专利名称：用连续禽类细胞系制备禽麻痹病毒的方法
技术领域：
本发明涉及连续禽类细胞系的用途，其支持禽麻痹病病毒(MDV)以高滴度的生长及该病毒的生产性感染。本发明涉及可用作培养基底以有效繁殖大量禽麻痹病病毒特别是用于疫苗制备的细胞系。本发明涉及重组禽麻痹病病毒载体和包装所述载体的细胞系，以及可用作疫苗的重组禽麻痹病病毒。禽麻痹病病毒载体及疫苗可用于保护禽类免受禽麻痹病病毒的感染，以及抵抗由于感染所引起的疾病。
禽麻痹病(MD)是一种幼禽的急性致癌性疾病，其引发淋巴瘤、内脏瘤、神经损害和免疫抑制。此疾病为全球性的，分布广泛。病因是一种疱疹病毒，禽麻痹病病毒。在适于烤制的家禽中禽麻痹病已成为引起死亡的主要原因，危险很大(Dalnek，B.W.和Witter，R.L.，家禽疾病，第9版，Iowa State Press，Ames，Iowa，342-385(1991))。
禽麻痹病病毒有三种血清型。血清型1包括全部致病株及其减毒型衍生物。血清型2由天然无致病力的幼禽病毒组成，而血清型3也称为火鸡疱疹病毒(HVT)，包括可在幼禽中复制的无致病力的火鸡病毒。这三种血清型有部分交叉保护作用，但可利用多克隆或单克隆抗体试验、多肽模式及DNA分析等方法(Silva，R.F和Lee，L.F.，病毒学，36卷，307-320(1984)；Payne，L.N.，病毒学百科全书(Webster，12.G及Granoff，A.编)，832-838(1994))和其它已知方法加以区分。
MDV血清型1及HVT的DNA基因组分别为大约180和160千碱基的线性双链分子。与其它疱疹病毒相似，MDV基因组由被反向重复序列包围的长独特区(UL)和短独特区(US)构成。三种MDV血清型的基因组均为全长闭合环状DNA的形式，但是这三种MDV血清型之间在严格杂交条件下几乎无同源性，尽管它们的基因组共线性(见，Payne，L.N.，病毒学百科全书(Webster，R.G和Granoff，A.编)，832-838(1994))。
与其它疱疹病毒相比禽麻痹病病毒似乎不易发生重组，病毒的细胞结合性质使从亲本病毒中分离重组子的噬斑纯化不易。尽管如此，已从下列血清型中产生了重组MD病毒血清型1(Sonoda，K.等人，疫苗(Vaccine)14卷，277-284(1996)；Parcells，M.S.等人，病毒学杂志(J.Virol.)，69卷，7888-7898(1995)；Parcell，M.S.等人，病毒基因(Virus Gene)(9)，5-13(1994)；Parcell，M.S.等人，病毒学，688239-8253(1994)；Sakaguchi，M.，疫苗，12953-957(1994)；Reddy，S.K.等人，疫苗，14469-477(1996)、血清型2(Marshall，D.R.等人，病毒学，(195)，638-648(1993)；Silva，R.F.第14届国际疱疹病毒工作会议(摘要)(1989))和血清型3(Reddy，S.K.等人，疫苗，14469-477(1996)；PCT专利申请WO 95/29248(1995)；Silva，R.F.，第14届国际疱疹病毒工作会议(摘要)(1989)；Darteil，R.，等人，病毒学211481-490(1995)；1995年授权的美国专利5,187,087；Zelnik，V.等人，普通病毒学杂志(J.Gen.Viroll.)，762903-2907(1995)；欧洲专利431,668B1，公开于1995年；Morgen，R.W.等人，禽类疾病，36858-870(1992)；Bandyopadhyay，P.K.等人，第13届国际疱疹病毒工作会议323(摘要)(1988))。在所有上述文献中，病毒均有复制能力，且在原代禽类细胞中制备。
市售禽麻痹病病毒疫苗除了某些单价HVT制剂外，主要由活的禽麻痹病病毒感染的原代幼鸡胚胎成纤维细胞(EF)构成。与利用完整活体禽麻痹病病毒感染的原代幼鸡细胞以生长用于疫苗中的禽麻痹病病毒这种情况相关的显著问题在于，CEF细胞必须贮存在液氮温度，且为保证有效须通过注射施用。以前需要完整活细胞疫苗是因为在细胞培养物及感染的禽类大多数的组织中三种禽麻痹病病毒血清型细胞结合性很强。可通过细胞与细胞的直接接触实现禽类内感染的传播，仅有极少或没有不带细胞的病毒放出。传染性病毒体仅在羽滤泡上皮(FFE)中产生，负责禽与禽的传播(Calnek，B.W.等人，禽类疾病，14219-233(1970)；Witter，R.L.，等人，国家癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.491121-1130(1972)；Edison，C.S等人，国家癌症研究所杂志，47113-120(1971))。
市售无细胞禽麻痹病病毒疫苗可通过细胞培养制备。然而，无细胞禽麻痹病病毒疫苗的制备目前局限于仅利用血清型3的禽麻痹病病毒制备的疫苗。这是因为，仅有血清型3的禽麻痹病病毒以对于禽麻痹病病毒疫苗制备足够的量制造游离病毒体。已建议病毒糖蛋白D(gD)基因表达的缺乏可参与无细胞病毒体的有限度释放(PCT专利申请WO95/29248，公开于1995年；Tan，X和Velicer，L.F.第18届国际疱疹病毒工作会议A，145(摘要)，(1993))。
除了CEF9，其它原代禽类细胞也适用于生长禽麻痹病病毒，包括幼鸡胚胎肾(CEK)细胞和鸭胚胎成纤维细胞(DEF)。一种命名为QT 35的化学转化的鹌鹑细胞系已被描述用作培养基底用于无致病性的禽麻痹病病毒血清型2和血清型3的培养，但不包括血清型1(Nikura，M.，Nanta，T等人，兽医学杂志(J.Vet.Med.Sci)，53439-446(1991))。一种化学转化的CEF细胞系(称为CHCC-OU2(Ogura，H和Fujiwara，T.，Acta Med.Okayama，41141-143(1987))已被描述可支持禽麻痹病病毒1的生长(Abujoub，A.和Coussens，P.M.，病毒，214541-549(1985))。
其它已知用于禽麻痹病病毒制备的方法包括致肿瘤或致癌细胞系的使用。禽麻痹病转化的类淋巴母细胞细胞系(Nazerian，K.，禽类病理学(Avian Pathol.)16527-544(1987))衍生自用致癌性禽麻痹病病毒1感染的幼鸡淋巴瘤。在这些细胞中病毒基因组以潜伏型或半潜伏型保持，因而对共培养的CEF细胞或DEF细胞之感染的传播，如果发生的话也是以很低的频率。此外，这些类淋巴母细胞系可耐受用其它禽麻痹病病毒的再度感染。而且，禽麻痹病病毒转化的类淋巴母细胞细胞系未显示出在制备非重组型(传统)禽麻痹病病毒疫苗或制备重组禽麻痹病病毒或制备基因工程改造的禽麻痹病病毒或载体中的用途。
类似地，衍生自致癌性禽类逆转录病毒(禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病毒)的类淋巴母细胞细胞系(Nazerian，K.，禽类病理学，16527-544，1987)也未用于制备商业化禽麻痹病病毒疫苗或用于产生重组禽麻痹病病毒，因为存在逆转录病毒的释放、类淋巴母细胞较差的生长特征以及低水平的禽麻痹病病毒生产性感染。因此，仍需要适合的培养基底用于以免疫接种为目的之高滴度生长禽麻痹病病毒。
图1描述了MDV-1(652)/QM7感染的转化灶之免疫荧光和致细胞病变效应(CPE)。在含3％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12中QM7细胞用652/DEF感染7天。感染的细胞然后用80％丙酮固定，用MDV-1特异性单克隆抗体(抗-gB和抗pp38)染色。QM7与DEF共培养的阴性对照染色呈全部阴性。上部图为652/QM7转化灶的免疫荧光结果；下部图为652/QM7的感染转化灶的致细胞病变效应(CPE)。
图2是含有禽麻痹病病毒gH基因插入片段的pCR 3.1载体的图谱。用PCR方法从Md5株中克隆MDV-1之2.6kb的gH基因。然后将其克隆入pCR3.1载体的多克隆位点(Invitrogen.Inc.，目录号K3000-01)。
