的小分子，其是从葡萄 球菌A蛋白的IgG结合域衍生而来。它们被挑选从而对小分子具有特异性结合（例如，见 专利文献W095/19274A1)。6S
[0036] 术语"抗体"或"抗体分子"指的是任何同型的多克隆或单克隆抗体，或其抗原结 合片段，例如，Fv、F油、F(油'）2片段和单链Fv片段。所述抗体分子可W为重组抗体分子， 例如，嵌合抗体分子、CDR接枝抗体分子（作为人类抗体分子也很出名）或其片段。所述抗 体及其制备方法在现有技术中是已知的。所述抗体分子由任何合适的方法来制得，例如，使 用杂交或隧菌的技术。本领域技术人员知道怎样生产对小分子具有特异性结合亲和能力的 抗体。S所述抗体分子可W从任何合适生物中制备，例如，绵羊、小鼠、兔子、山羊、驴、骆驼、 美洲驼马或整鱼。优选地，所述抗体分子是人类、人源化、嵌合或晒齿动物的抗体分子。
[0037] 术语"特异性地结合"指的是两分子之间的相互作用，其形成在生理条件下相对稳 定的复合物。其特征在于，高亲和性明显不同于经常具有低亲和性的非特异性结合。
[0038] 所述分子结合单元优选地为抗体分子。在运种情况下，所述抗体分子可W通过裸 露的硫醇基（例如，-SH)共价地粘附到马来酷亚胺基，从而得到硫酸键（例如，-S-)。
[0039] 合适的分子结合单元的具体例子为E-选择素巧sel)用抗体。Esel是一种内皮细 胞黏附分子，其通常只在激活内皮细胞中表达（剩余内皮细胞中缺乏基本的表达）。9尤其 是，可W用于内皮激活或炎症的特异性检测。因此，本发明的一个实施例允许首次使用 超声在屯、脏和肾脏中实施Esel的特异性成像。
[0040] 在不同疾病的各种病理生理学过程设及到的其他血管内分子/细胞，其可W是所 述分子结合单元的祀，包括但不限于：
[0041] (i)在动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、急性屯、肌梗死和早期血管成形术、慢性局 部缺血、屯、脏移植排斥、脑脊髓炎、克罗恩（化Ohn)病和肿瘤福射等发炎过程中，在主动脉、 屯、脏、骨骼肌、肾脏、脑、肠和前列腺癌（后肢移植）等组织中，P-选择素（Psel)、非选择性 的选择素（例如，非选择性Esel、Psel、Lsel合并）、细胞间粘附分子-1 (ICAM-I)、血管细胞 粘附分子-1 (VCAM-I)、粘膜地址素细胞粘附分子-1 (MAdCAM-I)和含0 1、0 3的整合素（例 女日，曰501、曰V03、曰1化03(糖蛋白nb/IIIa受体（GPnb/IIIa受体）））
[004引 扣）血管内皮生成因子受体-2(VEGFR-2)、含01、0 3或aV的整合素（例如， 0501、av03)和内皮因子，位于W下的血管生成：(a)位于脑、膜腺、乳房脂肪垫、后肢、侧 腹或腹股沟区域的肿瘤（乳腺、前列腺、卵巢、结肠、膜腺癌、黑色素瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤 和神经胶质瘤）；化）慢性局部出血（后肢、骨骼肌）；和（C)基质胶插塞血管生成；
[0043] (iii)在中风或血栓栓塞性疾病中，位于颈动脉、左屯、耳、下腔静脉和腹主动脉中 的血栓症（血块）的aIIb0 3师Hb/nia受体）；
[0044] (iv)淋己结中的心选择素化sel);
[004引 （V)报道分子，诸如大多数组织相容性复合物（M肥）类IH-2趾蛋白，例如位于，在 内皮原始细胞治疗中，由内皮原始细胞衍生而来的传染骨髓上；
[004引 （vU激活的白细胞，例如，在屯、脏或肾脏中的缺血再灌注损伤、急性屯、肌梗死和早 期血管成形术、和屯、脏移植排斥（憐脂酷丝氨酸可W作为分子结合单元，其通过可能的机 制祀向激活的白血球，该机制包括但不限于，电荷相互作用和补体结合）。
[0047] 在一些实施例中，所述分子结合单元可W选自下表：
[0051] 表I-体内超声分子成像
[005引 a在标准单字母命名法中，含有前缀"C"的多肤序列代表"环（cyclo-) "。b与白 血球的憐脂酷丝氨酸的相互作用包括激活白血球上的电荷相互作用和互补物受体（未定 义）。C真实的分子祀是未知的。
