一种肿瘤药物靶向载体及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗肿瘤药物靶向载体及这种载体与抗肿瘤药物的偶联，以及所形成的一种抗肿瘤药物。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤已经成为当今威胁人类身体健康的重要疾病之一，全世界每年新增癌症病人在1000万以上，控制癌症已成为全球性卫生战略重点。化学治疗方法依然是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，传统的化学治疗方法主要是使用化学药物，如抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin, D0X)，来抑制肿瘤细胞的增殖并杀死肿瘤细胞，但大多数的化疗药物都没有专一性，会在抑制肿瘤组织的同时也损伤正常组织，所以，具有不可忽视的毒副作用，如造成免疫功能下降、骨髓抑制、心脏和肝脏毒性等。
[0003]为了克服化学药物治疗方面存在的不足，提高化学治疗药物的靶向性一一增加肿瘤组织的药物积累，降低药物在正常组织周围的分布一一是提高抗肿瘤效果的有效途径之一。为了提高抗肿瘤药物的靶向性，目前常用的方法是将抗肿瘤药物和不同的药物载体相结合，通过对药物载体进行适当的修饰，来提高药物载体靶向运输的能力，从而达到靶向治疗的目的。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种肿瘤药物靶向载体，同时本发明也提供了这种药物载体与其它抗肿瘤药物偶联的方式，以及由这一载体与一种具体的现有抗肿瘤药物偶联形成的抗肿瘤药物。
[0005]本发明所述的这种肿瘤药物靶向载体为口蹄疫病毒样颗粒。
[0006]本发明的肿瘤药物靶向载体与抗肿瘤化学药物的化学偶联方法是:用碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学偶联试剂活化肿瘤药物载体，然后再与其它抗肿瘤药物偶联。
[0007]本发明所用的肿瘤药物靶向载体与抗肿瘤化学药物的化学偶联方法是:将口蹄疫病毒样颗粒加入到由2-(N-吗啉)乙磺酸溶液溶解的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物中，在规定的时间内加入抗肿瘤药物进行偶联，偶联后将混合物转入组装缓冲液中，在组装缓冲液进行透析处理，所用的缓冲液为pH=8.0，由40 mM Tris-HCl,500 mM NaCl和10 mM CaCl2组成，经处理后偶联上抗肿瘤药物的口蹄疫病毒样颗粒滞留在透析袋内。
[0008]本发明的肿瘤药物靶向载体与抗肿瘤化学药物的一种具体化学偶联方法是:配制0.2 mol/L MES, I mol/L NaCl，pH 6.0 的 2_(N_ 吗啉)乙磺酸溶液；取0.5 ml 的 2_(N_ 吗啉)乙磺酸溶液在其中溶入0.4 mg碳二亚胺，另取0.5 ml的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液在其中溶入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺，依次将溶入碳二亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和溶入N-羟基琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液加入到Iml浓度为2mg/ml的口蹄疫病毒样颗粒溶液中，室温下活化15分钟，然后加入30 μ?浓度为5 mg/ml的D0X，调节pH=8.0，室温偶联15分钟，随后将反应物转入8000 MWCO的透析袋中进行透析，除去未偶联的物质得到目标物。
[0009]在众多药物载体中，病毒样颗粒(virus/virus-like particles，VLPsMtS—种自组装的天然纳米级生物材料，除了具有较大的表面积确保载药量的最大化、可通过缓释承载药物发挥持续治疗效果之外，由于病毒样颗粒在结构上和病毒粒子相同或相近，能够模拟自然病毒粒子利用特异受体与宿主细胞结合，而这些特异受体在肿瘤细胞中的表达水平显著提高，这为病毒样颗粒作为肿瘤药物载体的靶向优势提供了前提条件，从而保证携带的药物选择性进入细胞内部、发挥理想药效。
[0010]本发明以口蹄疫病毒样颗粒作为药物载体，通过优化的化学方法将其与抗肿瘤药物阿霉素(DOX)偶联，形成口蹄疫病毒样颗粒-阿霉素(FMD VLP-DOX)偶联物，借助于口蹄疫病毒样颗粒VPl中的RGD基序和肿瘤细胞表面过量表达的整合素受体结合，基于肿瘤细胞表面受体革E向定位于肿瘤细胞，可参考Mehra NK, Mishra V, Jain NK.,et al.Receptor-based targeting of therapeutics.Therapeutic delivery, Mar2013; 4 (3):369-394.，减小抗肿瘤药物对正常细胞的毒副作用。
[0011]为了提高抗肿瘤药物的靶向治疗作用，首次将抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和口蹄疫病毒样颗粒(FMDVLP)体外偶联，利用病毒样颗粒和口蹄疫病毒粒子在结构和生物特性上的相似性，借助口蹄疫病毒样颗粒表面的保守肽段一RGD和肿瘤细胞表面过量表达的整合素受体(integrin receptors)特异性结合，充分发挥FMDV-VLP双功能分子的作用--既是药物运载功能，又有靶向定位肿瘤细胞的功能。