图3描述了MDV-1 gH和gD蛋白质的免疫荧光检测。分别用pCR3 gH-HA和pCR3 gD-HA(gH和gD基因带有一种HA标记)转染QM7。48小时后转染的细胞用80％丙酮固定，用针对HA的单克隆抗体染色(Babco Mab，目录号MMS-101R)。图A，QM7细胞中的gH-HA；图B，QM7细胞中的gD-HA。
图4描述了MDV-1 gH和gD蛋白质的免疫沉淀分析。分别用pCR3gH-HA和pCR3gD-HA(gH和gD基因带有一种HA标记)稳定地转染QM7细胞。选择G418抗性细胞并克隆。然后将这些细胞用35S-Met(TransLabel，INC)代谢性标记5小时，于裂解缓冲液(BoeringerMannheim免疫沉淀试剂盒)中裂解。与针对HA的单克隆抗体(BabcoMab，目录号MMS-101R)温育后使用蛋白质G Sepharose。泳道1-3用pCR3gH-HA转染的G418抗性细胞；泳道4-6用pCR3gD-HA转染的G418抗性细胞；泳道7和8表达gH-HA细胞的单细胞克隆；泳道9和10表达gD-HA细胞的单细胞克隆。
图5是pGreenLantern2质粒图谱(Life Technoligies)。
图6是pGL2/5’-3’-gfp质粒图。这个质粒中，将2kb长度的MDV-1(Md5)5’gH侧翼区插入经改造的pGreenLantern 2质粒的NsiI位点，将2kb长度的MDV-1(Md5)3’gH侧翼区插入到pGreenLantern 2的Nae I位点。
图7描述了gfp+重组MDV-1病毒的鉴定。质粒pGH2/5’-3’转染入652/QM7感染的细胞。当明显可见病毒感染的致细胞病变效应时，将细胞传代两次。然后将细胞悬浮液通过FACS分选器检测其绿色荧光蛋白质(gfp)表达。将所选gfp+细胞接种至12孔板上。上部图，在紫外线下gfp+感染的转化灶可见；下部图，在正常光下带有病毒致细胞病毒效应的相同转化灶。
本发明涉及可有效支持禽麻痹病病毒(MDV)以高滴度生长及生产性感染的禽类细胞系。本发明也涉及经基因工程改造以支持天然存在的和重组禽麻痹病病毒以高滴度生长及生产性感染的禽类细胞系。本发明涉及以适于免疫接种目的的量制备禽麻痹病病毒的方法。
本发明部分基于这样的发现，即连续禽细胞系可支持禽麻痹病病毒以高滴度的生长及生产性感染。特别地，已发现了以高滴度支持病毒生长的禽细胞系为鹌鹑肌成肌细胞细胞系。
根据本发明，术语“MDV”指一种MDV病毒颗粒，其相应于天然存在的MDV病毒颗粒，如野生型MDV或天然存在的突变MDV，或重组MDV病毒颗粒。天然存在的MDV病毒颗粒由野生型MDV基因组或天然存在的MDV基因组编码。重组MDV病毒颗粒由重组MDV基因组编码。重组MDV基因组包含MDV基因组核苷酸序列或其片段。这种片段须有足够长度以编码至少一种MDV基因产物或该基因产物的片段，以使该基因产物的片段保持基因的活性。例如，重组MDV基因组包含MDV的核苷酸序列，其中对于该病毒复制或病毒生活周期其它阶段必需的基因产物的基因被删除。此外，重组MDV基因组可进一步包含编码异源基因或异源片段的核苷酸序列。这种片段包含编码抗原表位如禽白血病毒(ALV)的核苷酸序列、调节序列如启动子序列，或是一段仍保留足够长片段的基因片段，以使由这种片段编码的多肽仍保留基因产物的活性。
本发明包含了这样的连续禽细胞系，其含有编码天然存在的MDV或重组MDV的DNA，如MDV核苷酸序列或编码在异源调节元件控制下的MDV核苷酸序列的DNA，或是编码含有至少一种异源基因或其片段的MDV核苷酸序列的DNA。在一优选的实施方案中，本发明也包含了已经基因工程化以表达天然存在的MDV或重组MDV的鹌鹑细胞系。
本发明也包含用编码一种MDV的核苷酸序列的DNA转染的连续禽细胞系，其中该MDV核苷酸序列已被删除了一种基因或其片段，该基因的产物对于病毒复制或病毒生活周期的其它阶段必需。在另一优选的实施方案中，本发明包括连续禽细胞系，其含有且表达编码MDV基因或其片段的DNA，该基因对于病毒复制或病毒生活周期的其它阶段必需。这种核苷酸序列可在细胞自身调节元件或异源调节元件控制下组成型表达或瞬时表达。本发明还包括经基因工程化以稳定表达MDV核苷酸序列或其片段的连续禽细胞系，表达受组成型激活的调节元件或诱导型调节元件的控制。
本发明也包括用天然存在的MDV或重组MDV感染的连续禽细胞系，或是用MDV感染的细胞裂解物或其组分感染的连续禽细胞系。
MDV可选自血清型1、血清型2或血清型3，可单独选用或选用它们的任一组合。
另一方面，本发明涉及MDV用于制备可在禽中诱导针对疾病的保护反应的疫苗方面的用途。
优选地，所用连续禽细胞系为鹌鹑细胞系，如于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏号为ATCC-CRL 12599的QM7细胞系，其可用MDV 652株感染；又如于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏号为ATCC-CRL 12600的652-QM7细胞系。在一优选的实施方案中，本发明不包括使用命名为QT35的化学转化的鹌鹑细胞系培养MDV血清型2或血清型3。
本发明也包括用于增殖MDV的方法，其包括通过用MDV或用MDV感染的细胞或其细胞裂解物感染细胞系，将天然存在的MDV或重组MDV导入连续禽细胞系，以及培养感染的细胞系，且从中收获细胞组分。本发明还包括由在禽中可诱导针对疾病的保护反应的所述细胞或其组分制备疫苗。
本发明也包括一种增殖MDV的方法，其包括用编码天然存在的MDV或重组MDV的核酸序列之DNA感染连续禽细胞系，培养细胞系，从中回收组分。依本发明的这一方面，DNA可编码天然存在的MDV核苷酸序列；包含有MDV基因组或其片段的核苷酸序列的重组MDV核苷酸序列。所述片段须足够长以编码至少一种基因产物或该基因产物的片段，以便基因产物的片段保持基因活性。此外，重组MDV可有效连接于异源调节元件，或可含有至少一种异源基因或片段。
本发明也包括一种用编码重组MDV的DNA转染的连续禽细胞系，其中重组MDV已被删除了一个基因或其片段，该基因产物对于病毒复制或病毒生活周期的其它阶段必需。在另一优选的实施方案中，本发明包括含有并表达编码MDV基因或其片段的DNA之连续禽细胞系，其中所述MDV基因对于病毒复制或病毒生活周期的其它阶段必需。这种核苷酸序列可在细胞自身调节元件或异源调节元件控制下组成型表达或瞬时表达。这种细胞系可用于制备重组MDV，方法是通过感染并培养这种带有编码禽麻痹病病毒核酸序列之DNA的基因工程化禽细胞系。例如，缺失的基因可以是对于复制必需的基因。更特别地，缺失的基因可以是禽麻痹病病毒的gH基因或其片段。依本发明的另一优选的实施方案，感染并培养禽细胞系，其带有获自由MDV感染的或者经基因工程化以表达MDV的细胞的细胞裂解物或组分，从而可产生第二代MDV。
依本发明，禽细胞系可被基因工程化以瞬时表达编码天然存在的或重组MDV的DNA，或可被基因工程化以稳定表达编码天然存在的或重组MDV的DNA。在本发明的另一优选的实施方案中，禽细胞系为鹌鹑肌成肌细胞细胞系。
MDV可选自血清型1、血清型2和血清型3，可单独选用或选用它们的任一组合。
在另一方面，本发明涉及上述方法，其中MDV是一种病毒，其用于制备在禽中可诱导针对疾病的保护反应的疫苗。
优选地，所用连续禽细胞系是用MDV的652株感染的鹌鹑肌成肌细胞细胞系，如1998年11月24日保藏于ATCC，保藏号ATCC-CRL12599的细胞系。其它合适的株的例子包括MDV-1的584A株和Md5株。MDV-1652株可获自用652株感染的鹌鹑成肌细胞，其已于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏号ATCC-CRL 12600。
本发明涉及制备用作疫苗的安全减毒型MDV-1重组体，为了使其不含有细胞而改变MDV-1病毒的极端细胞结合特性；还涉及产生连续细胞系以制备病毒。
在另一实施方案中，本发明涉及基因工程化重组禽麻痹病病毒和病毒载体以用作疫苗。在又一实施方案中，本发明涉及重组禽麻痹病病毒载体和病毒，其经基因工程化以编码突变的禽麻痹病病毒基因或编码来自多种禽麻痹病病毒血清型的基因的组合。
