基因导入用担体和基因导入剂以及它们的制造方法、以及向细胞导入基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因导入剂、使用该基因导入剂的基因导入方法、以及该基因导入剂的制造方法等，该基因导入剂的特征在于，在表面结合肝素或硫酸乙酰肝素，经由肝素或硫酸乙酰肝素结合有基因导入用载体。
【背景技术】
[0002]目前为止，开发了使用重组入目的基因的病毒，在作为靶标的细胞、组织和器官等中使该基因表达的基因导入方法。例如，开发了将重组入基因的病毒注入血管内，通过血流使其移动至靶器官的方法、以及使用注射器等直接注入靶器官的方法。但是，在这样的方法中，存在如下的问题:注入的病毒扩散，病毒浓度在所希望的部位降低而无法获得足够的基因表达水平，以及基因在非希望的部位表达而有可能引起不良作用。
[0003]另外，有使核酸或病毒附着于包覆了生物体分子的磁性颗粒，通过外部磁场使该磁性颗粒集聚在规定的地方而导入基因的方法(专利文献2)。另外，还有使病毒与结合有肝素的纤维状结构体结合，将该纤维状结构体导入靶器官等，由此选择性地使病毒感染与该纤维状结构体接触的细胞，从而使基因表达的方法(专利文献I)。另外，开发了附加了聚赖氨酸而具有氨基的珠(NH2残基型珠)，该珠具有神经纤维延伸作用。
[0004]但是，现在依然需要用于更为安全且自由地导入基因的技术。特别是由于需要定位手术且对患者的负担大，所以例如对帕金森氏病的基因治疗这样的向脑内的基因导入中，需要这样的技术。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本特开2011-201793号
[0008]专利文献2:日本国际公开第2005/095621号
[0009]专利文献3:日本特开2006-88131号
[0010]专利文献4:日本特表2008-500049号
[0011]专利文献5:日本特开2008-127454号
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献I:PNAS, Vol.106，N0.1, pp44_49 (2009)
[0014]非专利文献2:Infect.1mmun.1984, 43(2):561
[0015]非专利文献3:1nfect.Tmmun.February 1984vol.43n0.2561-566
[0016]非专利文献4:J B1med Mater Res A.2005Mar 15 ；72(4):389-98
【发明内容】
[0017]发明所要解决的课题
[0018]本发明的目的在于提供一种能够更加安全且自由地导入基因的新的基因导入方法。特别是在于提供一种向器官内的特定位置安全且自由地导入基因的方法。
[0019]用于解决课题的方法
[0020]为了实现上述目的，发明人使肝素经由氨基与纳米颗粒的表面结合，再使腺伴随病毒载体附着，注入大鼠脑内的特定位置，结果发现腺伴随病毒载体移动到与该纳米颗粒接触的神经细胞，然后该纳米颗粒通过巨噬细胞的吞噬作用从脑内被除去，从而完成了本发明。
[0021]基于该见解，本发明提供以下的⑴?(Xiv)。
[0022](i) 一种基因导入用担体，其包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。
[0023](ii) 一种基因导入剂，其是将基因导入用载体与(i)所述的基因导入用担体的上述基因导入用载体结合物质结合而成的。
[0024](iii)如(ii)所述的基因导入剂，其中，上述基因导入用载体为选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体中的I种以上。
[0025](iv)如(ii)或(iii)所述的基因导入剂，其中，上述官能团带有正电荷。
[0026](V)如(ii)?(iv)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述官能团为氨基。
[0027](vi)如(ii)?(V)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述纳米颗粒平均粒径为1nm ?lOOOnm。
[0028](vii)如(ii)?(vi)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述基因导入用载体结合物质为肝素和/或硫酸乙酰肝素。
[0029](viii)如(ii)?(vii)中任一项所述的基因导入剂，其中，上述纳米颗粒具有磁性。
