一种聚谷氨酸pga包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于磁共振造影剂的制备领域，特别涉及一种聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁 性氧化铁纳米颗粒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 磁共振成像（MRI)技术是一种分辨率高的成像技术，具有较高的空间和断层成像 能力，MRI没有放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息，具有其他医学成像无可 比拟的优点。磁共振成像技术在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。但MRI的弱点是其 敏感性较低，而且不同器官或肿瘤组织的弛豫时间相互重叠使MRI诊断困难。近年来，通过 注射MRI造影剂的方法可以有效解决MRI敏感性较低的问题。因此选择合适的MRI造影剂 就显得尤为重要。
[0003] 超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒（SPIO)近年来在生物医学领域有着越来越广泛的 应用，尤其是在磁共振成像造影剂方面的应用更是受到了普遍的关注。SPIO纳米颗粒具 有独特的磁学性质以及较高的信号强度、较低的使用剂量、良好的生物相容性和较低的制 造成本等特点。目前已有商业化SPIO纳米颗粒作为MRI造影剂应用于临床疾病诊断。然 而，这些商业化的SPIO造影剂用于肿瘤分子影像领域时，还存在着诸多挑战。例如，商业化 SPIO造影剂往往弛豫率较低，不能达到对疫病灵敏检测的目的。
[0004] 采用温和还原法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIO)的结果表明，通过温和还 原法制备的四氧化三铁纳米颗粒尺寸较小，粒径均匀，并且表现出极高的r 2弛豫率（沈明 武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法。 中国发明专利，【申请号】201410182821. 1，申请日期：2014-4-30)。但是上述方法主要采用 携带正电荷的聚乙烯亚胺（PEI)作为稳定剂，需要进一步的功能化才可以用于细胞或肿瘤 MR成像。
[0005] 检索国内外文献，尚没有发现关于用温和还原法制备PGA包覆的SPIO纳米颗粒作 为MRI造影剂研宄的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁性氧化铁纳 米颗粒的制备方法，本发明采用温和还原法制备SPIO-PGA用于MR成像造影剂，制备方法简 单，反应条件温和，易于操作处理，所用的稳定剂为廉价和环境友好型的聚谷氨酸，具有产 业化实施的前景。
[0007] 本发明的一种聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：
[0008] 将三价铁盐溶解于水中，搅拌，通入氮气，并逐滴加入聚谷氨酸PGA溶液，随后边 搅拌边逐滴加入亚硫酸钠 Na2SO3水溶液，得到混合溶液，然后移入水浴中，边搅拌边滴加 NH3 · H2O,反应20-30min，然后在室温条件下反应0. 5-1. 5h，离心，透析，即得聚谷氨酸PGA 包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
[0009] 所述三价铁盐为FeCl3 · 6H20 ;水为超纯水。
[0010] 所述三价铁盐溶解于水中后的浓度不高于13mg/mL ;聚谷氨酸PGA的分子量为100 万。
[0011] 所述通入氮气时间为5-15min。
[0012] 所述搅拌转速均为1000-5000转/分钟。
[0013] 所述 FeCl3 · 6H20 与 Na2SO3的质量比为 7:1 ;FeCl 3 · 6H20 与 PGA 的质量比为 7:1 ; FeCl3 · 6H20与质量分数为91 %的NH3 · H2O的质量比为4:5。
[0014] 所述FeCl3 · 6H20溶液滴加Na2SO3后颜色从红棕色变为黄色后再转移至水浴中滴 加 NH3 · H2O0
[0015] 所述水浴温度为50-65 °C。
[0016] 所述离心转速为5000-8000转/分钟。
[0017] 所述透析为采用截留分子量为8000-14000的透析袋，透析用水为蒸馏水，透析三 天，每天换水三次。
[0018] 所述聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为制备用于肝脏和肿瘤模 型的T2磁共振成像诊断的造影剂的应用。
[0019] 本发明采用在还原法制备纳米颗粒的过程中，向反应溶液中加入聚谷氨酸（PGA)， 从而制备PGA包覆的SPIO纳米颗粒（SPIO-PGA)。PGA具有优良的水溶性、超强的吸附性和 生物可降解性，可降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料。PGA分子 链上丰富的-COOH使其具有良好的生物相容性，在水溶液中呈负电性，不需要进一步修饰 就可以进行生物应用，减少了工作量，同时降低了生产成本。丰富的-COOH也可进一步修 饰功能化基团，为本发明的进一步深入研宄开发提供了很大的空间。表征数据表明，制备 的SPIO-PGA具有良好的水溶性和胶体稳定性，经过一系列生物学实验考察，本发明制备的 SPIO-PGA具有良好的生物相容性和血液相容性，而且其r2的弛豫率高达333. TmlT1iT1,具有 显著的T2加权的MRI成像效果，有望作为MRI造影剂应用于临床疾病诊断。