所得表达产物和/或嵌合病毒体可有利地用于疫苗制剂。本发明的表达产物和嵌合病毒体可经基因工程化以产生抵抗包括病毒性抗原的侵袭禽类的广谱病原体的疫苗。特别地，本发明的嵌合病毒体可经基因工程化产生抗ALV(禽白血病病毒)疫苗，其中将来自ALV的免疫原性多肽基因工程化入MDV基因组，以构建可引起针对MDV和ALV的免疫应答的疫苗。此外，可被构建入本发明的嵌合载体以用于疫苗的异源基因序列包括但不限于，衍生自其它MDV血清型的序列、新城疫病毒(NDV)、传染性Bursal疾病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、幼鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILV)、网状内皮组织增殖病毒(RV)和禽流感病毒(AIV)(见Field等人(编)，1991，病毒学基础，第二版，Raven Press，纽约，此处全文引入作为参考)。
疫苗可包括选自血清型1、血清型2和血清型3的MDV，其中可单独选用也可选用它们的任一组合。优选地，利用由禽麻痹病病毒感染的或转染的禽细胞系制备疫苗。
本发明的再一方面是利用上述方法制备的重组MDV。例如，重组MDV可包含天然存在的MDV的核酸序列，其中一种或多种基因如对于病毒复制必需的基因被删除。这种必需基因的例子之一是MDV基因组的糖蛋白H(gH)基因或其片段。所得缺陷型病毒(复制缺陷型)有单次循环的传染性，只要可得到经基因工程改造含有关于病毒复制必需基因且籍此可表达所缺失基因产物的互补性细胞系，用来增殖缺陷型病毒。缺陷型病毒的制备及其作为疫苗的用途描述于PCT申请GB91/01632(公开文本WO 92/05263)，在此引入全文作为参考。
本发明的又一方面是含有基因工程化禽细胞系的一种细胞系，其能表达复制必需的一种天然存在的MDV基因，例如gH，且能够使缺陷型MDV病毒复制本发明的又一方面是利用上述方法产生的MDV载体。MDV载体包含重组MDV和一种或多种异源基因或其片段。任选地，MDV载体带有包含SEQ ID NO2中所述核酸序列的3’侧翼区。还任选，MDV载体带有包含如SEQ ID NO1中所述核酸序列的5’侧翼区。此外，MDV载体可以同时带有包含SEQ ID NO2中所述核酸序列之3’侧翼区以及包含如SEQ ID NO1中所述核酸序列之5’侧翼区。
本发明的又一方面涉及一种保护动物抵抗疾病的方法，其通过向动物施用含有由上述方法制备的MDV的疫苗。优选地，动物为禽类。
本发明提供了关于连续禽细胞系用以制备天然存在的和重组禽麻痹病病毒(MDV)的用途的方法，制备基因工程化MDV和MDV载体以及用MDV感染或转染的连续禽细胞系的方法，以及用这些方法制备的能保护动物抵抗MDV引起的疾病的疫苗和/或其它致病因子引起疾病的疫苗。此外，提供了向动物施用MDV疫苗和MDV载体产生的疫苗，以保护动物防止MDV感染。
将本发明的MDV疫苗制备分成下列步骤仅仅出于描述的目的，而不以任何方式限制a)重组MDV模板的构建；b)基因工程化禽细胞系以支持天然存在的和重组MDV的生产性感染；和c)援救待配制成疫苗的MDV、细胞培养物、裂解物或裂解物组分。本发明也包括含有重组MDV编码核苷酸序列的疫苗制剂。为论述清楚，用MDV652株血清型1在实施例中描述本发明，然而，可利用任何MDV的血清型。
根据本发明，术语“MDV”指一种MDV病毒颗粒，其相应于天然存在的MDV病毒颗粒，如野生型MDV或天然存在的突变MDV，或重组MDV病毒颗粒。天然存在的MDV病毒颗粒由野生型MDV基因组或天然存在的MDV基因组编码。重组MDV病毒颗粒由重组MDV基因组编码。重组MDV基因组包含MDV基因组核苷酸序列或其片段。这种片段须有足够长度以编码至少一种MDV基因产物或该基因产物的片段，以使该基因产物的片段保持基因的活性。例如，重组MDV基因组包含MDV的核苷酸序列，其中对于该病毒复制或其它病毒生活周期其它阶段必需的基因产物的基因被删除。此外，重组MDV基因组可进一步包含编码异源基因或异源片段的核苷酸序列。这种片段包含编码抗原表位的核苷酸序列、调节序列，或是一段仍保留足够长片段的基因片段，以使由这种片段编码的多肽仍保留基因产物的活性。MDV也包括重组产生的禽麻痹病病毒(重组禽麻痹病病毒)或其片段本发明包括重组禽麻痹病病毒，其带有对于病毒复制或病毒生活周期中其它阶段必需的基因或基因区中的缺失或突变，包括感染的起始和病毒颗粒的包装。依本发明的这一方面，MDV基因组的缺失和/或突变足以消除或降低必需基因产物的表达，和/或消降或降低必需基因产物的活性。可作为靶目标的MDV基因的例子包括但不限于gH、gB、gD和壳体基因。依本发明的这一方面，在尝试产生减毒型表型的重组MDV时，MDV基因组的必需区是关注的目标。
本发明的另一实施方案中包括了含有在MDV基因组之必需或非必需区有缺失和/或突变的重组禽麻痹病病毒。MDV基因组中的这种区域可用任意异源核苷酸序列替换，从而产生嵌合MDV载体。实际上，可将任何异源基因序列构建入MDV载体用于疫苗中。依本发明的这一方面，异源基因序列可包括一种用于提高或激活宿主细胞免疫和/或体液免疫应答的基因产物，或者包括编码一种诱导针对任一种不同类型病原体的保护性免疫反应的基因产物，或者包括结合中和抗体的抗原。例如，可被构建入本发明的嵌合载体用于疫苗的异源基因序列包括但不限于，衍生自MDV其它血清型的序列、新城疫病毒(NDV)、传染性Bursal病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、幼鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽类白血病病毒(ALV)、网状内皮组织增殖病毒(RV)和禽类流感病毒(AV)(见Fields等人编，1991，病毒学基础，第二版，Raven Press，纽约，此处全文引用作为参考)。
可通过用异源基因全部或部分替换病毒编码区实现异源基因插入MDV基因组。全部替换最好可通过使用PCR介导的突变方法来完成。简言之，PCR引物A可含有(从5’端至3’端)一个单一限制性酶切位点，如IIS类限制性酶切位点(即移换酶(Shifter enzyme)；其识别特定的序列，但切割该序列的上游或下游的DNA)；一串与MDV基因区互补的核苷酸；以及一串与异源基因产物羧基端编码片段互补的核苷酸。PCR引物B可含有(从5’端至3’端)一个单一限制性酶切位点；一串与MDV基因互补的核苷酸；以及一种与异源基因的5’端编码片端相应的核苷酸。利用这些PCR引物与克隆的异源基因拷贝进行PCR反应后，产物可用单一限制性酶切位点切割和克隆。用IIS类酶消化并用纯化的噬菌体聚合酶转录后，产生了含有恰好在MDV基因未翻译端带有异源基因插入片段的分子。
应理解，重组MDV包括例如禽麻痹病病毒核酸序列的替换、插入、反转、添加和删除或其任意组合，如禽麻痹病病毒的缺失突变体中MDV基因组的非必需区或必需区被删除或突变，以使这些区未表达，如基因敲除或错义突变。这样的变异体可自然发生或可用传统重组技术进行遗传工程改造，以产生这样的变异。
重组禽麻痹病病毒或其片段的制备和操作在本领域技术人员的知识范围之内，可根据除了其它地方之外所描述的重组技术进行，如在Maniatis等人，1989，分子克隆实验室手册，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等人，1989，当代分子生物学方法，Greene publishing Associates和Wiley Interscience，A cademic Press Inc.，San Diago；以及Erilch编，1992，PCT技术，Oxford University Press，NY，上述均全文引入作为参考。
利用重组技术制备多种重组禽麻痹病病毒和禽麻痹病病毒载体的方法均已知。例如，美国专利5,231,023(授权于1993年7月27日)描述了通过将异源基因插入MDV的基因组DNA之非必需区制备的禽麻痹病病毒病毒载体。
本发明也包括DNA表达载体和遗传工程改造的宿主细胞，其中DNA表达载体含有与可指导编码序列表达的调节元件有效结合的任一前述编码序列，而遗传工程改造的宿主细胞中含有与在宿主细胞中可指导编码序列表达的调节元件有效结合的任一前述编码序列。如此处所用，调节元件包括但不限于，诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵子和其它本领域技术人员已知的驱动和调节表达的元件。在本发明的一优选的实施方案中，使用在鹌鹑细胞系中有活性的或由MDV诱导的调节元件，这些元件由本申请人加以描述，包括单纯疱疹病毒1(HSV-1)的gD启动子元件、ILTV的gG启动子元件、ILTV的gC启动子元件、PRV的gX启动子元件、SV40启动子、CMV启动子和RSV启动子。
