专利名称：稳定的蛋白质组合物的利记博彩app
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本发明涉及稳定的蛋白质组合物。本发明所述稳定的组合物可以用于在持续时期内给哺乳动物(包括人、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗和猫)递送治疗有效量的包括集落刺激因子，例如牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)在内的蛋白质。更具体地说，本发明的稳定的组合物含有稳定缓冲液如HEPES、TES和TRICINE，它们能够保持体内和体外持续的时期的蛋白质活性。
制备具有延长的保存期的体内和体外活性的治疗有效的蛋白质制剂(如G-CSF)仍是一个难题。这种蛋白质制剂必须能在适当的时期内保持其活性和生物学完整性以便保证有效的治疗。另外，这种蛋白质制剂必须是可制备的，并且能以药物可接受的方式给药动物。
已有提供冷冻或冻干形式的蛋白质药物组合物，在能将蛋白质活性维持期延长的储存条件下进行体外保藏。在使用前将冻干制品与药物可接受的稀释剂(例如注射用无菌水)重新组合。蛋白质医药组合物也有以液体形式提供的。由于蛋白质随时间丧失活性，这种液态蛋白质制剂难以储存，特别是在高温状态。
治疗有效的蛋白质制剂，无论是固态(冻干)或液体形式，很难以那些不会在给药后突然失活的方式给药动物，例如通过皮下注射给予动物。蛋白质在注射位点的迅速失活使蛋白质不便用于治疗哺乳动物感染，因为有效的治疗要求在所需恢复期间保证每日的剂量。粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)(如牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)在40℃或更高温度由于失去二级结构、二硫键交换而不稳定并由此导致失活。因为牛的体温约40℃，注射部位处于生理pH范围，在注射部位即会发生失活。
已知有多种有延长的保存期的蛋白质制剂。美国专利5,104,651(Boone等人，1992年4月14授权)涉及一种G-CSF和pH在3.0-3.7的酸组成的药物组合物，其导电率低于1000μmhos/cm。美国专利4,992,271(Fernandes等，1991年2月12授权，)涉及一种药物组合物，它含有溶于pH6.8-7.8的水基载体介质的生物学活性重组白介素2蛋白质，它还含有蛋白质的稳定剂(如人血清白蛋白)。美国专利4,623,717(Fernandes等，1986年11月18授权)涉及巴斯德灭菌的治疗活性蛋白质组合物，它是通过在灭菌前将能产生稳定作用的用量的糖或还原糖以及氨基酸与蛋白质混合使该热敏感的治疗活性蛋白质巴斯德灭菌。美国专利4,645,830(Yasushi等，1987年2月24日授权)涉及一种稳定的白介素2组合物，在pH 3到6的溶液中含有白介素2、人血清白蛋白和一种还原化合物。美国专利4,647,454(Cymbalista，1987年3月3日授权)涉及一种用聚乙烯吡咯烷酮稳定人成纤维细胞干扰素的方法。美国专利4,675,184(Hasegawa等，1987年6月23日授权)涉及一种治疗病毒感染的药物组合物，其中含有干扰素、三或多羟糖醇，有机缓冲液和药用载体或稀释剂，这种组合物的pH大约3到6。上述文献全文引作参考。
一例有疗效的蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是几种糖蛋白生长因子(称为集落刺激因子)之一。这类集落刺激因子能支持造血祖细胞的增殖，并刺激特异骨髓前身细胞的增殖及它们分化形成粒细胞。另外，G-CSF能够刺激嗜中性粒细胞集落的形成并体外诱导鼠骨髓单核白血病细胞的晚期分化。G-CSF还显示出能刺激嗜中性粒细胞的功能活性导致其杀微生物活性增强。已知G-CSF有174个氨基酸的氨基酸序列。
已经制备出重组形式的CSFs和G-CSFs。编码人G-CSSF的DNA的克隆和表达是已知技术(Nagata，S等，自然319415-418(1986))。WO-A-8604606和WO-A-8604506描述了编码人G-CSF的基因。美国专利5,606,024(Boone等，1997年2月25日授权)和美国专利5,472,857(1995年12月5日授权)描述了编码犬粒细胞集落刺激因子(cG-CSF)的DNA序列以及一种通过将有效量的人和犬G-CSF给予犬科或猫科动物来治疗或抑制这些动物感染的方法。美国专利4,810,643(Souza，1989年3月7日授权)描述了人G-CSF样多肽。欧洲专利申请719860(1996年7月3日公开)描述了天然存在的牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)的氨基酸序列、编码bG-CSF的DNA序列以及通过给予动物有效量G-CSF来治疗或抑制动物乳腺炎的方法。WO-A-8702060描述了人G-CSF样多肽、它们的编码序列和制备方法。美国专利4,833,127(Ono等，1989年5月23日授权)描述了一种新的生物活性人粒细胞集落刺激因子。欧洲专利申请612846(1994年8月31日公开)描述了某些G-CSF类似物和含有这些类似物的组合物(上述文献全文引作参考)。