[0030](ix) 一种使用基因导入剂向细胞导入基因的方法，其中，该基因导入剂包含纳米颗粒、基因导入用载体和基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在，上述基因导入用载体与基因导入用载体结合物质结合。
[0031](x) 一种向细胞导入基因的方法，其包括使基因导入用载体与基因导入用担体的基因导入用载体结合物质结合，制备基因导入剂的步骤，其中，上述基因导入用担体包含上述纳米颗粒和上述基因导入用载体结合物质，且具备引发由细胞进行的吞噬的上述官能团，上述基因导入用载体结合物质经由上述官能团中的一部分与上述纳米颗粒的表面结合，上述官能团中的另外一部分以不与上述基因导入用载体结合物质结合的状态存在。
[0032](xi)如(ix)或(X)所述的基因导入方法，其包括通过注射将上述基因导入剂引导至靶细胞的步骤。
[0033](xii)如(Xi)所述的基因导入方法，其中，上述纳米颗粒具有磁性，该基因导入方法包括对上述基因导入剂施加磁场而保持在注射部位的步骤。
[0034](xiii) 一种基因导入用担体的制造方法，该基因导入用担体包含纳米颗粒和基因导入用载体结合物质，该制造方法包括在表面具备引发由细胞进行的吞噬的官能团的纳米颗粒经由上述官能团中的一部分与上述基因导入用载体结合物质结合的工序。
[0035](xiv) 一种基因导入剂的制造方法，其包括使基因导入用载体与通过(xiii)所述的制造方法得到的基因导入用担体的上述基因导入用载体结合物质结合的工序。
[0036]另外，本发明还提供以下[I]?[13]。
[0037][I] 一种基因导入剂，其包含纳米颗粒，该基因导入剂用于在靶细胞、靶组织、或靶器官中导入基因，该纳米颗粒的特征在于，在表面经由键与肝素或硫酸乙酰肝素结合，经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入用载体结合。
[0038][2]如[I]所述的基因导入剂，其中，键为经由纳米颗粒上的氨基、巯基或者活性酯基的化学键、或者物理键。
[0039][3]如[I]或[2]所述的基因导入剂，其中，纳米颗粒的大小为1nm?100nm0
[0040][4]如[I]?[3]中任一项所述的基因导入剂，其中，纳米颗粒为磁性颗粒。
[0041][5]如[I]?[4]中任一项所述的基因导入剂，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[0042][6] 一种基因导入方法，其使用纳米颗粒向非人哺乳动物或所分离的靶细胞中导入基因，其中，该纳米颗粒的特征在于，在表面经由键与肝素或硫酸乙酰肝素结合，经由肝素或硫酸乙酰肝素与基因导入用载体结合。
[0043][7]如[6]所述的基因导入方法，其中，键为经由氨基、巯基或活性酯基的化学键、或者物理键。
[0044][8]如[6]或[7]所述的基因导入方法，其中，纳米颗粒的大小为1nm?lOOOnm。
[0045][9]如[6]?[8]中任一项所述的基因导入方法，其包括通过注射将纳米颗粒引导至靶细胞的步骤。
[0046][10]如[6]?[9]中任一项所述的基因导入方法，其中，纳米颗粒为磁性颗粒，该基因导入方法还包括施加磁场，将该磁性颗粒引导至靶细胞的工序。
[0047][11]如[6]?[10]中任一项所述的基因导入方法，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[0048][12] 一种包含纳米颗粒的基因导入剂的制造方法，其特征在于，包括:
[0049](i)使供氨基化合物或供巯基化合物与纳米颗粒反应，使氨基或巯基与纳米颗粒表面结合的工序；
[0050](ii)使肝素或硫酸乙酰肝素与结合了氨基或巯基的纳米颗粒结合的工序；和
[0051](iii)经由肝素或硫酸乙酰肝素，使基因导入用载体结合的工序。
[0052][13]如[12]记载的制造方法，其中，基因导入用载体选自仙台病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[0053]本发明中，“引发由细胞进行的吞噬的官能团”是指被巨噬细胞系细胞识别并能够引发该细胞的吞噬作用的官能团。“引发由细胞进行的吞噬的官能团”在存在于基因导入剂内的情况下，引发识别该官能团的巨噬细胞系细胞捕食作为生物体内异物的基因导入剂。“引发由细胞进行的吞噬的官能团”为了使巨噬细胞系细胞识别，优选表现为正电荷，作为这样的官能团，可以列举例如氨基。此外，巨噬细胞系细胞根据本发明涉及的基因导入用担体和基因导入剂的靶细胞、组织和器官的不同而