可通过重组DNA技术利用本领域技术人员周知的技术制备MDV基因组或其片段。可使用本领域技术人员周知的方法构建表达载体，表达载中含有MDV编码序列、合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。见例如Sambrook等人1969(出处同前)和Ausubel等人，1989(出处同前)中所述的技术。或者，可通过如合成仪化学合成能编码MDV基因产物序列的RNA。见如描述于“寡核苷酸合成”，1984，Gait，M.J.编，IRL Press，Oxford中所述的技术，此处全文引用作为参考。
依本发明，术语“MDV载体”包括一种表达载体，其含有对于表达一种或多种有功能多肽如抗原所必需的适当的调节序列。本发明的MDV载体的例子包括那些在包装细胞系中表达的MDV基因组或其片段的那些载体，其中表达是在MDV调节元件控制下，或是在设计用于增强MDV基因组表达的异源调节元件控制下。在本发明的一优选的实施方案中，利用在鹌鹑细胞系中有活性或由MDV诱导的调节元件，其由本申请人证实，包括单纯疱疹病毒1(HSV-1)gD基因启动子元件、ILTV的gG启动子元件、ILTV的gC启动子元件、PRV的gX启动子元件、SV40启动子、CMV启动子和RSV启动子。
本发明也包括可产生带有减毒型表型的病毒颗粒的重组MDV载体，其一个例子为必需基因已被突变和/或删除从而导致复制缺陷型MDV的重组MDV。MDV基因组或其片段可包括野生型核苷酸序列、遗传改变的MDV的核苷酸序列或其片段，其包括必需基因区的缺失或异源序列的插入。本发明此方面的一优选的实施方案是这样一种重组MDV基因组，其中的gH基因被全部删除，或被删除了足够大的一个片段，以防止gH基因产物的表达；或是其中的gH基因被突变如错义突变，以防止gH基因产物表达。本发明此方面另一优选的实施方案中包括这样一种重组MDV基因组，其衣壳基因被全部删除，或被删除了足够大的一个片段，以防止衣壳基因产物表达，或者其中的衣壳基因被突变，如错义突变，以防止衣壳基因产物表达。
应理解MDV也包括这样的重组MDV，其含有位于MDV基因组核酸序列内插入区的整合的一个或多个外源基因。在本发明此方面的一个优选的实施方案中，MDV基因组经基因工程化以表达一种或多种MDV三种血清型的抗原肽，以产生施用于禽类的多价疫苗，赋予它们更全面的抵抗MDV感染的保护作用。例如，MDV血清型1的MDV基因组还可经基因工程化以编码MDV血清型2和3的gB基因产物之抗原决定簇。在另一实施方案中，异源基因和基因片段可编码其它引起禽类疾病的因子之抗原。用于制备带有异源基因和片段的重组禽麻痹病病毒的方法在本领域普通技术人员知识范围之内，可依描述于Maniatis等人和其它上述文献中的重组技术进行。
在本发明的另一实施方案中，MDV载体可被基因工程化以含有重组MDV的核苷酸序列，以及一种或多种编码MDV抗原或其它引起禽类疾病因子如(ALV)抗原的异源基因的核苷酸序列。在另一实施方案中，异源基因和基因片段可编码其它引起禽类疾病因子的抗原。在另一实施方案中，本发明的MDV载体可经基因工程化，以编码已知可提高禽类细胞免疫反应的异源蛋白质，从而增强所施用疫苗的整体保护效果。
可利用本领域普通技术人员知识范围之内的重组技术将MDV和异源基因经基因工程进入本发明的MDV载体，其可在本发明的连续禽细胞系中表达，一旦配制成适当的形式且施用于禽类，其可引发应答重组禽麻痹病病毒和/或异源基因产物的免疫反应。应将足够的且有功能的启动子与异源基因相连，以使MDV载体能表达异源基因。启动子可以是真核的、原核的或病毒启动子，其能在用重组MDV载体感染的细胞中指导转录。这种启动子的制备和使用已知，且可依描述于Maniatis等人和其它上述文献中的重组技术进行。
本发明包括制备MDV和MDV载体的方法，方法为感染、转染和培养连续禽细胞系，如猫肾细胞和鹌鹑细胞系，其能产生MDV或用于MDV载体制备。在这种细胞系中制备的MDV可用本领域技术人员已知的分离技术分离。“感染”或“转染”是指病毒的DNA或其片段转移入细胞。用于基因转移入细胞的方法在本领域技术人员知识范围内，如Watson等人1992，重组DNA，第2版，W.H.Freeman AndCompany N.Y，中所述。
本发明涉及连续禽细胞系，特别是鹌鹑肌成肌细胞，其有效地支持禽麻痹病病毒以高滴度生长及生产性感染。本发明也包括经基因工程化以表达病毒复制所需MDV基因产物的连续鹌鹑肌成肌细胞。依本发明的此方面，这种细胞系称为“互补性细胞系”，因为它们互补在重组MDV载体中被删除或突变的必需病毒基因和基因区。
本发明的互补性细胞系可经基因工程化以表达任何被从重组MDV载体中删除的基因或基因区。依本发明的此方面，可基因工程化细胞系以表达MDV基因产物，包括但不限于gH、gB、gD或衣壳蛋白。这些细胞系可经基因工程化以在组成型激活或诱导型调节元件的控制下瞬时或稳定地表达MDV基因产物。在本发明的一个优选的实施方案中，利用在鹌鹑细胞系中有活性的或由MDV诱导的调节元件，其由本申请人证实包括HSV-1的gD启动子元件、ILTV的gG和gC启动子元件、PRV的gX启动子元件、SV40启动子元件、CMV启动子元件和RSV启动子元件。
在特别期望的途径中，经基因工程化以表达所有MDV病毒基因的细胞可产生带有期望的基因型的传染性嵌合病毒，因而不再需要筛选系统。理论上，可以用异源基因替换MDV基因的任一个。然而，这种方法的必需部分是保证缺陷型病毒的繁殖能力(由于正常病毒基因产物丢失或删除的缺陷)。有许多可能的途径可克服这个问题。在一种途径中，带有突变蛋白质的病毒可生长在细胞系中，该细胞系被限制于组成型表达相同蛋白质的野生型类型。以此方式，细胞系互补病毒中的突变。可以用类似的技术构建组成型表达任何MDV基因的转化的细胞系。这些构建用于表达病毒蛋白质的细胞系可用于互补重组病毒中的缺陷，从而增殖病毒。另外，某种天然宿主范围系统可用于增殖重组病毒，即禽细胞系。第三种增殖重组病毒的途径可包括与野生型病毒共培养。这可以简单地选用重组病毒及用其与其它野生型MDV病毒(优选为疫苗接种株)共感染细胞完成。野生型病毒应当与缺陷病毒基因产物互补，且允许野生型和重组病毒生长。
对于长期、高产量制备重组蛋白质，优选稳定的表达。例如，可以基因工程化稳定表达MDV基因产物的禽细胞系。不是利用含有病毒复制起点的表达载体，可以利用由适当表达控制元件(如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和一种选择性标记转化宿主细胞。在导入异源DNA后，可使工程化细胞在加富培养基中生长1-2天，然后移入选择性培养基中。在重组质粒中的选择性标记赋予可用于选择的抗性，且使细胞将质粒稳定整合入其染色体，使细胞生长形成转化灶，再被克隆并扩散到细胞系中。这种方法可有利地用于工程化改造细胞系，如此处所述表达gD和gH的细胞系。在本发明的另一优选的实施方案中，编码重组MDV和调节元件的DNA序列可被递送至宿主细胞，并通过同源重组导入宿主细胞，编码重组MDV和调节元件的DNA序列可被递送到宿主细胞，并通过同源重组导入宿主基因组，这是一种本领域技术人员周知的技术，如Chappel，美国专利4,215,051；Skoultchi，WO 91/06667中所述，此处全文引入作为参考。
