绣球菌多糖提取物在制备治疗神经退行性疾病药物的用图
【技术领域】
[0001]本发明公开了绣球菌多糖提取物在制备治疗神经退行性疾病药物的用途，涉及医药技术领域。
【背景技术】
[0002]帕金森病(PD)是一种慢性中枢神经系统退化性失调。它会损害患者的肢体功能，语言能力等，临床表现为休息性震颤、僵直、运动迟缓和姿势不稳定性与认知和情感障碍。它的病因目前仍不明确，但其主要病理特征为黑质致密部中多巴胺能神经元的损失和被称为路易体的胞浆内包含体的存在，也没有明显疗效的药物公开使用。
【发明内容】
[0003]本发明提供了绣球菌多糖提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，具有明显的医疗效果。
[0004]本发明公开了该提取物的制备方法，可以用于工业化生产。
[0005]本发明进一步公开了所述提取物在神经保护作用方面的药物应用。
[0006]本发明的绣球菌诱变菌株:在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址:武汉武汉大学，保藏日期:2015年5月3日，分类名称:绣球菌SC031; Sparassis crispa SC031，保藏登记号为 CCTCC N0:M2015275o
[0007]本发明的具有神经保护作用的提取物的制备方法如下所述:
将绣球菌SC301经发酵罐得到发酵液，以4000~5000转/分钟离心5~10分钟，弃上清，沉淀冻干，得到绣球菌伞菌粉，菌粉按照100倍量80°C热水提取2次，每次3小时，过滤并回收提取液并浓缩至室温相对密度为1.15-1.20，真空干燥，即得绣球菌SC031多糖提取物。
[0008]本发明的积极效果在于:提供了绣球菌SC031多糖提取物在提高记忆力和改善认知功能的医用用途，神经保护作用明显，对预防和治疗帕金森病及老年痴呆病的效果也十分显著。
【附图说明】
[0009]图1 NNKOO19对6-OHDA损伤的DPC12细胞的存活率的影响，细胞由NNKOO19(10 μ M，20 μ M)预处理3h，而后加入100 μ M 6-OHDA处理24h。数据均以对照组的百分比呈现，相比对照组 ###p<0.001，相比模型组(100 μ M 6-OHDA) _ρ〈0.001。
[0010]图2 NNKOO19对6-OHDA损伤的DPC12细胞的修复作用，细胞由ΝΝΚ0019 (20 μΜ)预处理3h，而后加入100 μ M 6-OHDA处理24h，control为空白组，model为模型组。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。
[0012]本发明指出一种绣球菌多糖提取物，具有明显神经保护作用，可在治疗或预防老年痴呆和帕金森药物或保健品中应用。
[0013]实施例1:
绣球菌多糖提取物的制备
将绣球菌SC031经发酵罐得到发酵液，以4000~5000转/分钟离心5~10分钟，弃上清，沉淀冻干，得到绣球菌伞菌粉，菌粉按照100倍量80°C热水提取2次，每次3小时，过滤并回收提取液并浓缩至室温相对密度为1.15-1.20，真空干燥，即得绣球菌多糖提取物。
[0014]实施例2:
绣球菌SC031多糖提取物对神经毒素6-OHDA损伤的已分化PC12细胞的保护作用本发明以细胞存活率为指标，通过MTT法检测的结果，反映绣球菌多糖提取物对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用大小，以说明其神经保护作用。
[0015]取对数生长期的PC12细胞，用完全培养基稀释成3*105个/ml的细胞悬液，每孔100 μ I接种于96孔板，置于37°C，5% C02培养箱中培养24h。移去培养基，加入100 μ I的绣球菌多糖提取物溶液(终浓度4 μ g/ml，8 μ g/ml，由基础培养基作为溶剂配制)，模型组和对照组分别加入100 μ I基础培养基，每组4个复孔。药物预处理3h后，在给药组与模型组分别加入6-OHDA (终浓度为100 μπιο?/?)，培养24h，加入5mg/ml的MTT 10 μ 1，37°C培养箱中培养4h。弃去上清后每孔加入DMSO 150 μ 1，震荡均勾，于540nm波长处测定各孔吸光度值来反映PC12细胞的存活率。