粒细胞集落刺激因子可以用作抗感染试剂，它能提高动物的免疫力，而不是作用在特定的生长或毒性必需的微生物靶上。很少有其他兽医用商品试剂作用于非特异性免疫反应，从而提高对微生物感染的抗性，已有的有效控制方法仅限于常规抗菌药和有限数量的生物制品。牛奶减产造成的经济损失限制了常规抗菌药的使用。目前的疫苗仅作用于有限数量的种类，并且这些试剂在野外的药效变化很大。最成功的疫苗(大肠杆菌J5)由于其内毒素污染引发的安全问题限制了它们在世界范围的使用。
乳腺炎是影响全世界奶制品生产者的主要疾病。在美国，每年由乳腺炎造成的经济损失超过10亿元。损失涉及死亡率、奶品丢弃、产奶量急速和缓慢减少、早年杀死的牛以及兽药和畜牧劳力费用增多。围生期的奶牛免疫反应性(嗜中性粒细胞的功能)减弱，这就使它们的乳腺更易受到细菌感染。大约40％新出现的临床乳房内感染发生在分娩后的头两周内，这一事实可以说明易感性增加所造成的影响。乳腺炎与很多种病源菌(包括革兰氏阳性和阴性菌)有关。已知能引发乳腺炎的病源微生物有大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。这些病源菌通过奶道进入乳房，使产奶组织发炎，导致形成疤痕组织，造成永久丧失产奶力。各种形式的乳腺炎包括乳房感染、慢性乳腺炎、临床乳腺炎和亚临床乳腺炎。
目前的抗菌素疗法和疫苗有许多缺陷，限制了它们在哺乳期奶牛中的使用。已经发现用抗生素疗法控制乳腺炎是不够的。因此需要一种有助于恢复正常的免疫力，降低乳腺炎发生率和严重程度的生物治疗剂。
牛呼吸道疾病，又称为斑疹伤寒，是另一种常见的侵染牛的疾病。牛被船运到饲养厂或牧场后由于受到各种压力(包括断奶、阉割、割角、禁食、拥挤、接触感染物质、饮食和温度变化)，同时受到某种已知病原菌的感染而染上牛呼吸道疾病。溶血性巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)即是一种常见的导致牛呼吸系统损伤的病原菌。
还知道另外几种感染性疾病(包括各种生殖疾病)能侵染人、猪、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊。一例这种疾病(在牛中发病)是子宫炎。
因此需要一种稳定的蛋白质组合物，它在体内保持延长的疗效期。另外，还需要体外储存保存期和储存期延长的蛋白质制剂。
本发明涉及一种包含蛋白质和稳定缓冲液的稳定的蛋白质组合物，所述组合物能够在持续时期内维持该蛋白质的疗效水平。
本发明的具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，所述组合物处于生理pH值。
本发明的其他具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，所述组合物处于生理温度。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明还有其它实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述持续时期是至少大约3天。
本发明还有其它实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质选自集落刺激因子、生长激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗体和抗原。
本发明更具体的实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质选自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
本发明更具体的实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是G-CSF，该G-CSF的浓度在0.01到5mg/ml范围内。
本发明另一个实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是G-CSF，稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明其它更具体的实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是G-CSF，稳定缓冲液的浓度在大约0.05M到大约2M范围内。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是G-CSF，所述组合物处于生理pH值。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是G-CSF，所述组合物处于生理温度。