可用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胞苷激酶(Wigler等人，1977，细胞，11223)、次黄嘌呤-腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalski和Szybalski，1962，美国国家科学院院报，482026)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，细胞22817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。同样，抗代谢物抗性也可作为下列基因的选择基础dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler，等人，1980，美国国家科学院院报，773567；O’Hare等人，1981，美国国家科学院院报，781527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，美国国家科学院院报)；neo，其赋予氨基糖苷G418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物学杂志，1501)以及hygro，其赋予潮霉毒抗性(Santerre等人，1984，基因30147)。在本发明的另一优选的实施方案中，如此处所述一种绿色荧光基因可用于检测目标基因的表达。
本发明也包括用MDV或MDV载体感染的连续禽细胞系。用于以MDV转染或感染的禽细胞系其特征为不含有禽类病毒的连续细胞系。优选地，禽细胞系是鹌鹑细胞系。这些细胞系可用周知的细胞培养技术培养和维持，如Celis，Julio编，1994，细胞生物学实验室手册，Academic Press，N.Y中所述。本领域技术人员可以选择并优化用于这些细胞的多种培养条件，包括关于特定养分、氧气、张力、二氧化碳和减少的血清水平等的培养基配制。
本发明优选的禽细胞系是鹌鹑细胞系，更优选的，是鹌鹑肌成肌细胞细胞系。依本发明可利用任何鹌鹑肌成肌细胞细胞系，例如，于1998年11月24日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，命名为ATCC CRL 12599的鹌鹑细胞系。在本发明的一优选的实施方案中，不包括命名为QT35以培养MDV血清型2或3的鹌鹑细胞系。在一优选的实施方案中，命名为QM7的鹌鹑细胞系用于培养本发明的MDV载体和病毒。在本发明的另一优选的实施方案中，命名为QM7鹌鹑细胞系用MDV 652株感染，其于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏号ATCC-CRL 12600。
可用本领域技术人员熟悉的已知细胞培养技术克隆用于本发明的鹌鹑细胞系。培养细胞，并用市售培养基在已知适于增殖细胞的条件下从一个细胞开始繁殖。
例如，可将冰冻待用的本发明的细胞系在约37℃温度下温暖，然后加入合适的生长培养基，诸如含3％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12(Life Technologies，Inc.)。细胞可在37℃含有约5％CO2的潮湿培养箱中温育直至生长至铺满。为了细胞传代，移去生长培养基，向细胞加入0.05％胰蛋白酶和0.53mM EDTA。分散细胞，收集细胞悬浮液于离心管中，离心得细胞沉淀。除去胰蛋白酶溶液，将细胞沉淀重悬于新的生长培养基。再将细胞于另外的生长器皿中进一步增殖至期望的密度。
依本发明，连续细胞系包括可于体外至少15代的无限增殖化细胞。
对于非重组、重组或基因工程化MDV或MDV载体可通过与MDV感染的细胞共培养进行感染或转染。用于共培养的细胞可以是MDV感染的细胞，如CEF细胞或DEF细胞、类淋巴母细胞、外周血单核细胞、CHCC-OU2细胞、鹌鹑细胞和描述于实施例中的鹌鹑细胞克隆。另外，可以用MDV感染禽细胞系，方法是用本领域技术人员周知的方法将纯化的MDV之DNA或来自MDV感染的细胞之DNA导入禽细胞系。如磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖法、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)法、脂质转染法和电穿孔法。优选地，DEF或CEF之MDV感染的细胞用于感染本发明的连续禽细胞系。MDV感染的CEF、DEF、类淋巴母细胞、外周血单核细胞、CHCC-OU2细胞和鹌鹑细胞的培养为本领域技术人员周知。
例如，将细胞培养生长至约50％至约80％铺满，加入用MDV感染的细胞至半铺满的细胞，从而用MDV转染禽细胞系。细胞可在约37℃下培养约一周，每2至3天更换培养基。通过如上述胰蛋白酶消化分开细胞。通过致细胞病变效应(CPE)、感染细胞转化灶的形成以及利用MDV特异性抗体之间接荧光抗体(IFA)监测感染的细胞。可用已知的单克隆杂交瘤技术制备MDV特异性抗体(Goding，James W.，单克隆抗体原理与实践，第二版，Acdemic Press(1986)；Harlow等人，抗体实验室手册，Cold Spring Harbor实验室，(1988))。可将MDV-感染的细胞之冰冻贮存原种保存待用。
本发明也涉及用于含有MDV的疫苗制备的方法，包括感染诸如鹌鹑细胞系的连续细胞系，且培养感染的细胞系以产生可用作针对MDV的疫苗的抗原。然后将MDV感染的细胞用作抵抗MDV的疫苗，或从细胞分离的无细胞MDV可用作疫苗。
本发明还涉及用于制备含有MDV的疫苗的方法，其通过用MDV载体转染或感染连续禽细胞系，诸如鹌鹑细胞系，该细胞系能表达除MDV之外额外的异源基因，该载体中包含MDV及一种或多种异源蛋白质或多肽的基因，它可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽疾病的因子。
此外，本发明涉及用于制备疫苗的方法，其通过用MDV载体转染连续禽细胞系，其中MDV载体包含有复制缺陷型MDV和一种或多种异源蛋白质或多肽的基因，该细胞系能表达除MDV之外额外的异源基因，它可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽类疾病的因子。
此外，本发明涉及用于制备疫苗的方法，其通过用MDV载体转染连续禽细胞系，其中MDV载体包含有复制缺陷型MDV和一种或多种异源蛋白质或多肽的基因，该细胞系能表达除MDV之外的异源基因，其可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽类疾病的因子。其它引起禽类疾病的因子可用于疫苗制备且由本发明的方法制备，这样的因子的例子包括新城疫病毒(NDV)、传染性Bursal病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、幼鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮组织增殖病毒(RV)和禽流感病毒(AIV)(见Field等人编，1991，病毒学基础，第二版，Raven Press，纽约，此处全文引入作为参考)。用本发明的方法产生的MDV包含有一种或多种可用作单价或多价疫苗的异源蛋白质或多肽。这样的疫苗可由疫苗制备领域普通技术人员周知的方法制备。
依本发明，疫苗制品包含细胞系或其组分，例如细胞裂解物，应检查细胞系以确保细胞系中无其它病毒和病原体。特别地，待配制入疫苗以施用于动物如禽类的细胞系应当被检查是否存在逆转录病毒，这种检查可用本领域技术人员已知的方法进行，如逆转录酶检验(Boehringer Mannheim)。此外，可用市售检验方法检查细胞系是是否存在禽类病原体。
本发明还包括向动物施用MDV疫苗及MDV载体制备的疫苗的方法，以保护MDV的感染。表达MDV的MDV和/或一种或多种异源蛋白质或多肽包括可提高禽类免疫应答的那些，或是可用于免疫动物(如对某些疾病引发因子敏感的幼鸡和火鸡)的禽类疾病引发因子的蛋白质或多肽。用MDV或由本发明的方法产生的其它抗原免疫接种，可导致保护性免疫反应，从而使接种的动物免受那些疾病引发因子造成的继后感染。
可配制活的重组病毒疫苗或失活的重组病毒疫苗。优选活疫苗，因为在宿主中的繁殖造成了与天然感染相比类似种类和数量级的但延长的刺激，因而赋予有效的长期的免疫。这种活重组病毒疫苗制剂的制备可用传统方法实现，包括在细胞培养物中病毒的增殖或在鸡胚尿囊中的增殖，随后进行纯化。
在这方面，用于疫苗接种的目的之基因工程化的MDV(载体)可期望在这样的株中存在减毒特性。将适当的突变(如删除)导入用于转染的模板，可提供带有减毒特性的新型病毒。例如，与温度敏感性或冷适应性相关的特定错义突变可被加入到删失突变中，这样的突变比与冷或温度敏感性突变相关的点突变应当更稳定，且回复频率应当极低。
