hMOF及其小肽在制备缓解或治疗人砷中毒药物方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及hMOF及其小肽在制备缓解或治疗人砷 中毒药物方面的应用，进而用于制备治疗与砷急性、尤其是慢性环境污染所致砷中毒的相 关解毒药物、缓解药物或药物组合物。
【背景技术】
[0002] 砷（又叫砒霜）作为饮用水中的主要污染源，已成为一个全球性的环境污染问题。 尽管如此，砷化合物仍作为药物，尤其是作为治疗急性早幼粒细胞白血病的最有效药物之 一，应用于临床几个世纪。但是，由于其对心脏、肝脏、肾脏、神经系统等的毒性作用，它的 应用受到了极大限制。另外，已经发现长期暴露或摄入砷化合物与各种癌症包括肺癌、肾 癌、前列腺癌、膀胱癌以及其它恶性肿瘤的发生密切相关。最近研宄发现砷化合物可以改 变细胞内组蛋白的翻译后修饰，如将外周血单核细胞暴露于饮用水，就可以使组蛋白H3K9 的乙酰基化水平降低。去除UROtsa(膀胱尿路上皮）细胞中的MOF(Malesabsentonthe first，多脏器功能衰竭蛋白），不仅导致细胞内的组蛋白H4赖氨酸第16位点（H4K16)的 乙酰基化水平降低，还可以使细胞对砷化合物的敏感性增加，说明hMOF及其所修饰的组蛋 白H4K16的乙酰基化修饰在保护细胞对砷化合物敏感性起着重要的作用。因此，可以推测 提高细胞内的hMOF的含量并增加其所修饰的组蛋白H4K16的乙酰基化水平，1)可以增加保 护细胞对砷化合物的敏感性；2)预防长期暴露于砷环境中可能导致的癌症的发生；3)治疗 生中毒所致的细胞内组蛋白H4K16的乙酰基化水平的降低，进而改善中毒症状。
[0003] 人源MOFQiumanM0F，hMOF)，又叫组蛋白乙酰基转移酶MYSTl，由431个 氨基酸组成，基因库编号为AF218501，其三维结构已经确定（WuH，MinJ，Loppnau PjWeigeltJ，SundstromM，ArrowsmithCHjEdwardsAM,BochkarevA,PlotnikovAN.The CrystalStructureofHumanMYSThistoneacetyltransferaseIincomplexwith acetylcoenzymeA.RCSB-PDB，2006)。hMOF最初是在果蝇中作为雄性X染色体的剂量补偿 系的重要组成成分而被发现（HilfikerA，Hilfiker-KleinerD，PannutiA，andLucchesi JC.MofjaputativeacetyltransferasegenerelatedtotheTip60andMOZhuman genesandtotheSASgenesofyeast,isrequiredfordosagecompensationin Drosophila.EMBOJ，1997，15:2054-60.)。人源hMOF是果蝇dMOF蛋白的直系同源，在体 内普遍存在和被表达。目前的研究结果显示，如果去除人细胞中的MOF不仅引起广范围的 H4K16乙酰基化的减少，进而导致DNA修复反应异常，而且还可以导致基因组不稳定，自发 的染色体畸变，细胞周期失调以及核形态的改变等（ReaSJouriG，andAkhtarA.Males absentonthefirst(MOF):fromfliestohuman.Oncogene，2007,26:5385-94.)〇 最 近还发现在人的乳腺癌或髓母细胞瘤中，MOF无论是在mRNA水平还是在蛋白表达量上 与正常组织相比都有明显的降低，而且组蛋白H4K16的乙酰基化程度与MOF的蛋白表达 量成正[:匕（PfisterSjReaS，TaipaleM,MendrzykF，StraubB，IttrichC，Thuerigen 0,SinnHP，AkhtarA，andLichterP.ThehistoneacetyltransferasehMOFis frequentlydownregulatedinprimarybreastcarcinomaandmedulloblastoma andconstitutesabiomarkerforclinicaloutcomeinmedulloblastoma.Int. J.Cancer, 2008, 122:1207-13.)，由此说明MOF的蛋白表达量及其酶活性可能与这些肿瘤 的发生有着密切的关系。
[0004] 关于砷化合物的急性中毒作用众所周知，近年来的研宄还证实许多癌症的发生可 能也与慢性砷中毒相关。因此，预防、治疗和缓解砷化合物中毒药物的开发也开始受到极大 重视。寻找和发现能够及时清除细胞内的砷化合物、并尽早恢复细胞的生物学功能、从而缓 解砷中毒所致的一些症状已经成为急需解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供hMOF及其小肽在在制备缓解或治疗人砷中毒药物方面的应 用。
