一种聚离子胶束纳米粒子的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药材料领域。具体涉及一种基于阳离子细胞穿透肽与羧甲基壳聚糖的聚离子胶束纳米粒子的制备方法及其作为水溶性治疗试剂载体方面应用。
【背景技术】
[0002]聚离子胶束(Poly1n complex micelles, PICMs)是由两种或两种以上带相反电荷的聚合物自组装形成的致密粒子。由于具有亲水段，它能稳定的分散在水相中。PICMs广泛用于纳米反应器，生物传感器，核磁共振成像剂的制备。然而，PICMs作为治疗试剂(光敏剂、酶、蛋白、肝素、阿霉素和核酸等)的载体才是目前研宄的热点。这是由于作为治疗试剂的载体，PICMs具有以下优点:(I)包载带电荷治疗试剂越过生物环境屏障，这是由于PICMs具有一层水化层，能够避免肝脏和脾脏的单核吞噬细胞系统清除，从而延长血液循环时间；
[2]PICMs的粒径为30nm到200nm，从而避免了被肾脏快速清除，同时通过增强透过和滞留效应(EPR effect)将药物被动传输到肿瘤部；(3)将特定的靶向配体链接在PICMs上可以达到主动靶向的作用；(4)作为药物的载体，PICMs能够有效得包载药物，避免泄漏和相关酶降解。
[0003]壳聚糖(聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖)是一种广泛存在于自然界的甲壳素经过脱乙酰作用得到的多聚糖。壳聚糖的无毒性、生物可降解性、生物相容性等特点使其广泛应用于生物医药中，如:药物载体系统、基因载体、伤口敷料、组织工程等。但不溶解于水的弊端使壳聚糖的发展受限。羧甲基壳聚糖(Carboxymethly chitosan, CMCS)是壳聚糖羧甲基化后的壳聚糖衍生物，其具有良好的水溶性，并且同时兼具良好的稳定性能以及生物可降解性，逐渐成为研宄的热点。O-羧甲基壳聚糖是羧甲基壳聚糖研宄最为广泛的一种类型，分子中包含大量羧基的同时，也含有氨基，是一种两性离子聚合物，具有无毒性、生物可降解性、生物相容性、抗菌和真菌活性等优点，因此在生物医药中备受关注。
[0004]细胞穿透肽(Cell penetrate peptides，CPPs)是一类具有特殊细胞膜穿透功能的短肽，是一类由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽，具有很强的跨膜转运能力。根据其氨基酸的组成，可分为阳离子性CPPs和两亲性CPPs，其中阳离子性细胞穿莫肽中的氨基酸残主要为精氨酸和赖氨酸组成，这类CPPs主要包括:核转入激活因子Tat蛋白有效区域，Tat-(47-57) (YGRKKRRQRRR)，小分子寡聚精氨酸(Rn)、小分子寡聚赖氨酸等。CPPs可以充当药物分子的运载工具，将包括亲水性蛋白质、多肽、核酸(DNA、siRNA和miRNA)、小分子药物、光敏剂、造影剂等在内的多种分子，通过共价键或者非共价键的形式与目标分子链接，高效低递送到细胞内。尽管CPPs能够有效地而广泛地介导外源性物质进入细胞，但是单独的多肽半衰期较短，并且缺乏病灶组织和细胞特异性，能够进入几乎所有的细胞，同时作为阳离子大分子，容易与血浆中带负电性血浆蛋白等相互作用而导致聚集，并被机体免疫系统清楚，因此限制了其临床的应用。为了解决以上问题，目前研宄较多的是将CPPs与其它靶标分子结合，或者通过化学反应链接上PEG分子，或者结合到已经构建好的纳米载体上，利用纳米载体具有的特殊理化性质，进行物质的运输。
[0005]当前聚离子胶束的形成，大部分是聚合物-聚合物之间相互作用形成，将CPPs作为形成聚离子胶束的组成成分，与羧甲基壳聚糖自组装形成纳米胶束，不牵涉复杂的化学反应以及任何有毒溶剂，并作为水溶性治疗试剂载体的应用，尚未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于提供一种基于阳离子细胞穿透肽-羧甲基壳聚糖聚离子胶束纳米粒子的制备方法。本发明提供的制备方法简单易操作，绿色环保，不涉及繁琐的化学反应和有毒的有机化学试剂，利于工业化生产。