另外，可构造带有“自杀”特性的嵌合病毒。这种病毒在宿主中仅可经历一次或几次复制。当用作疫苗时，重组病毒可经历有限的复制循环，且诱导足够水平的免疫应答，但在动物宿主中不会进一步引起疾病。缺乏一种或多种MDV基因或具有突变的MDV基因的重组病毒不能经历连续的复制循环。可在永久表达这种基因的细胞系中制备缺陷型病毒。缺乏必需基因的病毒可在这些细胞系中复制，但当施用于动物宿主时不能完成一个复制循环。除了产生非传染性病毒颗粒，这种制品可在这样的流产性循环中转录和翻译足够量的基因以诱导免疫应答。此外，可施用大量的毒株，以使这些制品用作灭活(杀死)的病毒疫苗。对于灭活疫苗，优选异源基因产物被作为病毒组分表达，以便基因产物与病毒体结合。在本发明的另一优选的实施方案中，亚单位疫苗包括MDV的抗原决定簇或可作为疫苗配制的异源病毒抗原决定簇。这种制品的优点在于它们含有天然蛋白质，且不用经历用福尔马林或其它用于制备杀死的病毒疫苗的因子处理的灭活。
在本发明的此方面的又一实施方案中，可用传统技术“杀死”嵌合病毒制备灭活的疫苗制剂。就其传染性遭破坏而言，灭活疫苗是“死”的。理想地，可破坏病毒的传染性而不影响其免疫原性。为了制备灭活疫苗，可在细胞培养物或鸡胚尿囊中生长嵌合病毒，用区带超速离心纯化，用甲醛或β-丙酸内酯灭活，收集合并。所获疫苗一般由肌肉内接种。
在本发明的另一优选的实施方案中，编码带有减毒表型的重组MDV之核苷酸序列或编码含有MDV和/或异源抗原决定簇的重组子之核苷酸序列可被配制为疫苗。依这一实施方案，疫苗组合物可包含编码带有减毒表型的重组MDV之DNA，和/或含有MDV和/或与控制基因表达之调节序列有效连接的异源抗原决定簇。依本发明的此方面，将目标DNA工程化入表达载体，受促进DNA表达的调节元件即启动子或增强子元件的控制。在一优选的实施方案中，启动子元件可为细胞特异性的，且仅在预先决定的细胞中允许DNA的实质性转录。可以裸露DNA的形式(美国专利5,679,647，此处全文引入作为参考)或配制成组合物中的形式将DNA直接导入宿主中，其中DNA是与其它可促进DNA吸收的试剂(包括病毒载体)一起配成组合物、或有助于免疫的试剂，如布比卡因(bupivicaine)和其它局部麻醉剂(美国专利5,593,972，此处全文引用作为参考)、皂苷(美国专利5,739,118，此处全文引入作为参考)和阳离子聚胺(公开的国际申请WO 96/10038，此处全文引用作为参考)。
灭活病毒可与适当的佐剂配制以增强免疫应答。这种佐剂可包括但不限于，矿物胶，如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子；肽；油乳液和潜在有用佐剂如BCG和Carynebacterium parvum。
本发明的细胞系及其组分可以中性或盐的形式配制入疫苗。药学可接受的盐包括酸加成盐(与肽之游离氨基形成)，以及与无机酸例如盐酸、磷酸或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化高铁，以及有机碱，如异丙醇胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、脯氨酸等。
待施用疫苗的对象优选禽类，最优选为家禽，如幼鸡或火鸡，非禽类动物包括但不限于牛、马。
本发明的疫苗制剂包括免疫有效量的本发明的细胞系及其组分，以及药学可接受的载体或赋形剂。疫苗制品包含免疫有效量的一种或多种抗原以及药学可接受的载体或赋形剂。药学可接受的载体为本领域周知，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液和其组合。一种这样的可接受的载体的例子是含有一种或多种稳定剂的生理学平衡的培养基，如稳定化的水解蛋白质、乳糖等。载体更优选无菌。制剂应适应施用的形式。
如需要，组合物可还含有少量保湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可为液体溶液、悬浊液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂。口服制剂可包括标准载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
通常，以单独或混合在单元剂量中的形式提供成分，如干的冷冻干燥粉，或在密封容器中的无水缩合物的形式，如表明活性成分的量的安瓿或sachette中。当组合物通过注射施用时，可提供无菌稀释剂的安瓿以在施用前混合各成分。
可使用多种方法导入上述疫苗制剂，包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下和鼻内途径。也优选地通过所设计疫苗针对的病原体感染的天然途径导入嵌合病毒。可通过在用疫苗免疫后监测测试动物中的免疫反应，如体液(抗体)反应的产生和/或细胞介导的免疫，作为免疫反应的指示。本发明的疫苗之有效剂量(免疫接种量)可从来自动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推得出。下列实施例进一步阐述而不限制本发明。
实施例1QM7细胞可有效支持MDV感染本研究中QM7细胞为日本鹌鹑肌成肌细胞(ATCC CRL 12599)，衍生自已鉴定为可以高滴度支持MDV-1生长的QT6纤维肉瘤细胞系。
MDV的652和584分离株加上MDV的分离株有很强的致毒性(Witler，R.L.，禽类疾病，41149-163(1977))。用以DEF接种物感染的MDV(652/DEF的细胞培养物第十一次传代物)感染QM7细胞。通过计数转化灶的形成数量以及通过在IFA检测中(图1)检测MDV病毒蛋白质(gB和pp38)的表达的致细胞病变效应(CPE)监测MDV-1(652株)的生产性感染。检测到大量且高染色强度的感染转化灶。通过分别将652/QM7感染的细胞接种入(50-60％铺满的)未感染QM7细胞维持感染。652/QM7感染的转化灶很大，无需抗体染色肉眼即可见。也检测了QT6纤维肉瘤细胞系支持生产性MDV感染的能力。然而未证实QT6细胞系为MDV生长的十分有效的宿主。
结果表明，QM7细胞可有效地支持MDV-1的感染，然而，为了进一步表征和优化QM7细胞的MDV-1感染，测试了6种不同生长条件(两种血清浓度，三种分裂(split)比率)。结果总结于下表。
表1652/QM7细胞第3代于DMEM/F-12培养基中的滴度
表2
这些结果表明，652/QM7感染的最适生长条件为在DMEM/F-12(带有3％胎牛血清)中培养感染的细胞，分裂比率1∶10。当分裂比率超过1∶20后滴度明显下降。从第7代至第10代滴度保持恒定。对QM7和652/QM7细胞的逆转录酶检测用市售非放射性逆转录酶(RT)检测试剂盒(BoehringerMannheim)检测细胞系的逆转录酶活性。从DEF、652/DEF、QM7、652/QM7和NYU细胞(用作阳性对照)制备细胞裂解物、澄清上清液和超速离心沉淀。所有样品均作三份重复，且结果代表两次RT检测。用HIV-1的逆转录酶构建标准曲线。细胞系/逆转录酶 裂解物 上清液 沉淀活性(ng/孔)NYU 0.819 0.003 1.945DEF -0.144 -0.155-0.455652/DEF -1.455 -4.456-0.455QM7 -0.142 -0.155-0.155652/QM7 -0.456 -0.458-0.456因其已知的逆转录病毒逆转录酶活性，选择NYU细胞作为内部阳性对照。如这些结果所示，获自NYU细胞的超速离心沉淀和细胞裂解物有逆转录酶活性的强阳性。在对至少20皮克敏感的本检测中，QM7、652/QM7、DEF和652/DEF细胞明显为阴性。这些结果表明，所有4种细胞系均不含任何逆转录病毒颗粒。禽类外源病毒检测采用美国农业部9CFR检测中“利用鸡胚接种检测病毒体的检测”方法，检测QM7细胞中是否存在任何禽类病原体，结果发现无任何禽类病原体。简言之，将QM7细胞悬浮液感染鸡胚。如果存在任何上源病毒，将会导致鸡胚的损坏。MDV-1(652)DNA感染导致QM7细胞的生产性裂解感染从652/QM7感染的细胞中分离裸露DNA，以磷酸钙转染法(ClonTech试剂盒)转染未感染的QM7细胞。培养7天后(每2-3天更换培养基)，在转染平板上可见许多感染的转化灶。这些转化灶不能与用652/QM7感染的细胞共培养得到的转化灶区分开来。这一结果确切表明，MDV-1可在QM7细胞中生产性复制和生长，排除了652/QM7转化灶源自污染性接种体的可能性。实施例2QM7细胞中的不同启动子活性进行下述实验以证实在QM7细胞中鉴别何种启动子有活性，从而进一步在MDV感染过程中何种启动子被活化或诱导。萤光素酶报告基因构建体(基于pGL3，Promega)含有不同的启动子(pSV40+增强子，pSV40，pCMV，pRSV)，将其分别转染QM7和DEF细胞。72小时后，收集细胞裂解物，且用不同稀释度检测萤光素酶活性。