本发明更具体的实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF，该bG-CSF的浓度在0.01到5mg/ml范围内。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF，稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF，稳定缓冲液的浓度在大约0.05M到大约2M范围内。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF，所述组合物处于生理pH值。
本发明其它具体实施方案包括一种稳定的蛋白质组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF，所述组合物处于生理温度。
优选，本发明所述稳定的蛋白质组合物是含有溶于HEPES缓冲液的牛G-CSF的组合物。更优选的是，HEPES缓冲液浓度为大约0.05M到大约2M。该牛G-CSF制剂优选处于生理pH值(例如7.5)。而且，这种优选的牛G-CSF制剂能够在持续时间内(从大约至少3天到7天或更长)维持牛G-CSF的疗效水平。
另外，本发明所述稳定的蛋白质组合物是含有溶于HEPES缓冲液的牛G-CSF的组合物，该组合物能保证延长的保存期和保存期。优选HEPES缓冲液浓度为大约0.05M到大约2M。更优选该组合物pH维持在大约4.0-大约7.5，优选4.0，温度维持在低于大约40℃，优选大约4℃。延长的保存期和保存期为大约3周到大约18个月，优选，在大约6周到大约1年。
本发明还涉及非肠道给予哺乳动物的稳定的蛋白质组合物的药物学可接受剂型，它包含蛋白质和药用可接受的稳定缓冲液，该组合物能够在持续时期内维持所述蛋白质的疗效水平，其中的蛋白质含量足够将哺乳动物保护延长的一段时期。
本发明的具体实施方案包括一种药物学可接受剂型，其中该剂型还包含选自粘性调节剂和表面活性剂的组分。
本发明还涉及非肠道给予哺乳动物的稳定的蛋白质组合物的药物学可接受剂型的制备方法，该方法包括将蛋白质和稳定缓冲液组合的步骤，这种稳定的蛋白质组合物能够在持续时期内维持所述蛋白质的疗效水平，其中蛋白质含量足够将哺乳动物保护至少3天。
本发明还涉及治疗或防止哺乳动物感染的方法，该方法包含给予哺乳动物稳定的蛋白质组合物，包含给予哺乳动物治疗有效量的稳定的蛋白质组合物，其中所述稳定的蛋白质组合物含有蛋白质和稳定缓冲液，该组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持持续时期。
本发明的具体实施方案包括这种治疗或防止哺乳动物感染的方法，其中所述蛋白质是G-CSF。
本发明还涉及治疗或预防牲畜乳腺炎、子宫炎或牛呼吸道疾病的方法，它包括给予哺乳动物稳定的G-CSF组合物，包括给予哺乳动物治疗有效量的稳定的G-CSF组合物，其中所述稳定的G-CSF组合物含有G-CSF和稳定缓冲液，该组合物能够在持续时期内维持所述蛋白质的疗效水平。
本发明还涉及将蛋白质在哺乳动物体内的疗效水平维持一段持续时期的方法，该方法包括以稳定的蛋白质组合物对哺乳动物给药，其中所述稳定的蛋白质组合物含有蛋白质和稳定缓冲液，该组合物能够在持续时期内维持所述蛋白质的疗效水平。
本发明的具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内蛋白质的疗效水平的方法，其中所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内蛋白质的疗效水平的方法，其中所述持续时期是至少大约3天。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内蛋白质的疗效水平的方法，其中所述蛋白质选自集落刺激因子、生长激素、细胞因子、抗体和抗原。细胞因子的具体例子包括白介素(例如白介素1-18)和干扰素(例如干扰素α、β和γ)。
本发明更具体的实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内蛋白质的疗效水平的方法，其中所述蛋白质是一种集落刺激因子。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内蛋白质的疗效水平的方法，其中所述蛋白质选自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内G-CSF的疗效水平的方法，其中所述G-CSF的浓度为0.01到5mg/ml。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内G-CSF的疗效水平的方法，其中所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内G-CSF的疗效水平的方法，其中所述稳定缓冲液的浓度在大约0.05M到大约2M。