[0020] 本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳 定性、血液相容性和生物相容性。经过裸鼠体内成像造影实验，本发明制备的SPIO-PGA纳 米颗粒具有显著的造影效果，在磁共振成像造影剂领域有潜在的应用价值。
[0021] 本发明使用透射电子显微镜（TEM)、X射线衍射分析（XRD)、Zeta电势及动态光散 射分析（DLS)、傅里叶转换红外光谱分析（FTIR)、热重分析（TGA)、电感耦合等离子体原子 发射光谱法（ICP-OES)和磁共振分析（MR)等手段表征制备的SPIO-PGA纳米颗粒。然后利 用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性，并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌； 通过溶血实验评价本发明的血液相容性。最后进行体外细胞和裸鼠体内肿瘤模型的磁共振 成像实验，考察SPIO-PGA纳米颗粒的体外细胞和体内肿瘤模型的MR成像效果。此外，通过 组织分布实验研宄SPIO-PGA纳米颗粒在生物体内的代谢过程。具体测试结果如下：
[0022] (1)透射电子显微镜（TEM)测试结果
[0023] 本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒的TEM图片和粒度分布直方图（参见附图1)表 明：所形成的SPIO纳米颗粒的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，没有明显的团聚现象，在溶 液中分散良好而且不发生聚集，经统计分析得出颗粒直径大小为5. 3±2. 6nm，粒径分布在 较窄的范围内。
[0024] (2) X射线衍射分析（XRD)测试结果
[0025] 本方法制备的PGA包裹的SPIO纳米颗粒的XRD图谱（参见附图2)表明：所制备 材料的衍射峰在位点220、311、400、422、511和440处与四氧化三铁纳米颗粒的衍射峰位点 非常吻合。衍射峰峰型尖锐，说明反应制得了晶型良好的四氧化三铁晶体。
[0026] (3) Zeta电势和动态光散射仪（DLS)测试结果
[0027] Zeta电势结果显示SPIO-PGA纳米颗粒的表面电势为-38. 6mV，水动力学直径为 217. 5±3· 75nm〇
[0028] (4)傅里叶变换红外光谱（FTIR)测试结果
[0029] 本方法制备的PGA包裹的SPIO纳米颗粒的FTIR图谱（参见附图3)表明：在 IOSOcnr1(C-O) UAlOcnT1(O-H)、1637CHT1 (C = 0)三处，相比于裸露的四氧化三铁纳米颗粒， 吸收峰强度明显增加。这说明PGA很好的包裹在了 SPIO纳米颗粒上，形成包覆的纳米结构。
[0030] (5)热重分析仪（TGA)测试结果
[0031] 本方法制备的SPIO-PGA纳米颗粒的TGA分析结果（参见附图4)表明SPIO-PGA 纳米颗粒中四氧化三铁含量约为75. 6%，PGA的上载量达到了 24. 4%。
[0032] (6)磁共振（MR)分析结果
[0033] r2弛豫率反映 SPIO纳米粒子作为MRI造影剂的成像效率，单位摩尔浓度铁的横向 弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间0\或T2)的倒数拟合计算得到。通过本发明制备 的SPIO-PGA纳米颗粒!^弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种SPIO-PGA纳 米颗粒的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加，具有良好的线性关系。随着Fe浓度的增高，其 MR信号强度明显减弱。不同浓度样品的磁共振成像可以看出纳米颗粒具有良好的体外成像 效果。通过计算得出SPIO-PGA纳米颗粒的r 2值为333. 了禮、-1 (参见附图5)。
[0034] (7) MTT细胞活力和相差显微镜观察结果
[0035] 通过MTT比色法测定HeLa细胞的活力来评价本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒的 细胞相容性（参见附图6)。将HeLa细胞种植于96孔板中，每种浓度设定5个平行样（Fe 浓度为50、150、250、350、450 μ g/mL)。细胞培养板置于CO2浓度为5%和温度为37°C的环 境中共培养24小时。经MTT处理后在酶标仪上检测各孔在λ = 570nm处的吸光值，并据 此计算相应的细胞活力，其中以生理盐水处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100%。 与空白对照组相比，经SPIO-PGA纳米颗粒处理过的HeLa细胞在Fe浓度为50、150、250、 350、450 μ8/ιΛ下均具有更高的细胞活力，并随着纳米颗粒浓度的增加细胞的活力随之相 应增加。这是因为PGA是一种具有良好生物相容性的生物高分子，对细胞的分化和增殖有 着促进作用。与此相反，作为对比的裸露的四氧化三铁纳米颗粒组在相同浓度下，细胞活力 明显低于生理盐水处理的细胞对照组，且随着浓度的增加，细胞活性逐渐降低。两组对比表 明SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的细胞相容性。同时，我们还通过相差显微镜观察法进一步 验证了 SPIO-PGA纳米颗粒对细胞形貌的影响。结果表明不同浓度的纳米颗粒（Fe浓度为 50、150、250、350、450 yg/mL)在37°C下与细胞共培养24小时后，细胞形貌没有明显的变化 (参见附图7)。进一步说明了 SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的细胞相容性。<