一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负载移植性神经干细胞的 PF-127-LV-NFcocktail复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 针对脊髓损伤急性期的治疗主要是激素和传统手术治疗，但这些疗法对脊髓损伤 所继发引起的多种神经功能障碍并无明显效果。脊髓损伤的发生发展往往与损伤后神经细 胞的死亡以及与之相联系的投射神经元的进行性萎缩有关，其症状主要是因损伤导致大量 神经细胞缺失，以及神经网络连接被破坏引起神经传递中断的结果。脊髓损伤后即使有一 定程度的轴突再生，其再生能力也极其有限，越来越多的证据显示，内源性神经发生不足以 修复损伤脊髓功能。修复脊髓损伤意味着神经网络组织结构在形态和功能两方面的修复： 其目标在于重建神经通路连接并恢复一定程度的功能。因此，修复的策略重点在于替代在 疾病过程中失去的神经细胞并促使神经生长，再建损伤后神经轴突与其靶器官及投射神经 元联系，引导脊髓功能改善恢复。基于此，目前认为细胞替代疗法是治疗脊髓损伤富有潜力 的策略。
[0003] 神经干细胞（neuralstemcells，NSCs)理论上是治疗脊髓损伤的首选细胞，是移 植替代治疗的首选干细胞类型。许多学者尝试应用神经干细胞移植对脊髓损伤动物模型进 行研宄，并取得了一定的效果。国内也有多家综合实力雄厚的医院开展了初步的神经干细 胞移植治疗脊髓损伤等。但实践中观察到，脊髓损伤后移植的外源性神经干细胞在受损脊 髓病理微环境存活较少，可观察到移植细胞向神经元分化，但这种分化神经元的数目通常 较少，且移植的神经干细胞绝大多数分化成星形胶质细胞。这种移植细胞存活少且倾向于 分化为星形胶质细胞而非神经元的严重偏向是目前神经干细胞移植替代疗法的主要障碍 之一。因此，使用神经干细胞移植治疗脊髓损伤的一个关键问题是如何改善移植后神经干 细胞所处的损伤局部病理微环境，增加移植的神经干细胞存活生长，并使其尽可能多的定 向分化为脊髓神经元。
[0004] 研宄发现，脊髓损伤后，髓鞘和胶质瘢痕释放的髓磷脂相关抑制因子是脊髓损 伤后局部微环境中主要的抑制因素。目前发现的髓磷脂相关抑制因子主要包括轴突生 长抑制因子（neuriteoutgrowthinhibitoryA，NogoA)、髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associatedglycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelinglycoprotein,OMgp)。这些抑制因子可与神经细胞膜上的一种共受体成分-- LINGO-1(LRRandIgdomain-containingNogoreceptorinteractingprotein)结 合。LINGO-1选择性表达在脑和脊髓的神经元和少突胶质细胞上，是细胞膜上NgRl/p75/ LLNG0-1或NgRl/Troy/LING0-1信号转导复合物的必要成分。髓磷脂抑制因子与LING0-1 结合后，引起其信号复合物活化，通过激活RhoA激酶将下游抑制信号转导入神经元和少突 胶质细胞内，从而抑制中枢神经轴突生长和髓鞘形成。因此，LING0-1的发现为改善脊髓损 伤后的抑制环境提供了新的途径，即通过靶向抑制LINGO-1基因表达，减少其与损伤微环 境中抑制因子的结合，并阻滞其下游信号的传导而促进神经生长。研宄表明，拮抗LING0-1 对脊髓损伤后神经再生和功能恢复有明显效应。
[0005] 进一步的研宄发现，神经干细胞同样表达LING0-1分子，拮抗LING0-1的表达可增 加神经干细胞的增殖，并使体外培养的神经干细胞定向神经元分化。
[0006] 神经干细胞移植的另一个障碍是经胰蛋白酶处理的移植神经干细胞以细胞悬浮 液形式直接移植入脊髓横断损伤部位后，多数只能存活在横断病灶边缘而不能均匀填充横 断损伤的裂隙，造成分化后神经元的轴突延伸只能部分桥接损伤区域。因此，亟待有能均匀 负载神经干细胞并填充损伤裂隙的支撑物，该支撑物还应能满足神经干细胞分化后神经轴 突延伸生长的需要，并能降解吸收，有良好的脊髓组织相容性等。近年来日益令人瞩目的新 型人工合成的智能生物材料PluronicF-127(PF-127)水凝胶恰好能满足这些要求。PF-127 是一种温度敏感型水凝胶，它在〇°C左右为液态，而在37°C左右可由液态胶化转变为弹性 凝胶态，能起到递送、释放药物和生物分子的运载系统以及生物支架的双重作用。PF-127已 经美国FDA批准在人类使用，其生物相容性好，可生物降解吸收。有研宄使用PF- 127在动 物体内构建组织工程软骨和肺，其在脊髓损伤中的应用已有报道，并可在体外作为脂肪干 细胞、骨髓间充质干细胞等种子干细胞三维立体培养的生物支架。PF-127在体内温度环境 下胶化后内部形成三维孔洞，可为神经干细胞黏附、生长、增殖、分化及神经轴突延伸及突 触形成提供有利条件。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种能负载移植性神经干细 胞、并能促进神经干细胞定向分化和神经再生的的PF-127-LV-NFcocktail复合物。
[0008] 本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供能负载移植神经干细胞、并能 促进神经干细胞定向分化和神经再生的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法。