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内G-CSF的疗效水平的方法，其中所述G-CSF是牛G-CSF。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内bG-CSF的疗效水平的方法，其中所述bG-CSF的浓度为0.01mg/ml到5mg/ml。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内bG-CSF的疗效水平的方法，其中所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
本发明其它具体实施方案包括这种在持续时期内维持哺乳动物体内bG-CSF的疗效水平的方法，其中所述稳定缓冲液的浓度为大约0.05M到大约2M。
本发明还涉及用于将稳定的蛋白质组合物给药哺乳动物的试剂盒，它包括含有治疗有效量蛋白质的第一个容器和含有药物可接受的稳定缓冲液的第二个容器，其中当所述第一个容器中的治疗有效量蛋白质与第二个容器中的药物可接受的稳定缓冲液合并时，能够在持续时期内在哺乳动物体内维持该蛋白质的疗效水平。
本发明的具体实施方案包括其中所述蛋白质含量足够将哺乳动物保护至少3天的试剂盒。
本发明优选的组合物是含有牛G-CSF和HEPES缓冲液的稳定蛋白质组合物，这种组合物能够在体内将哺乳动物中的牛G-CSF的疗效水平维持至少3天，其中该组合物pH值约为7.5，温度约为生理温度或40℃。这种组合物在所述哺乳动物是奶牛时特别有用。更具体地说，HEPES缓冲液浓度在大约0.05M到大约2M范围内。特别优选的是HEPES缓冲液浓度约为1M。优选，牛G-CSF浓度为大约0.01到5mg/ml。最优选bG-CSF浓度约为0.1mg/ml。
优选，本发明还涉及一种含有牛G-CSF和HEPES缓冲液的稳定蛋白质组合物，该组合物能够保证约3周到约18个月范围内的延长保存期。特别优选其中所述HEPES缓冲液浓度为大约0.05M到大约2M。同时优选组合物pH值约为7.5，其温度低于大约40℃，最优选大约4℃。同样特别优选延长的保存期从约6个月到约1年。或者，这种保存期延长的稳定组合物能维持组合物的温度在大约40℃。
图1表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图。在40℃，HEPES缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图2表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图，在40℃，TES缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图3表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图，在40℃，TRICINE缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图4表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图，在40℃，HEPES缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图5表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图，在40℃，TES缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图6表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的稳定性(回收率％)对时间的函数图，在40℃，TRICINE缓冲液浓度为0.1M、1M和2M的储存条件下。
图7表示牛外周血PMN总数(用对照的百分数表示，0小时的数值)，牛是用在水、1M HEPES缓冲液、1M TES缓冲液和1M TRICINE缓冲液中制备的bG-CSF处理过的。
图8表示bG-CSF(mg/ml浓度)的稳定性对时间的函数图，bG-CSF溶在Neupogen缓冲液(对照，pH4.0)、HEPES缓冲液(pH7.4)、PBS缓冲液(pH7.0)、Hanks缓冲液(pH8.5)和重碳酸盐缓冲液(pH8.2)中。
图9表示于40℃，溶在1000mM、500mM、100mM、50mM和20mM的HEPES缓冲液中的bG-CSF(mg/ml浓度)的稳定性(回收率％)对时间的函数图。
图10表示两种bG-CSF溶液对温度(℃)的两个温谱图(kcal/mole/deg)。上面的图(最高温度为47℃)是在PBS(pH7.5)中制备的bG-CSF，下面的图(最高温度为59℃)是在1M HEPES(pH7.5)中制备的bG-CSF。
