沙糖桔具酪氨酸酶抑制活性的有效部位的制备与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及沙糖桔具酪氨酸酶抑制活性的有效部位的制备与用途，属于医药和食 品技术领域。
【背景技术】
[0002] 沙糖桔，又称十月桔，属芸香科橘属类水果。主要产地有：荔浦（修仁镇）、怀集、 广宁、四会。沙糖桔果实扁圆形，顶部有瘤状突起，蒂脐端凹陷，色泽橙黄，果壁薄，易剥离。 其含有丰富的维生素C、钙、纤维质、少量蛋白质、脂肪以及丰富的葡萄糖、果糖、蔗糖、苹果 酸，枸椽酸、柠檬酸以及胡萝卜素、硫胺素，核黄素、尼克酸、抗坏血酸、黄酮类化合物等生物 活性成分。
[0003] 目前对沙糖桔的研宄甚少，对其各个部位（果皮、橘络、叶子、果肉）的成分也未见 文献报道。我们通过对五种橘属类水果（蜜桔、沙糖桔、柠檬、赣南橙、柚子的果皮、果肉、筋 络）提取物进行酪氨酸酶抑制活性筛查，发现沙糖桔橘络具有较强酪氨酸酶抑制活性，为 此我们通过高效液相色谱-质谱联用技术，进一步确定其主要成分。
[0004] 酪氨酸酶为黑色素合成的关键酶，其表达和活性与果蔬的褐变和人体色素沉着性 疾病密切相关。因此，酪氨酸酶抑制剂可作为黑色素抑制剂应用于食品、化妆品、医药等领 域。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具酪氨酸酶抑制活性的的有效部位，是从沙糖桔橘络 中提取的由六种多酚类化合物组成的有效部位，包括柚皮芸香苷_4'_葡萄糖苷、柚皮苷、 橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷和槲皮素-7, 3'，4'-葡萄糖苷。
[0006] 所述有效部位中总酚含量为460_480mg/g，总黄酮含量为14_16mg/g。
[0007] 所述有效部位中总酚含量为472. 68mg/g，总黄酮含量为14. 63mg/g。
[0008]所述有效部位中6种化合物的含量分别为3. 2 %，28. 6 %，2. 6 %，26. 4 %，20. 3 %， 2. 5%〇
[0009] 本发明的另外一个目的是提供所述酪氨酸酶抑制剂活性化合物及其有效部位的 制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
[0010] (l)25g沙糖橘橘络加入到500mL的95% (v/v)乙醇中，于30°C，超声功率250W的 超声波提取30min，提取液减压浓缩至干燥物，称重；
[0011] (2)80.0 mg干燥物用320mL去离子水溶解得到原料液，依次使用二氯甲烷和乙酸 乙酯对原料液萃取两次，萃取剂：原料液=2 :l(v/v);
[0012] (3)分离萃取相，减压浓缩至干燥物，得到有效部位提取物。
[0013]本发明的另外一个目的是提供所述的沙糖桔橘络具有酪氨酸酶抑制活性的有效 部位在制备抗果蔬酶促褐变抑制剂、制备化妆品美白剂，制备预防和治疗黑色素异常导致 的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应 用。
[0014] 本发明从沙糖橘橘络中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位，含有六种黄酮 类化合物，可以作为抑制酪氨酸酶活力的活性成分，不加或加入食品添加剂辅料，化妆品辅 料或药剂上接受的辅料，按照相应剂型的制备方法制成制剂。
[0015] 所述的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布剂、注射液、滴注液、 粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶 囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸 等。
[0016] 本发明从沙糖桔橘络中提取得到具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位，是含有六种 多酚类化合物的组合物，该有效部位比其他橘属类水果提取物具有更强的活性，制成相应 制剂易于质量控制，可在果蔬酶促褐变抑制剂、化妆品美白剂、预防和治疗黑色素异常导致 的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应 用。
【附图说明】
[0017] 图1为沙糖橘具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位提取物的UPLC/Q-T0F-MS紫外 及总离子流谱图；(a) :UV色谱图；(b):低碰撞能量总离子流图；（c):高碰撞能量总离子流 图。