表3不同启动子在QM7和DEF细胞中的萤光素酶活性
这些结果提示在QM7细胞中这些不同启动子(pCMV、pRSV、pSV40和pSV40+增强子)很活跃。此外，在这些禽类细胞中pRSV是特别强的启动子。
将多种MDV-1病毒诱导的启动子构建体转染入652/QM7，从而在诱导条件下检测启动子的强度。测量由萤光素酶报道基因产生的萤光素酶活性。除了用作对照的pCMV启动子之外，检测了五种不同病毒启动子MDV-1(MD5株)的gH基因启动子元件；ILTV的gG和gC基因的启动子元件；PRV的gX基因启动子元件和HSV-1的gD启动子。
表4不同启动子在MDV感染的QM7细胞中的活性<
这些结果提示，来自HSV-1的启动子pgD被高度诱导，作为病毒诱导型启动子应在QM7细胞的MDV感染中有活性，pCMV启动子在病毒感染的QM7细胞中也有活性。实施例3体内致病性研究在体内致病性研究中检测652/QM7感染的细胞在幼鸡中引发禽麻痹病的能力。
每组30只1日龄小鸡共五组，分别腹膜内接种(1)未感染的QM7细胞混合物；(2)652感染的QM7细胞的第3代细胞培养物；(3)652感染的QM7细胞的第3代细胞培养物；(4)652感染的QM7细胞的第7代细胞培养物；和(5)652感染的QM7细胞的第7代细胞培养物。对每只小鸡用250或750TCID50的MDV接种。在感染6-8天后于用80％丙酮固定的次代DEF细胞单层上利用TCID50法测定病毒滴度，用上述IFA检查。
在补加了抗生素和适量胎牛血清(对于感染的细胞为3％；对于未感染的细胞为10％)的DMEM/F-12(Life Technoligies)中于润湿培养箱中在37℃和5％CO2条件下生长感染的和未感染的细胞。
如果研究过程中禽死亡则进行尸体解剖，检查MDV感染的迹象。自存活禽中收获肾、脾、肝、心和脑用于组织学评价。
所有用652感染的细胞注射过的幼鸡均形成了极强致病性MDV的典型症状，大多数这些鸡死于禽麻痹病。在实验期间(8周龄)未感染细胞组未出现任何禽麻痹病的症状。结果示于表5。
表5 652/QM7细胞的体内致病性
各组织(肾、脾、肝、心和脑)的组织病理学评价显示，在来自感染组的存活禽中损伤与禽麻痹病一致。来自细胞对照或阴性对照组的禽中未见这样的损伤。
这些体内实验证明，在QM7细胞中生长的MDV-1(652)致病性很强，证实QM7细胞是MDV-1病毒以高滴度扩增感染的良好宿主。实施例4pCR3.1gH构建体的制备由聚合酶链反应(PCR)从禽麻痹病病毒株MD5中分离了3个2.6kb的糖蛋白H(gH)基因，并用聚合酶链反应(PCR)克隆入pCR2TA克隆(TA克隆载体，获自Invitrogen Inc.美国，目录号k2000-1)，采用了市售PCR试剂系统(GIBCO-Life Technoligies，目录号10198-018)，所用上游PCR引物5’-GGGGG TACCA AGUG CATTGGATGG CTACA TA-3’，及下游PCR引物5’-GGGGC TAGCT TAAAGATCGT CGTAC AGGCT CAA-3’。可用已知技术测定gH基因序列。gH基因的序列述于Scott等人，普通病毒学杂志，741185-1190(1993)。
利用多克隆位点中(见图2)的KpnI和XhoI位点将MDV的gH基因亚克隆至pCR3.1载体(获自Invitrogen Inc.美国，目录号k3000-01)。载体pCR3.1是真核表达载体，含有用于在哺乳动物中有效表达的巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，以及允许对含有该载体的细胞正选择的新霉素抗性基因。载体pCR3.1通过如下方面表征CMV启动子碱基1-596；推定的转录起始碱基520-625；17启动子/引发位点碱基638-657；多克隆位点碱基670-785；pCR3.1反向引发位点碱基797415；BGH多聚腺苷酸化位点碱基796-1010；ColE1起点碱基1100-1773；SV40启动子和起点碱基3178-3515；pGreenLantern-2质粒，获自GIBCO-Life Technoligies，美国(见图5)。MDV-1 gH的5’侧翼区获自GeneBank，美国，其含有位于894至1925的TK基因。pGreenLantern-2质粒含有编码水母绿色荧光蛋白(gfp)的基因，其在产生gH缺失的重组病毒过程中用作标记蛋白质。用T4聚合酶处理pGreenLantern-2的NsiI位点(位于绿色荧光蛋白质基因的CMV启动子上游)，以产生用以与含有PmeI末端的5’gH侧翼区连接的平端。
获自Tampa Bay研究所，FL，美国Meihan Nonoyama博士的质粒含有MDV-1的BamHI片段F，其包括gH的3’侧翼区(Fukuchi等人，病毒学杂志，102-109(1984))。约2.4kb区的DNA序列(此处称为3侧翼区)示于SEQ ID NO2。通过PCR克隆获得MDV-1的gH之3’侧翼区(上游引物5’AAGAT TTTTC CCAAG TCC3’；下游引物5’TCGTC GAATA ATGTG ATC3’)，且克隆入上述带有插入于NsiI位点之MDV-1的5’侧翼区的pGreenLantern-2质粒。3’侧翼区插入到NaeI位点，位于全部绿色荧光蛋白基因下游(图6)。gH和gD蛋白质在QM7细胞中的稳定表达依下述制备稳定表达MDV的gH或MDV的gD之QM7细胞。将质粒构建体pCR3 gH-HA和pCR 3gD-HA(HA标记已被加到gH和gD基因的C-端用于方便的检测)瞬时转染入QM7细胞。通过免疫荧光检验(IFA)利用抗HA单克隆抗体证实各个糖蛋白的表达(图3)。
此外，将质粒构建体pCR3 gH-HA、pCR 3gD-HA稳定地转染入QM7细胞，获得大量g418抗性细胞。通过用96孔板稀释得到单细胞克隆。使用HA单克隆抗体在免疫荧光检验中可见表达gH-HA和gD-HA蛋白质。此外，用35S(Trans Label，CN)代谢性标记细胞，用HA抗体免疫沉淀细胞裂解物。仅在获自用pCR3 gH-HA构建体转染的细胞之裂解物中存在约90kD的条带(图4)。仅在获自用pCR3gD-HA转染的细胞的裂解物中可见约50kd的宽条带(图4)。来自pCR 3载体在QMT细胞中表达的gH和gD蛋白质的大小与其预期大小十分相符。因此结果表明，QM7细胞可经改造以表达病毒复制所需的MDV蛋白质。数个单细胞克隆有非常丰富的gH-HA蛋白质表达。这些细胞系是用于互补gH功能的良好侯选者。此外，通过用pCR3 gH-HA和pCR3gD-HA共转染入QM7细胞可建立共表达gH和gD蛋白质的QM7细胞。实施例5带有gH缺失的重组MDVgHgfp+MDV-1重组子的初步鉴定质粒构建体pGL2/5’-3’gfp含有作为选择性标记的gfp(绿色荧光蛋白质)(图6)。其还含有用于同源重组的gH基因5’和3’侧翼区域，以将gfp置换gH基因。将pGL2/5’-3’gfp转染入已用652/QM7感染了的产生gH-HA的细胞。转染后四天，将培养物传代两次，每次添加新鲜的产生gH-HA的细胞。利用FACS分选全部感染的培养物，寻找表达gfp的细胞。在两孔孔板中培养找到的fgp+细胞。培养6天后，可见一些表型转化灶。此外，在紫外光下这些转化灶为绿色，提示它们为gfp+gH-MDV-1的侯选者。