[0007]本发明的另一目的在于将所述的阳离子细胞穿透肽-羧甲基壳聚糖聚离子胶束纳米粒子应用于水溶性治疗试剂的载体上。
[0008]为实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种纳米胶束的制备方法，是通过活性成分O-羧甲基壳聚糖和阳离子细胞穿透肽在缓冲溶液中按照一定的质量比，通过正、负电荷间的静电相互作用，自组装形成纳米胶束。
[0009]一种聚离子纳米胶束纳米粒子，其特征在于，由多肽与羧甲基壳聚糖组成；所述多肽为水溶性、阳离子性、且具有细胞穿透功能的多肽。
[0010]进一步，所述多肽为寡聚精氨酸Rn、寡聚赖氨酸Kn、HIV-1的TAT蛋白功能区TAT肽、HIV-lRev、低分子量鱼精蛋白中的至少一种；所述羧甲基壳聚糖为O-羧甲基壳聚糖，取代度为80% -95%，分子量为50-110KDa。
[0011]进一步，，粒径为100-250nm,表面带负电荷，Zeta电位为-35?_40mV。
[0012]所述聚离子胶束纳米粒子的方法，其特征在于，由羧甲基壳聚糖和阳离子性多肽在缓冲溶液中以非共价键形式，通过在溶液中自组装法制备而成。
[0013]进一步，其特征在于，包括以下步骤:
[0014](a)用pH = 7.4的Tris-Hcl缓冲溶液制备多肽溶液，羧甲基壳聚糖溶液；将上述两种溶液分别过0.22 μ m的微孔滤膜；
[0015](b)使用磁力搅拌器不断搅拌上述的羧甲基壳聚糖溶液中；
[0016](c)将步骤(a)所述的多肽溶液逐滴滴加到步骤(b)所述的羧甲基壳聚糖溶液中；
[0017](d)将步骤(C)得到的最后溶液搅拌，放置稳定，离心，用超纯水复溶，继续离心复溶，重复三次，得到聚离子胶束纳米粒子。
[0018]进一步，步骤(a)所述多肽溶液浓度为0.5-2mg/mL ;所述羧甲基壳聚糖溶液浓度为l-4mg/mL ;所述多肽溶液与羧甲基壳聚糖溶液体积比为1:2_1: 4。
[0019]进一步，将多肽溶液滴加到羧甲基壳聚糖溶液中的滴加速度为lmL/min，滴加过程中溶液需不断搅拌。
[0020]进一步，步骤(c)搅拌温度为25-30°C，时间为5-10min。
[0021]步骤(d)所述稳定时间为15_20min ;离心速度为10000-12000rpm，时间10_15mino
[0022]所述的聚离子胶束纳米粒子的应用，其特征在于，作为水溶性治疗试剂的载体。
[0023]所述水溶性治疗试剂的载体包括水溶性光敏剂、抗肿瘤药物、蛋白质或功能性核酸分子的载体。
[0024]优选地，所述羧甲基壳聚糖为O-羧甲基壳聚糖，取代度为80%~95%,分子量为50-11KDa0
[0025]优选地，所述阳离子细胞穿透肽包括寡聚精氨酸Rn、寡聚赖氨酸Kn、HIV-1的TAT蛋白功能区TAT肽、HIV-lRev、低分子量鱼精蛋白中的至少一种。
[0026]更一步优选地，所述阳离子细胞穿透肽为Tat (YGRKKRRQRRR)。
[0027]具体包括以下步骤:
[0028](a)用pH = 7.4Tris-Hcl缓冲溶液制备阳离子细胞穿透肽Tat溶液，羧甲基壳聚糖水溶液。将上述两种溶液分别过0.22 μ m的微孔滤膜，并将羧甲基壳聚糖溶液加入到25mL的圆底烧瓶中。
[0029](b)使用磁力搅拌器不断搅拌上述的羧甲基壳聚糖溶液，搅拌速度较佳为500r/
mino
[0030](c)将步骤(a)所述的多肽溶液逐滴滴加到步骤(a)所述的羧甲基壳聚糖溶液中，采用逐滴滴加方法。
[0031](d)将步骤(C)得到的最后溶液搅拌，放置稳定，离心，用超纯水复溶，继续离心复溶，重复三次，得到阳离子细胞穿透肽-羧甲基壳聚糖聚离子胶束纳米粒子。
[0032](e)将步骤(d)得到的阳离子细胞穿透肽-羧甲基壳聚糖聚离子胶束纳米粒子复溶到所需溶液中，即得到分散阳离子细胞穿透肽-羧甲基壳聚糖聚离子胶束纳米粒子溶液。