图11表示三种制剂的牛PMN(嗜中性粒细胞)％对时间的函数图溶于水的bG-CSF(对照)、溶于1M HEPES的bG-CSF以及溶于1M HEPES+10％polaxamer的bG-CSF。
图12表示溶于1M HEPES缓冲液(pH7.5)的bG-CSF的溶解度，相对bG-CSF浓度(mg/ml)测得的310nm吸光度。
图13表示溶于1M HEPES缓冲液和PBS的牛G-CSF在40℃的稳定性(起始浓度的％)。
图14表示溶于1M HEPES缓冲液和PBS的人G-CSF在40℃的稳定性(起始浓度的％)。
图15比较了溶于1M HEPES缓冲液(pH7.5)的人G-CSF和牛G-CSF的稳定性(起始浓度的％)。
图16表示40℃时，溶于1M HEPES缓冲液(pH4.0)的bG-CSF随时间(天)的起始浓度百分比。
图17表示40℃时，溶于1M HEPES缓冲液(pH7.5)的bG-CSF随时间(天)的起始浓度百分比。
图18表示40℃时，溶于1M TES缓冲液(pH4.0)的bG-CSF随时间(天)的起始浓度百分比。
图19表示40℃时，溶于1M TES缓冲液(pH7.5)的bG-CSF随时间(天)的起始浓度百分比。
图20表示储存于5℃的样品随时间(周)的RP HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图21表示储存于5℃的样品随时间(周)的SE HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图22表示储存于30℃的样品随时间(周)的RP HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图23表示储存于30℃的样品随时间(周)的SE HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图24表示储存于40℃的样品的RP HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图25表示储存于40℃的样品随时间(周)的SE HPLC结果(％起始bG-CSF浓度)。
图26是bG-CSF的CD(圆二色性)谱。
图27是222nm波长的摩尔椭圆率对温度的函数图。
图28表示40℃时，溶于各种浓度HEPES缓冲液(pH7.5)的bG-CSF随时间(天)的起始浓度百分比。
图29是在1M HEPES中制备的bG-CSF比照对照制剂的WBC，相对注射后时间(以小时计)的图。
本发明涉及稳定的蛋白质组合物，本发明是基于这一惊人的发现可以通过向蛋白质中添加稳定缓冲液，例如HEPES、TES和TRICINE来稳定蛋白质，具体说是用于治疗哺乳动物(例如人、狗、猫、山羊、绵羊、马和猪)感染的蛋白质，从而稳定的蛋白质组合物能在持续时间内维持蛋白质活性(体内和体外)。就体内活性而言，本发明所述稳定的蛋白质组合物能在持续时间内将这些蛋白质在哺乳动物体内维持在疗效水平。
具体说，本发明是溶于稳定缓冲液(例如HEPES或TES)的bG-CSF缓释(有持续活性)制剂，它能提供延长的药物活性。已知bG-CSF在40℃左右变性，在中性pH不稳定。这是问题所在，因为奶牛的生理pH即接近中性，体温约为40℃。
本发明所述稳定组合物中的蛋白质可以是天然存在的蛋白质、分离或纯化的蛋白质或者是重组方法制备的蛋白质。本发明还包括所有的化学修饰过的蛋白质化学修饰体(例如甲硫氨酸氧化、半胱氨酸S-烷基化和β-巯基乙醇添加的二硫化物、赖氨酸氨基的烷化等)。用于本发明所述稳定蛋白质组合物的优选蛋白质是G-CSF，最优选bG-CSF。
G-CSF是指粒细胞集落刺激因子，包括天然形态的粒细胞集落刺激因子及各种变体和突变体，包括例如有1或多个氨基酸缺失、取代和/或添加的重组变体。这些变体和突变体保留了全部或足够在哺乳动物体内发挥疗效的生物学活性。天然形态的G-CSF是一种糖蛋白，它包括174个氨基酸组成的蛋白质和有三个附加氨基酸的形式。两种形式都有5个半胱氨酸残基，4个形成两个二硫键，一个处于游离形态。
其他适用于本发明所述稳定的蛋白质组合物的蛋白质的例子包括例如激活素、粘着分子(如L-选择蛋白、CD-18和IGAM-1)、趋化因子、趋化因子、促红细胞生成素、生长因子、抑制素、胰岛素、干扰素(如α、β、γ)；白介素(如白介素1-18)、leptin、巨噬细胞炎性蛋白、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞刺激蛋白、神经营养蛋白、嗜中性粒细胞抑制因子、制瘤素、生长抑素、生长激素(所有种的，例如猪、牛或人)、干细胞因子、肿瘤坏死因子、血小板生成素以及上述所有蛋白质的细胞相关和可溶受体及在给药哺乳动物时能提供有益或治疗效果的任何和所有其它蛋白质。能够应用在本发明所述稳定蛋白质组合物的具体蛋白质的例子见表1。其它能够用于本发明所述稳定蛋白质组合物的蛋白质包括引作参考文献的R&D Systems Catalogue(614 McKinley PlaceNE，Minneapolis MN 55413，USA)中描述的蛋白质。