[0018] 图2为沙糖橘具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位提取物质谱图及分子断裂分析 示意图；图（a)~（f)分别为色谱峰1~6对应的质谱图和化合物分子结构。
[0019] 图3总酚测定芦丁标准曲线。
[0020] 图4总黄酮测定芦丁标准曲线。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，这些实施例仅 用于说明本发明而非对本发明的限制。此外，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0022] 实施例1沙糖橘橘络提取物的制备
[0023] 新鲜的沙糖橘橘络以1:20的料液比（m/v)用95%乙醇在250w功率下，30°C超声 提取30分钟，提取液减压浓缩至干燥物，称重；干燥物用去离子水，料液比1 :4(m/v)混悬 得到原料液，依次使用二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取两次，萃取剂：原料液=2 :l(v/v);分离 萃取相，减压浓缩至干燥物，称重，得到有效部位的提取物。
[0024] 超高效液色谱-质谱联用检测条件：仪器：Waters Maldi Synapt Q-TOF MS ;色 谱仪 UHPLC:Waters Acquity UPLC;检测器 UV detector :Waters Acquity PDA;色谱柱： Acquity BEH C18 (1. 7 y m ；50 X 2. 1mm I. D.) 〇
[0025] 流动相：流动相A相为乙腈，B相为0.lmol/L甲酸；洗脱梯度：0min，5%A;8min， 30 %A;lOmin，80 %A; 13min，100 %A;14min，100 %A; 14.lmin，5 %A。流速，0? 3mL/min。 质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描模式；锥孔电压，30V;毛细管电压，3.OkV;通道1碰 撞能量，6eV;通道2碰撞能量，20eV;离子源温度，100°C ;脱溶剂气温度，400°C ;扫描范围， 50-1500Da〇
[0026] 表1超高效液色谱-质谱联用检测结果
[0027]
[0028] 实施例2沙糖橘橘络提取物主要成分的UPLC-MS质谱图及分子断裂分析
[0029] 如图2 (a)所示，1号峰负离子的m/z为741，为[M-HF峰，表明1号峰的分子 量为742,其主要碎片为597、433、271、151，由于母核离子受到碰撞电压，而糖苷与母核 离子的C-0键在轰击过程中较容易断裂，所以我们判断为4'位的葡萄糖苷首先断裂， [M-H-gluF峰（glu，葡萄糖）的m/z为597,之后A环上的芸香糖中的鼠李糖苷和葡萄糖 苷C-0键断裂，[M-H-glu-rhaF峰（rha，鼠李糖）的m/z为433,进一步7位的C-0键断裂， [M-H-glu-rutr峰（rut，芸香糖）的m/z为271，[M-H-glu-rut] ^峰发生逆狄尔斯-阿德尔 (Retro Diels-Alder)裂解得到m/z为151的色谱峰。根据分子量和分子碎片断裂方式确 定该化合物为柚皮芸香苷-4' -葡萄糖苷。
[0030] 如图2 (b)所不，2号峰负离子的m/z为579,为[M-H]峰，表明2号峰的分子量为 580,其主要碎片为271、151。首先碰撞导致A环7位置的糖苷C-0键断裂，[M-H-rut]_峰 的m/z为271，[M-H-rutiT峰发生逆狄尔斯-阿德尔（Retro Diels-Alder)裂解得到m/z为 151的色谱峰。根据分子量和分子碎片断裂方式确定此化合物为柚皮苷。
[0031] 如图2 (c~d)所不，3号峰和4号峰均为负尚子的m/z为609,为[M-H]峰，表明 2号峰的分子量为610,其主要碎片为301、151。首先碰撞导致A环7位置的糖苷C-0键断 裂，失去一分子芸香糖苷，[M-H-rutF峰的m/z为301，[M-H-rutK峰发生逆狄尔斯-阿德 尔（Retro Diels-Alder)裂解得到m/z为151的色谱峰。因为相对分子质量相同，我们推 测这两种物质为同分异构体。而橙皮苷和新橙皮苷这一对同分异构体广泛存在于橘属类水 果中，且分子量与断裂方式与此相符，并且橙皮苷会比新橙皮苷出峰时间早，所以判断3号 峰为橙皮苷，而4号峰为新橙皮苷。
[0032] 如图2 (e)所不，5号峰负离子的m/z为593,为[M-H]峰，表明5号峰的分子量为 594,其主要碎片为309、285。首先碰撞导致A环7位置的糖苷C-0键断裂，失去新橙皮苷 糖，[M-H-308r峰的m/z为285,是异樱花素的母核离子，而失去的新橙皮苷糖负离子m/z为 309。根据分子量和分子碎片断裂方式确定该化合物为枸橘苷。
[0033] 如图2 (f)所不，6