大菱鲆cd83分子作为疫苗佐剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是大菱鲆CD83作为疫苗免疫佐剂的应用。
【背景技术】
[0002] ⑶83分子属于I型免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig)超家族成员，分子量 约为45kDa，由胞外段、跨膜区和胞内段组成，其中胞外部分含有典型的免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)结构域。人⑶83由205个氨基酸组成，其中胞外段128个氨基酸，含 一个V型Ig功能区。在哺乳动物中，CD83是树突状细胞的特异性标志，参与T淋巴细胞和B 淋巴细胞的活化，激活吞噬细胞、中性粒细胞、NK辅助细胞和胸腺细胞。细菌脂多糖和细胞 因子（如TNF-a和白介素1 β )能够通过转录因子NF-kB促使⑶83基因表达上调。⑶83对 ⑶4+T细胞的发育过程具有关键的调节作用，在⑶83基因完全缺失的小鼠中，外周血⑶4+T 细胞数量大幅减少。除此之外，⑶83还参与B细胞的成熟和T细胞的激活。因此，⑶83在 淋巴细胞的激活及信号传导中具有重要作用。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种大菱鲆CD83分子作为免疫佐剂的应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 一种大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。
[0006] 进一步的说，大菱鲆CD83分子作为DNA疫苗的免疫佐剂的应用。
[0007] 所述⑶83分子的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀释液按体积比为1:1比 例混合。
[0008] 所述⑶83分子的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲液稀释至400ug/ml。
[0009] 所述CD83表达质粒是以大菱鲆cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR 产物与载体pBS-Τ连接，获得质粒pBS⑶83 ;用限制性内切酶EcoRV酶切pBS⑶83后回收 0. 6kb片段，与质粒pCN3连接，得⑶83表达质粒pSmCD83 ;
[0010]所述 Fl 为 5' -GATATCGCCACCATGTTCCCACATCACCTGA-3' ；R1 为 5' -GATATCAACATAC ACGGGCTTCCC-3'。
[0011] 本发明具有如下优点：本发明的CD83能够显著提高DNA疫苗的免疫保护效应，能 显著提高疫苗诱导的血清抗体效价和免疫保护效应。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0013] 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
[0014] 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。
[0015] 2.大肠杆菌用 Hanahan 方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)〇
[0016] 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。
[0017] 实施例1
[0018] ⑶83的表达质粒pSmCD83的构建：
[0019] 本发明的 CD83 分子的序列已公开（GenBank access ion No. ADM87603. 1)。
[0020] 以大菱鲆cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为：94°C 60s预变 性模板 DNA，然后 94°C 40s，59°C 60s，72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s，64°C 60s，72°C 60s，30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自 于"天根生化科技有限公司"，北京）于室温连接2 - 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌 DH5a后在含有lOOμg/ml安卡青霉素（Αρ)、40μ8/πι1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷 和24 μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑出白色 转化子，提取质粒，命名为质粒PBSCD83。将质粒pCN3(构建过程参见Jiao XD，Zhang M，Hu YH, Sun L. Construct ion and evaluat ion of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine 2009;27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收 5. 4kb 片段，同时将 pBS⑶83用EcoRV酶切回收0. 6kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接 2 - 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养 18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pSmCD83。通过DNA测序分析证明了 pSmCD83 为含有Ig结构域的CD83序列的表达质粒，其中pSmCD83质粒中CD83序列与GenBank accession 公开的 No. ADM87603. 1 的序列一致。
[0021] 所述LB组成成分按重量百分比计：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 钠，97. 5%蒸馏水。所述 Fl 为 5' -GATATCGCCACCATGTTCCCACATCACCTGA-3' ；R1 为 5' -GATA TCAACATACACGGGCTTCCC-3'。
[0022] 实施例2
[0023] 肿大细胞病毒DNA疫苗pCN75的构建