表1潜在的疗效蛋白质β2-微球蛋白(β2-M)6-组氨酸6Ckine双调蛋白(AR)血管生成素(ANG)膜联蛋白VB-淋巴细胞粘着分子(BL-CAM)β内皮细胞生长因子(β-ECGF)β神经生长因子(β-NGF)β肌动蛋白(β-Actin)β动物纤维素(BTC)脑源神经营养因子(BDNF)CD31(PECAM-1)CDIO睫状神经营养因子(CNIF)睫状神经营养因子受体α(CNTF Rα)CRG-2(IP-10)CXCR-1(IL-8 RA)CXCR-2(IL-8 RB)CXCR-3CXCR-4(融合素)细胞因子-诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1(CINC-1)细胞因子-诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β(CINC-2β)细胞因子-诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α(CINC-2α)细胞毒性T淋巴细胞关联分子4(CTLA-4)E-选择蛋白内皮素-1(ET-1)
表1(续)潜在的疗效蛋白质Eotaxin(Eot)Eotaxin-2(Eot-2)表皮生长因子(EGF)上皮衍生嗜中性粒细胞吸引剂78(ENA-78)红细胞生成素受体(Epo R)红细胞生成素(Epo)Fas(CD95)成纤维细胞生长因子4(FGF-4)成纤维细胞生长因子5(FGF-5)成纤维细胞生长因子6(FGF-6)成纤维细胞生长因子7/KGF(FGF-7)成纤维细胞生长因子8(FGF-8)成纤维细胞生长因子8b(FGF-8b)成纤维细胞生长因子8c(FGF-8c)成纤维细胞生长因子9(FGF-9)酸性成纤维细胞生长因子(酸性FGF)碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)纤连蛋白(FN)Fit-1Fit-3配体Fractalkine胶质细胞系-衍生神经营养因子(GDNF)糖蛋白130(gp130)粒细胞趋化蛋白(GCP-2)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)粒细胞集落刺激因子受体(G-CSF R)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSF)
表1(续)潜在的疗效蛋白质生长相关蛋白(GRO)生长相关蛋白α(GROα)生长相关蛋白β(GROβ)生长相关蛋白γ(GROγ)血过滤CC趋化因子I(HCC-1)肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)肝细胞生长因子(HGF)Heregulin α(HRG-α)Heregulin β1(HRG-β1)I-309胰岛素样生长因子(IGF-1)干扰素γ(IFNγ)白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)白介素11受体(IL-11R)白介素12 p70(IL-12 p70)白介素13(IL-13)白介素16(IL-16)白介素2受体α(IL-2 Rα)白介素2受体β(IL-2 Rβ)白介素3(IL-3)白介素4受体(IL-4 R)白介素5(IL-5)白介素7受体(IL-7 R)白介素9(IL-9)IP-10JE/MCP-1角质形成细胞生长因子/FGF-7(KGF)
表1(续)潜在的疗效蛋白质L-选择蛋白潜伏相关肽(TGF-β1)(LAP TGF-β1)潜在转化生长因子β1(潜在TGF-β1)Lepfln(OB)Leptin受体(Leptin R)白血病抑制因子受体α(LIF Rα)白血病抑制因子(LIF)LFA-1胰岛素样生长因子I受体(IGF-I R)胰岛素样生长因子II(IGF-II)胞间粘着分子3(ICAM-3)胞间粘着分子1(ICAM-1)白介素11(IL-11)白介素1受体I型(IL-1 R1)白介素10(IL-10)白介素10受体(IL-10 R)白介素12(IL-12)白介素12p40(IL-12p40)白介素13受体α(IL-13 Rα)白介素15(IL-15)白介素17(IL-17)白介素18/1G1F(IL-18)白介素2(IL-2)白介素2受体γ(IL-2 Rγ)白介素3受体α(IL-3 Rα)白介素4(IL-4)白介素5受体α(IL-5 Rα)