由于MDV-1的细胞结合性质，将gfp+gH重组子从其野生野对应物中纯化是一项挑战性工作。然而，两次培养物传代后，许多转化灶不再呈绿色，表明野生型病毒被分隔出。利用gfp为选择性标记再用FACS分选一次这些培养物，结果分选出表明为gfp+gH-MDV-1克隆的绿色转化灶。纯化gfp+gH-重组子，且进一步用PCR和Southern印迹分析。
在将绿色荧光蛋白质基因从gH基因缺失病毒中除去的第二个重组步骤中，任选地插入来自其它非MDV病毒的异源基因。如例如鸡干扰素基因、新城疫病毒或传染性bursal病病毒等，其可替代绿色荧光蛋白质基因。与亲本绿色转化灶相反，存在白色病毒噬斑，其含有gH基因被删除且绿色荧光蛋白质基因被除去的新型重组MDV-1病毒。
已引用了一系列文献，此处将其全文引入作为参考。
本发明的范围不受所述特定实施方案的限制，其意在阐明本发明的个别方面，且功能等同的方法和成分落在本发明的范围中。实际上除了那些此处所示和所述的之外，对本领域技术人员在参考前面描述和附图后对本发明的诸多修饰是显而易见的。这样的修饰也落入后附权利要求的范围中。
序列表<110>辉瑞产品公司<120>利用连续禽细胞系制备禽麻痹病毒的方法<130>PC10483A<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2023<212>DNA<213>禽麻痹病毒<400>1acggtctctg aacaagacgg gcgataatat tagccatgtt tcgcatagcc gtacctcccg 60ttctctcctg attatttgaa aatgataaag tagccgtttt attacaagct atatgattcc 120tcaaatccgt tacgttagca gacgcctttc cactgcgtcg ttgtatatgt atcgtgtttg 180tattatgacg ttttaaaatt ttatgagtgt cagttatccg tgctttatag tcagacgcgg 240tcgccaatat agagcatagt ctatgaaaat cagtcactat gtgccttttc tttaggcaca 300tcacatgtag aacagacagt tttcgtcttg ctacaaatac taacattgga caaataacga 360tacaatctga tccttgaggc gcaatttgcc caatcagaga tttggaatcc aataactgct 420ttatgccggt gagtctttgt tcatgtttac tgcgtgtctt caggttacga gaaaatttgc 480aagtttttag ttctagaatg acgcatactc catcacagcc tacttcccac aaatcacgag 540gcaacttaaa catgcaaata caatccggtc tacgtcgttc taggtttact tcgaagacca 600atcgaaaatc cgtcaactgt ttaaatacat ctaataccat gaccttccca aaaattttgg 660caaagcttct ccccggccaa tcatacacct gagatcctag acacatcgct tctgcataaa 720gccgtttgta aaagcgatcg tgacatcgaa caccagccgc 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1.一种制备MDV的方法，包括培养用编码MDV的核苷酸感染或转染的连续鹌鹑细胞系，前提是所述鹌鹑细胞系不是含有MDV血清型2或3的QT35。
2.权利要求1的方法，其中鹌鹑细胞系是连续鹌鹑肌成肌细胞细胞系。
3.权利要求1的方法，其中核苷酸序列编码一种天然存在的MDV。
4.权利要求1的方法，其中核苷酸序列编码一种重组MDV。
5.权利要求4的方法，其中MDV是一种重组分子，包含MDV的核酸序列以及至少一种插入到所述MDV的核酸序列中的异源基因或其片段。
6.权利要求4的方法，其中MDV是一种重组分子，包含其中一种或多种基因、调节遗传元件或其片段被删除的MDV的核酸序列。
7.权利要求6的方法，其中被删除的基因是复制必需的。
8.权利要求7的方法，其中被删除的基因是gH或其片段。
9.权利要求1或2的方法，其中MDV选自单独地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一组合。
10.权利要求1或2的方法，其中MDV是一种病毒，用于制备在禽类中可诱导抵抗疾病的保护反应的疫苗。
11.权利要求1或2的方法，其中MDV是MDV-1的652株。
12.权利要求11的方法，其中细胞系是ATCC CRL-12600。
13.一种连续鹌鹑肌成肌细胞细胞系，含有编码MDV的核苷酸序列。
14.权利要求13的连续细胞系，其中MDV是天然存在的MDV。
15.权利要求13的连续细胞系，其中MDV是重组MDV。
16.一种获自连续鹌鹑肌成肌细胞细胞系的细胞裂解物，含有编码MDV的核苷酸序列。
17.权利要求15的细胞系，其中重组MDV包含MDV的核酸序列或其片段，且含有至少一种插入到所述MDV的核酸序列中的异源基因或其片段。
18.权利要求15的细胞系，其中重组MDV包含其中一种或多种基因、调节遗传元件或其片段被删除的MDV的核酸序列。
19.权利要求18的细胞系，其中被删除的基因是复制必需的。
20.权利要求19的细胞系，其中被删除的基因是gH或其片段。
21.权利要求13的细胞系，其中MDV选自单独地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一组合。
22.权利要求13的细胞系，其中MDV一种病毒，用于制备在禽类中可诱导抵抗疾病的保护反应的疫苗，其中的疾病是下列病毒感染的结果MDV、新城疫病毒、传染性Bursel病病毒、幼鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒、网状内皮组织增殖病毒或禽流感病毒。
23.一种制备MDV疫苗的方法，包括培养用编码MDV感染或转染的连续鹌鹑成肌细胞细胞系，且从中收获细胞培养物成分。
24.一种制备含有编码MDV基因组的核苷酸序列的连续鹌鹑细胞系的方法，包括培养连续鹌鹑细胞系，该细胞系中含有编码天然存在的MDV或重组MDV的核苷酸序列。
25.权利要求24的方法，其中鹌鹑细胞系是鹌鹑肌成肌细胞细胞系。
26.一种疫苗，其包含用权利要求1的方法制备的MDV以及适当的药物载体。
27.权利要求26的疫苗，其中MDV是天然存在的MDV。
28.权利要求26的疫苗，其中MDV是重组MDV。
29.权利要求28的疫苗，其中MDV是一种重组分子，包含MDV的核酸序列以及至少一种插入到所述MDV的核酸序列中的异源基因或其片段。
30.权利要求28的疫苗，其中MDV是一种重组分子，包含其中一种或多种基因、调节遗传元件或其片段被删除的MDV的核酸序列。
31.权利要求30的疫苗，其中被删除的基因是gH或其片段。
32.权利要求26的疫苗，其中MDV选自单独地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一组合。
33.权利要求23的疫苗，其中MDV是MDV-1的652株。
34.权利要求29的疫苗，其中细胞系是ATCC CRL12600。
35.一种保护动物抵抗疾病的方法，其通过向所述动物施用权利要求26的疫苗，其中的疫苗经改造以诱导针对如下病毒的保护性反应，所述病毒选自MDV、新城疫病毒、传染性Bursel病病毒、传染性支气管炎病毒、幼鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒、网状内皮组织增殖病毒或禽流感病毒。
36.权利要求35的方法，其中的动物是禽类。
全文摘要
本发明涉及可有效支持禽麻痹病病毒以高滴度生长和生产性感染的禽细胞系。本发明也涉及已被改造以支持重组禽麻痹病病毒以高滴度生长和生产性感染的禽细胞系。本发明涉及用于以适合免疫接种目的的量制备禽麻痹病病毒的方法。
文档编号A61K48/00GK1256310SQ9912289
公开日2000年6月14日 申请日期1999年12月9日 优先权日1998年12月9日
发明者S·龙, M·G·夏弗德 申请人:辉瑞产品公司