[0024] 以已报导的肿大细胞病毒 RBIV-Cl (Zhang BC，Zhang M，Sun B，Fang Y, Xiao Z,Sun L. Complete genome sequence and transcription profiles of the rock bream iridovirus RBIV-CLDis Aquat Org. 2013; 104:203-14.)为模板，采用 F2和 R2 为引物PCR 扩增肿大细胞病毒的0RF75基因。该基因编码一个由444个氨基酸组成的蛋白，该蛋白有一 个保守的ANK(ankyrin)结构域。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C40s，58°C 60s，72°C 90s，25个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体 pBS-T (购自于"天根生化科技有限公司"，北京）于室温连接2 - 4小时，连接混合液转化 到大肠杆菌DH5a后在含有l〇〇μg/ml安卡青霉素（Ap)、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-口引 哚-β -D-乳糖苷（X-gal)和24 μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)的LB固体培 养基上培养18 - 24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBS444。将质粒pCN3 用SmaI酶切，回收5. 4kb片段，同时将pBS444用EcoRV酶切回收0. 3kb片段。将上述回 收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2 - 4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含 有Ap(IOOygAil)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑取转化子，提取质粒，命名为 PCN75,即为DNA疫苗质粒。通过DNA测序分析证明了 pCN75含有具有ANK结构域的0RF75 序列。
[0025] 所述 F2 为 5' -GATATCATGGATGAGTACAATGCAGAGGGCT-3' ；R2 为 5' -GATATCACACATG CCCATGTCAACAT-3'。
[0026] 实施例3
[0027] ⑶83表达质粒pSmCD83的免疫应用
[0028] 步骤1)免疫大菱鲆
[0029] 将上述实施例1的pSmCD83和上述实施例2的DNA疫苗pCN75分别在PBS中稀释 至400ug/ml，将二者等体积混合，即为pCN75+pSmCD83混合液。将pCN75和pSmCD83分别 在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCN75稀释液和pSmCD83稀释液。将120条大菱鲆（重约 12. 5g)随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A组的每条鱼肌 肉注射0.1 ml pCN75稀释液，将B组的每条鱼肌肉注射0.1 ml pSmCD83稀释液，将C组的每 条鱼肌肉注射0.1 ml pCN75+pSmCD83混合液，将D组（对照组）的每条鱼肌肉注射0.1 ml PBS0
[0030] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0· 024% NaH2PO4,余量为水。
[0031] 步骤2)病毒悬液制备
[0032] 将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, Hu Y, Sun L. Characterizat ion of a megalocyt ivirus from cultured rock bream, Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege), in China.Aquac Res. 2012 ;43:556 - 64)于 PBS 中稀释至 lxl06copies/ml，即为病毒悬液。
[0033] 步骤3)抗体效价检测
[0034] 在上述步骤1)免疫后第30天，自每组鱼中取5条鱼，用酶联免疫吸附剂测定 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测血清中疫苗特异抗体水平（具体 方法参考文献 Sun Y, Liu C, Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15-1 ike surface ant igen. Fish Shellfish Immunol. 2011;30:273 - 9.)。结果表明，与对照鱼相比，免疫 pCN75 和 pCN75+pSmCD83组鱼产生的抗体效价分别为64和128,后者显著（P〈0.01)高于前者。
[0035] 步骤4)攻毒感染和免疫保护效应检测
[0036] 在上述步骤1)免疫后第30天，将4组的每条鱼腹腔注射IOOul上述步骤2)的病 毒悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总 死亡数目：A组，10条；B组，20条；C组，5条；D组，28条。利用下列公式计算相对免疫保护 效率（RPS):
[0037] RPS = IOOx(1 -免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比）
[0038] 由此得出免疫pCN75、pSmCD83、pCN75+pSmCD83组鱼的RPS分别为 64. 3% ,28. 6% ,82. 1%，其中免疫 pCN75+pSmCD83 组鱼的 RPS 显著（P〈0. 01)高于其它组。
[0039] 综上所述，pSmCD83是一种高效的疫苗佐剂，能显著提高疫苗诱导的血清抗体效 价和免疫保护效应。
【主权项】
1. 一种大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。
2. 按权利要求1所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：大菱 鲆CD83分子作为DNA疫苗的免疫佐剂的应用。
3. 按权利要求1或2所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于： 所述CD83分子的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀释液按体积比为1:1比例混合。
4. 按权利要求3所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：所述 ⑶83分子的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲液稀释至400ug/ml。
5. 按权利要求4所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：所 述CD83表达质粒是以大菱鲆cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物与载体 PBS-T连接，获得质粒pBSCD83 ;用限制性内切酶EcoRV酶切pBSCD83后回收0. 6kb片段，与 质粒pCN3连接，得CD83表达质粒pSmCD83 ; 所述Fl为 5' -GATATCGCCACCATGITCCCACATCACCTGA-3' ；R1 为 5'-GATATCAACATACACGG GCTTCCC-3'。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是大菱鲆CD83作为疫苗免疫佐剂的应用。大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。本发明的CD83表达质粒能显著提高疫苗诱导的血清抗体效价和免疫保护效应。
【IPC分类】A61P37-04, A61P31-20, A61K39-39, A61K48-00
【公开号】CN104689313
【申请号】CN201510096416
【发明人】孙黎, 李墨非
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月4日