金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫疫苗技术领域，特别涉及一种金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫 保护应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus auresu，S. Aureus)是引起社区和医院感染的 最主要的病原菌之一，目前尚无防控该菌感染性疾病的理想疫苗。金黄色葡萄球菌分泌系 统所产生的毒力因子是其重要的致病因素，其中VII分泌系统是新近发现的，EsxB是VII分 泌系统分泌的ESAT-6样毒力蛋白，研宄表明EsxB蛋白编码基因的缺失导致该菌致病力的 大大减弱。
【发明内容】
[0003] 为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种金黄色葡萄球菌 EsxB蛋白的免疫保护应用。
[0004] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保 护应用，通过将金黄色葡萄球菌EsxB蛋白制备为用于防控金黄色葡萄球菌感染的EsxB疫 苗。
[0005] 所述的EsxB疫苗的制备方法，以EsxB蛋白：氢氧化铝佐剂质量比为I :2. 5的比例 配制获得EsxB疫苗。
[0006] 本发明通过我们前期制备的重组EsxB蛋白免疫小鼠制备相应的抗体，通过抗体 的体外杀菌试验和细菌攻击小鼠试验，检测小鼠体内的免疫相关细胞因子，揭示了 EsxB蛋 白的免疫保护作用，应用该蛋白制备了有效防控金黄色葡萄球菌感染的疫苗。
[0007] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0008] 本发明首次揭示了 EsxB蛋白的免疫保护作用，应用该蛋白制备了有效防控金黄 色葡萄球菌感染的EsxB疫苗，并且获得的EsxB疫苗对于防控金黄色葡萄球菌感染具有显 著的效果。
【附图说明】
[0009] 图1为实施例1中免疫小鼠的生存率检测结果图。
[0010] 图2为EsxB免疫组小鼠免疫相关因子IFN-γ和IL-17的相对表达量的结果图； 其中，A为免疫相关因子IFN-Y的相对表达量结果图；B为免疫相关因子IL-17的相对表达 量结果图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1
[0012] I. EsxB疫苗的制备
[0013] 以EsxB蛋白/氢氧化铝佐剂质量比为I :2. 5的比例分别配制EsxB疫苗。
[0014] 2.免疫 BALB/c 小鼠
[0015] 免疫小鼠：
[0016] EsxB疫苗组：在第1、7、21天，每只四周龄的小鼠背部皮下注射200 yL含200 yg/ mL EsxB和500 μ g/mL氢氧化铝佐剂的疫苗，第28天静脉取血，检测抗EsxB抗体的产生。
[0017] 对照组：在第1、7、21天，每只小鼠背部皮下注射200 μ L含500 μ g/mL氢氧化铝佐 剂的疫苗，第28天静脉取血。
[0018] 免疫小鼠后续试验：
[0019] DELISA检测小鼠血清抗EsxB抗体的产生
[0020] ELISA检测小鼠血清抗EsxB抗血清的效价的具体方法为：
[0021] (1)将获得的小鼠血液，离心3000rpm，lOmin，收集血清，置-20°C冰箱保存备用；
[0022] ⑵将抗血清37°C冻融，将第一次免疫（一免）后获得的抗血清1 :10、1:500、 1:1000、1:5000 稀释，将二免所得的抗血清 1:500、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000、 1:500000、1:1000000 稀释；
[0023] (3)将纯化的抗原（EsxB蛋白）用包被液稀释至20ng/ μ 1，每孔100 μ 1体积包被 96孔聚苯乙烯ELISA板，放4°C过夜，弃去包被抗原；
[0024] (4)每孔加入缓冲液PBST 350 μ 1，浸泡3min后，弃去洗涤液，拍干；
[0025] (5)再重复⑷步骤2次，拍干；
[0026] (6) 10%的小牛血清封闭Ih (室温），洗绦，步骤同⑷和（5);
[0027] (7)每孔加入待检血清100 μ 1，37°C水浴孵育lh，洗绦，步骤同⑷和（5);
[0028] (8)每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人HRP-IgG 100 μ 1，37°C水浴孵育lh， PBST洗涤5次，步骤同⑷和（5)，拍干；
[0029] (9)每孔中各加入底物缓冲液A、B各50 μ 1，混勾，避光孵育30min ;
[0030] (10)每孔加入2mol/L硫酸100 μ 1终止反应，混勾，酶标仪测定OD45tl值。
[0031] 结果显示，ELISA法检测小鼠 EsxB抗血清的效价，一免后第21天其效价为 1:5000,二免后第7天（即一免后第28天）其效价为1:100000。而对照小鼠每次检测效价 均为阴性。
[0032] 2)补体介导的抗体杀菌试验
[0033] (1)将金黄色葡萄球菌的标准菌株ATCC29213接种于3ml LB肉汤，37°C培养12小 时至对数生长期。用0. 9% NaCl (生理盐水）调至菌液浓度OD6tltl= 0. 1 (约I X 10 7ml)，再 用生理盐水稀释至约1.0 X IO4个菌/ml备用；λ
[0034] (2)免疫小鼠28天的血清37°C冻融，混合，56°C 30min灭活补体，然后用生理盐水 以 1:10、1:50、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000 稀释后取各 0· Iml,分别加入 调节好的菌液〇. lml、0. 2ml补体和0.6ml LB肉汤，混合后37°C孵育2h作为杀菌作用时间；
[0035] (3)充分混匀混合菌液，取0.1 ml再加入0. 9ml LB肉汤，使每毫升含细菌约为 I X IO2个；将菌液均匀涂于预先制备好的血琼脂平皿，37°C培养过夜24小时后记数菌落； 每次试验设血清对照（对照组小鼠血清1:10稀释加补体）和补体对照（实验小鼠血清1:10 倍稀释不加补体）；以50%杀菌的血清最高稀释度为抗体杀菌效价；
[0036] (4)每份抗血清均一式三份，取平均值。
[0037] 小鼠 EsxB抗体杀菌实验结果见表1。以50%杀菌（52个菌落/平板）的小鼠 血清最高稀释度为抗体杀菌效价，本实验的有效抗体杀菌效价1:4000。小鼠血清10、50、 250、500、1000、2000、4000稀释后的抗体杀菌实验结果与对照组相比较，结果有统计学差异 (Ρ〈0· 05) 〇
[0038] 表1抗EsxB抗体杀菌实验结果
[0039]
【主权项】
1. 一种金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护应用，其特征在于：通过将金黄色葡萄球 菌EsxB蛋白制备为用于防控金黄色葡萄球菌感染的EsxB疫苗。
2. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护应用，其特征在于：所 述的EsxB疫苗的制备方法为，以EsxB蛋白：氢氧化铝佐剂质量比为I :2. 5的比例配制获得 EsxB疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护应用，属于免疫疫苗技术领域。所述的金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护应用，通过将金黄色葡萄球菌EsxB蛋白制备为用于防控金黄色葡萄球菌感染的EsxB疫苗。所述的EsxB疫苗的制备方法为，以EsxB蛋白：氢氧化铝佐剂质量比为1：2.5的比例配制获得EsxB疫苗。本发明首次揭示了金黄色葡萄球菌EsxB蛋白的免疫保护作用，应用该蛋白制备了有效防控金黄色葡萄球菌感染的EsxB疫苗，并且获得的EsxB疫苗对于防控金黄色葡萄球菌感染具有显著的效果。
【IPC分类】A61P31-04, A61K39-085
【公开号】CN104873963
【申请号】CN201510221144
【发明人】张海方, 杜鸿, 王敏, 周惠琴, 谢小芳
【申请人】苏州大学附属第二医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月4日