[0053] 简写：DSPS(二硬脂酷憐脂酷丝氨酸）；Ab(抗体）
[0054] 在实施例中，无论分子结合单元是否配位到组分（ii)的马来酷亚胺部分，在所述 微粒或组分（ii)上的任何马来酷亚胺部分（换言之，那些含有活性马来酷亚胺功能的马来 酷亚胺部分），例如，可W通过水解或与过量的硫醇反应而被失活。尤其是，使用每个分子中 单硫醇基的合适分子可W是优选的，例如，心半脫氨酸（从反应物而来的微粒或组分随后 需要被纯化）。
[0055] 当所述分子结合单元配位到所述微粒上的时候，在该配位反应中使用的所述配位 反应比优选地为至少2XIO6个分子结合单元（例如，抗体分子）/微粒。在一些实施例中， 所述配位反应比可W优选地为至少3XIO6个分子结合单元/微粒。更进一步地，所述配位 反应比可W优选地为至少4XIO6个分子结合单元/微粒。当使用运一数量级的反应比的 时候，制得在流动条件及静止条件下能够足够结合的微粒。更低水平（例如，约IXIO6个 分子结合单元/微粒）生成在静止条件下只能祀向的微粒。
[0056] W另一方式表达，假设所有组分（ii)结合到所述微粒的所述外壳上，在使所述分 子结合单元配位到所述微粒上的反应中，使用的所述配位反应比使得所述至少一个分子结 合单元与组分（ii)的配位反应摩尔比为> 1:1。另外，所述至少一个分子结合单元与组分 (ii)的配位反应摩尔比可W为> 5:1。进一步地，所述配位反应摩尔比可W为> 8:1、> 9:1 或> 10:1。在一些实施例中，所述配位反应摩尔比可W约是10:1。
[0057] 在一些实施例中，所述微粒具有至少约0. 3X105个分子结合单元（例如，抗体分 子）/微粒。运允许所述微粒在流动条件及静止条件下能够充足地结合。在一些实施例中， 所述微粒具有至少约IXlO5个分子结合单元（例如，抗体分子）/微粒。所述微粒可W具 有至少约2XIO5个分子结合单元（例如，抗体分子）/微粒。进一步地，所述微粒可W具有 至少约3XIO5个分子结合单元（例如，抗体分子）/微粒。在特定实施例中，所述微粒可W 具有至少约3X1〇5-约4X1〇5个分子结合单元（例如，抗体分子）/微粒。
[0058] 所述微粒可W具有至少约2500个配位的分子结合单元（例如，抗体分子）/ym2微 粒表面积。进一步地，所述微粒可W具有至少约5000个配位的分子结合单元（例如，抗体 分子）/ym2微粒表面积。在一些实施例中，所述微粒可W具有至少约7500个配位的分子 结合单元（例如，抗体分子）/ym2微粒表面积。
[0059] 已经发现，通过保持每一分子结合单元上的配位位点为最小值（例如，只还原1个 链间二硫键W生成每抗体中的2个-甜基）和使颗粒配位后的任何未反应基团（例如，通 过未反应-SH基的烷基化）失活，由于交联而明显的颗粒团聚也可W被避免。
[0060] 所述分子结合单元可W在所述微粒形成之前或之后共价地粘附在所述微粒组合 物的所述组分（ii)上。当结合单元在所述微粒形成之前共价地粘附在组分（ii)上，则最 终的组分摩尔比为5-15。
[0061] 所述微粒的结构形态学不限于任何方法，W及所述颗粒可W表现为脂质体或胶束 的结构。在一些实施例中，所述核屯、微粒结构是胶束的结构。当所述核屯、微粒结构是胶束 的结构时，所述组分脂质的亲水性头基创建所述核屯、结构的所述外壳，而疏水性尾部延伸 到所述核屯、的中屯、区域。在另一些实施例中，所述核屯、微粒结构是脂质体的结构。
[0062] 在本发明一个优选方面中，所述微粒组合物在所述核屯、微粒结构的中屯、区域含有 流体介质。所述流体介质可W是任何生理学上可接受的介质，其可W含有或不含有活性成 分，其通过所述分子结合单元用于传递到特异性祀向的位置。优选地，所述流体介质包括 生理学上可接受的气体。合适的生理学上可接受的气体包括空气、氮气、二氧化碳、氣、氯、 六氣化硫、氯=氣甲烧、二氯二氣甲烧、漠=氣甲烧、漠氯二氣甲烧、四氣甲烧、二漠二氣甲 烧、二氯四氣乙烧、氯五氣乙烧、六氣乙烧、六氣丙締、八氣丙烷、六氣下締、八氣-2-下締、 八氣环下烧、十氣下烧、全氣环戊烧、十二氣戊烧、和十四氣己烧。从实