[0012]其次本发明对偶联的方法进行了摸索和改进，通过提高温度，缩短了偶联时间，本发明在室温下半小时就可以完成全部偶联反应，而之前的偶联要在4°C过夜才能完成偶联反应(参见 Aljabali AA, Shukla S，Lomonossoff GP, Steinmetz NF, Evans DJ (2013)CPMV-DOX delivers.Mol Pharm 10: 3-10 和 Ashley CE, Carnes EC, Phillips GK,Durfee PN, Buley MD, et al.(2011) Cell-specific delivery of diverse cargos bybacter1phage MS2 virus-like particles.ACS Nano 5: 5729-5745.)。
[0013]将口蹄疫病毒样颗粒作为阿霉素的药物载体，可用于肿瘤细胞治疗。整合素受体已经被广泛修饰在各种肿瘤药物载体表面，从而来介导靶向运输抗肿瘤药物到肿瘤细胞，关于整合素受体在癌症治疗中的应用可以参考Mehra，N.K., Mishra, V., Jain,N.K., 2013.Receptor-based targeting of therapeutics.Therapeutic delivery 4,369-394.由于组装口蹄疫病毒样颗粒的VPl蛋白中有RGD基序，能够和肿瘤细胞表面过量表达的整合素受体特异性结合，从而发挥口蹄疫病毒样颗粒的药物载体作用，且无须对其表面进行靶向修饰，以此有效提高阿霉素的靶向治疗作用。在本发明中，利用口蹄疫病毒样颗粒自身所含有的RGD基序，作为靶向识别肿瘤细胞表面过量表达的整合素受体，这样就只需要一步偶联就可以得到靶向药物运载体，简化了其他药物运载体先偶联药物再对载体进行表面修饰的复杂过程，而且病毒样颗粒作为一种纳米级生物材料，综合了纳米材料和生物材料的优势，能够靶向运载药物并且可以起到药物缓释的作用。
【附图说明】
[0014]附图1电泳图，其中:A图，SDS-PAGE，Ianel纯化前蛋白，lane2切除HIS标签的衣壳蛋白，lane3偶联DOX后的衣壳蛋白，lane4标准蛋白maker。B图为紫外下图像，由于偶联了 D0X，所以在紫外下有条带。C图核酸电泳，未进行考马斯亮蓝染色，紫外下观察，Ianel为DOX，lane2为偶联前的病毒样颗粒，lane3为偶联后的病毒样颗粒。D图是考马斯亮蓝染色后，只有lane2和lane3有条带。说明病毒样颗粒偶联DOX后，分子量变大，在核酸电泳中和未偶联DOX的相比，位置后移。
[0015]附图2紫外连续光谱扫描结果曲线图，图中可见偶联物在270nm处和495nm有吸收峰。
[0016]附图3电镜照片，显示偶联DOX后，病毒样颗粒的组装情况。
[0017]附图4不同梯度浓度下，进行的细胞毒性试验，偶联物中含有的DOX和单独使用DOX的浓度一样。
[0018]附图5偶联物进入细胞情况进行示踪的荧光照片，从30min到2h，DAPI是核染料4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，560nm处激发的是FMDV-VLP 二抗FITC的荧光，用于示踪口蹄疫病毒样颗粒，495nm处是DOX激发后发出的红光，merge是三者的合并后的情况。
[0019]附图6对照组DOX进入细胞的情况。DAPI是核染料4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，495nm是DOX激发后发出的红光，merge是两者合并后的图片。
[0020]附图7偶联物与肿瘤细胞作用48h后，肿瘤细胞状况照片，DAPI是核染料4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，495nm处是DOX激发后发出的红光，merge是三者的合并后的情况。
【具体实施方式】
[0021]以下结合实施例对本发明进行解说。
[0022]1.FMDV-VLP 与 DOX 的化学偶联。
[0023]将0.4 mg碳二亚胺和0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺分别溶解到各0.5 ml 2- (N-吗啉)乙磺酸溶液中(0.2 mol/L MES, I mol/L NaCl，pH 6.0)，依次加入到Iml浓度为2mg/ml的口蹄疫病毒样颗粒溶液中，室温下活化15分钟，然后加入30 μ?浓度为5 mg/ml的D0X,调节pH=8.0，室温下偶联15分钟，随后将混合物转入8000 MWCO的透析袋中进行透析，4° C过夜并换2-3次透析液，除去未偶联的物质得到目标物。所使用的透析缓冲液为:40mM Tris-HCl，500mM NaCl,1mM CaCl2, pH=8.0。
[0024]2.FMDV-VLP-DOX偶联物性质的测定。
[0025]用12% 的 SDS-PAGE 和 0.8% 的 Agarose gel electrophoresis 分别检测偶联物是否获得，用紫外连续吸收光谱来检测偶联物的吸光率变化，并用电镜对偶联物的形态进行观测，结果表明，带