[0009] 本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供PF-127-LV-NFcocktail复合 物在促进移植性神经干细胞定向分化和存活中的应用。
[0010] 为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案： 提供一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：PluronicF-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1shRNA慢病毒表达载体和神经生 长因子混合物； 所述神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、 血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶 质细胞源性神经营养因子。
[0011] 所述PluronicF-127水凝胶与所述完全神经干细胞培养基的混合比例为每 100mL完全神经干细胞培养基中加入15g~25g的PluronicF-127水凝胶； 所述PluronicF-127水凝胶与所述神经生长因子混合物的质量比为15~25:10~20 ; 所述Lingo-1shRNA慢病毒表达载体在所述PluronicF-127水凝胶和所述完全神经 干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为1X107TU/ml~4X107TU/ml。
[0012] 所述神经生长因子混合物中，所述脑源性神经营养因子、所述神经营养因子-3、所 述血小板源性生长因子、所述胰岛素样生长因子1、所述表皮生长因子、所述碱性成纤维细 胞生长因子和所述胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为3~7:3~7:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5。
[0013] 所述完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成 纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。
[0014] 所述Lingo-1shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0015] 为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案： 提供一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包 括以下步骤： 步骤一，PluronicF-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在一定温度下，并在搅 拌的状态下，将配方量的PluronicF-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养 基中，然后继续搅拌一定时间，得到混合液，然后将混合液在一定温度下静置一定时间后， 得到半透明液态物； 步骤二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表达载体：在一定温度下，将Lingo-1shRNA慢 病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有IX107TU/ ml~4X107TU/ml的Lingo-1shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混 合液； 步骤三，加入神经生长因子混合物：在一定温度下，将配方量的神经生长因子混合物加 入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液； 步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用一定孔径的微孔过滤器进行过滤除 困后，即得到PF_127_LV_NFcocktail复合物。
[0016] 上述技术方案中，所述步骤一，在〇°C~4°C下，并在搅拌的状态下，将配方量的 PluronicF-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌12 小时~24小时，得到混合液，然后将混合液在2°C~4°C下静置22小时~26小时后，得到半透 明液态物。
[0017] 上述技术方案中，所述步骤二，在2°C~4°C下，将Lingo-1shRNA慢病毒表达载体 与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1X107TU/ml~4X107TU/ml 的Lingo-1shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液； 所述步骤三，在2°C~4°C下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第 二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液。
[0018] 上述技术方案中，所述步骤四，所述微孔过滤器的孔径为0. 15ym~0. 35ym。
[0019] 为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案： 上述所述的PF-127-L