[0016]上述MTT测定结果显示(图1)，在只加入6-OHDA时，细胞存活率较对照组明显下降，说明6-OHDA对PC12细胞具有明显的损伤作用；绣球菌多糖提取物与6-OHDA共孵育时，可以明显抑制细胞存活率的下降，并随浓度的增加而增强，说明绣球菌多糖提取物具有显著的神经保护作用。
[0017]6-OHDA损伤PC12细胞模型是研宄帕金森病常用的神经细胞模型，结合以上化学分析，可见，NNKOO19具有神经保护作用，并有一定的浓度依赖性。
[0018]实施例3:
上述实施例1绣球菌SC031多糖提取物样品对神经毒素6-OHDA造成的PC12细胞线粒体的功能异常的修复作用
分子探针JC-1可以用来测定线粒体膜电位。JC-1是一种亲脂性的阳离子染料，能选择性地进入线粒体。当膜电位升高时能从绿色到红色可逆性地改变(Cossarizza et al.1993)。健康细胞中线粒体膜电位较高，JC-1能自发形成被称为J-aggregates具有强烈的红色荧光的络合物。另一方面，凋亡或不健康的细胞具有较低的线粒体膜电位，JC-1仍然处于单分子构造，它仅能显不出了绿色焚光(Cossarizza et al.1993)。
[0019]取对数生长期的PC12细胞，用完全培养基稀释成3*105个/ml的细胞悬液，每孔Iml接种于6孔板，置于37°C，5% C02培养箱中培养24h。移去培养基，加入Iml的绣球菌多糖提取物(4 μ g/ml, 8 μ g/ml)，模型组和对照组分别加入Iml基础培养基。药物预处理3h后，在给药组与模型组分别加入6-0HDA(终浓度为100 μπιο?/?)，培养12h。用2 μΜ的JC-1在37°C下处理10分钟((Sigma-Aldrich，USA)。洗涤三次后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次后，使用荧光显微镜(Carl Ziess)观察线粒体中的荧光颜色变化。
[0020]上述线粒体膜电位变化实验结果(图2)显示，只加入6-OHDA的模型组的绿色荧光量与红色荧光比例与对照组相比明显升高，说明6-OHDA导致了 PC12细胞线粒体的损伤，致其功能异常。而在6-OHDA与绣球菌多糖提取物同时作用时，绿红荧光比显著降低，说明绣球菌多糖提取物具有修复6-OHDA对PC12细胞线粒体损伤的功能，可知绣球菌多糖提取物对有可能是通过在凋亡过程阻止其进一步发展，从而对神经细胞起到保护作用。
【主权项】
1.绣球菌SC031多糖提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。2.如权利要求1中所述具有神经保护作用的绣球菌SC031多糖提取物的制备方法，其由以下步骤制备: 将绣球菌SC031经发酵罐得到发酵液，以4000~5000转/分钟离心5~10分钟，弃上清，沉淀冻干，得到绣球菌伞菌粉，菌粉按照100倍量80°C热水提取2次，每次3小时，过滤并回收提取液并浓缩至室温相对密度为1.15-1.20，真空干燥，即得绣球菌多糖提取物。
【专利摘要】本发明提供了绣球菌多糖提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，涉及医药技术领域。用发酵、乙醇提取、真空干燥制备的绣球菌多糖提取物，经体外实验，证明具有显著的神经保护活性作用。本发明制备方法简单，成本低廉，可用于制备治疗神经退行性疾病的药物，如帕金森病，老年痴呆症等。CCTCC NO:M201527520150503
【IPC分类】A61P25/28, C08B37/00, A61K31/715
【公开号】CN104958314
【申请号】CN201510285844
【发明人】王迪, 胡爽, 张峻榕, 曾浩, 权宇彤, 逯家辉, 闫国栋, 滕利荣
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月29日