[0006] 我们在研宄中发现暴露于砷化合物中的HeLa或293T细胞中的H4K16乙酰基化水 平明显减少，而hMOF(多脏器功能衰竭蛋白）及其H4K16ac(组蛋白H4第16位赖氨酸的乙 酰基化）酶活性在多种肿瘤发生时也明显降低。因此，我们推测慢性砷中毒所导致的细胞 内组蛋白H4K16的乙酰基化水平长期低下，可能是诱发肿瘤的原因之一。
[0007]hMOF作为组蛋白乙酰基转移酶，在细胞内主要乙酰基化组蛋白H4第16位赖氨 酸位点。我们的实验研宄证实砷化合物导致细胞内H4K16ac水平的低下可能和砷化合物 与hMOF间的相互结合有关。砷与hMOF直接结合后抑制了其乙酰化酶活性，从而使细胞内 H4K16ac水平低下。相反，过表达hMOF不仅可以降低细胞对砷化合物的敏感性，同时还可以 提高细胞内组蛋白H4K16的乙酰基化水平，从而减轻细胞的凋亡。因此，hMOF及其与砷结 合区域小肽（hMOF作为一个蛋白质可以缓解砷中毒；而能使hMOF发挥解毒功能的关键部位 是由24个氨基酸组成的区域小肽，这部分区域小肽可以直接结合砷，起到解毒作用。该区 域小肽作为药物开发更有意义）的应用，将对缓解砷化合物的中毒副作用具有实际临床意 义。
[0008] 本发明以293T(-种转染了腺病毒ElA基因且同时表达SV40大T抗原的永生化 人源肾胚上皮细胞株）和HeLa(子宫颈癌细胞）细胞株为研宄材料，通过细胞内瞬转并结 合免疫印迹实验、双荧光报告基因检测实验以及体外试管内乙酰基转移酶活性检测实验等 手段确定hMOF蛋白及其区域小肽（WLCEYCLKYMKYEKSYRFHLGQCQ)对砷毒性具有高效专一的 缓解或解毒作用。
[0009] 我们的实验表明，先瞬转hMOF质粒，再用砷处理细胞24小时后进行 MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐）实验（图6A)，结果证明hMOF可以 直接缓解或抑制砷对细胞的毒性，即减轻了细胞对砷的敏感性，说明hMOF对砷中毒有一定 的预防作用；在图6B实验中与对照组相比，砷（0.2~0.4yM，第2~3列）对组蛋白H4K16 乙酰基化的抑制作用通过瞬转hM0F(lyg)而改善，证明hMOF进入细胞后能与细胞内的游 离砷直接结合，降低了细胞内的砷浓度，从而减轻了砷对细胞的毒副作用，说明hMOF对砷 的毒副作用有一定的治疗或缓解作用；图6C实验中砷处理细胞导致细胞死亡数增加（第一 行），但是，砷处理细胞同时加入hMOF质粒（Iyg和2yg)，贝帳着剂量的增加，细胞死亡数 减少，再一次证明hMOF对砷中毒的缓解和治疗作用，也说明hMOF可以提高细胞对砷的对抗 能力。以上实验结果说明hMOF通过与细胞内的砷直接结合来缓解和中和砷的毒性，进而改 善细胞的生长环境，逆转由砷化合物所致的全细胞组蛋白H4上的第16位赖氨酸位点的乙 酰基化水平的降低，因此，hMOF可以在缓解砷中毒症状或砷中毒解毒剂方面得以应用。
【附图说明】
[0010] 图1 :三氧化二砷（As2O3)处理子宫颈癌细胞HeLa(A)或人胚肾细胞293T(B)后对 hMOF蛋白表达量及其所修饰的组蛋白H4K16乙酰基化水平水的影响。（A)细胞染色结果 (蓝色箭头所示）；(B)免疫印迹实验结果（蓝色箭头所示）；图1相关实验细节见实施例 1〇
[0011]A.细胞免疫染色分析结果图。砷处理HeLa细胞导致组蛋白H4K16的乙酰基化水 平明显降低。
[0012] 在人HeLa细胞（子宫颈癌细胞）培养液中加入As2O3，使其最终浓度达到0? 8yM。 48小时后，用hMOF和组蛋白H4K16位点乙酰基化的抗体进行细胞免疫荧光染色，然后在荧 光显微镜下观察hMOF的蛋白表达量和组蛋白H4K16乙酰基化水平。结果证实虽然hMOF的 表达量没有明显的改变，但是组蛋白H4K16的乙酰基化水平明显低下（图A箭头所示）。
[0013]B.蛋白经电泳分离后的WesternBlot分析结果图。砷处理293T细胞（人源胚胎 肾细胞）致组蛋白H4K16的乙酰基化水平明显降低（实施例1):
[0014]用0. 2~0. 8yM砷处理293T细胞，虽然hMOF的蛋白表达量没有改变（第一行）， 但是其所修饰的组蛋白H4第16位赖氨酸位点的乙酰基化（H4K16ac)水平随着砷浓度的增 加而降低（图B第二行箭头所示，与第一列相比，2~4列的H4K16ac水平逐渐降低），而其 他位点如H4K5ac(第三行）和H4K8ac(第四行）位点的乙酰基化水平没有明显改变。组蛋 白H2B(第五行）和GAPDH(最下行，磷酸甘油醛脱氢酶）是内参蛋白，表示电泳各泳道的总 蛋白上样量是一致的。
[0015] 图2:三氧化二砷（As2O3)处理293T细胞后对hM