表1(续)潜在的疗效蛋白质白介素6(IL-6)白介素6受体(IL-6R)白介素7(IL-7)白介素8(IL-8)白介素9受体(IL-9R)白介素Iα(IL-Iα)白介素Iβ(IL-Iβ)白介素I受体II型(IL-I RII)Mac-1α链巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSF R)巨噬细胞炎性蛋白1γ(MIP-1γ)巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α)巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP-3β)巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)巨噬细胞刺激蛋白(MSP)巨噬细胞衍生趋化因子(MDC/DC-CK1)MARC/MCP-3Midkine(MK)MIG单核细胞趋化蛋白1/MCAF(MCP-1)单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)单核细胞趋化蛋白4(MCP-4)
表1(续)潜在的疗效蛋白质单核细胞趋化蛋白5(MCP-5)神经细胞粘着分于(NCAM)神经营养蛋白3(NT-3)神经营养蛋白4(NT-4)有潜在疗效制瘤素M(OSM)P-选择蛋白(CD62P)胎盘生长因子(PIGF)胎盘生长因子2(PIGF-2)血浆硒谷胱甘肽过氧化物酶血小板GPIIb/GPIII a(CD41a)血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)血小板衍生生长因子(PDGF)血小板衍生生长因子A链(PDGF A链)血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)血小板衍生生长因子B链(PDGF B链)血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)血小板衍生生长因子受体α(PDGF Rα)血小板衍生生长因子受体β(PDG-F Rβ)多向素(PTN)前B细胞生长刺激因子/SDF-1(PBSF)RANTES分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)干细胞因子受体(SCF R)干细胞因子(SCF)基质细胞衍生因子1β/PBSF(SDF-1β)
表1(续)潜在的疗效蛋白质基质细胞衍生因子1/PBSF(SDF-1)基质细胞衍生因子1α/PBSF(SDF-1α)血小板生成素(Tpo)胸腺和激活调节趋化因子(TARC)胸腺表达趋化因子(TECK)转化生长因子α(TGF-α)转化生长因子β(TGF-β)转化生长因子β1.2(TGF-β1.2)转化生长因子β2(TGF-β2)转化生长因子β结合蛋白I(TGF-βbpI)转化生长因子β1(TGF-β1)转化生长因子βII型受体(TGF-βRII)转化生长因子βIII型受体(TGF-βRIII)转化生长因子/β5(YGF-β5)转化生长因子β3(TGF-β3)TrkB肿瘤坏死因子α(TNF-α)肿瘤坏死因子β(TNF-β)肿瘤坏死因子I型受体(TNF RI)肿瘤坏死因子II型受体(TNF RII)血管细胞粘着分子1(VCAM-1)血管内皮生长因子(VEGF)优选的蛋白质是能用于治疗或防止哺乳动物(如人、狗、牛、猪、山羊、绵羊、马和猫)感染的蛋白质。所述感染可以是细菌感染或原生动物感染，或者是由病毒引起的。
本文中(除非另有说明)的术语“感染”包括发生在哺乳动物中的细菌性、原生动物、真菌和病毒感染，以及与这些感染有关的，可以通过给药本发明所述稳定蛋白质组合物进行治疗或预防的疾病。
能用本发明所述稳定蛋白质组合物进行治疗的感染性疾病包括(不仅限于)牛的感染性疾病，例如与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏杆菌、棒状杆菌(不仅限于这些菌)相关的牛乳腺炎；与感染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、副流感病毒(PI3)、牛病毒性腹泻病毒(BVD)、溶血性巴斯德氏菌、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)相关的牛呼吸道疾病；生殖系统疾病(如子宫炎)；与大肠杆菌和艾美球虫(Eimeria sp.)(不仅限于这些)相关的牛腹泻。
其它能用本发明所述稳定蛋白质组合物治疗的感染疾病包括(但不限于)狗的感染性疾病(如脓皮病)以及狗的呼吸道疾病，又称为kennel cough。
本发明所述稳定蛋白质组合物还能提供治疗或预防感染之外的疗效。治疗或预防感染之外的疗效的一个例子是将重组人G-CSF给药狗和猫来改进化学疗法导致的骨髓抑制，从而使它们能接受更具攻击性的癌症治疗手段。
本文中(除非另有说明)的“稳定”一词表示在一段持续时期内维持蛋白质的疗效水平。所述维持蛋白质的疗效水平是发生于将本发明所述蛋白质组合物给予哺乳动物之后，或者体外使用前或储存期间。可以利用文中描述的方法，通过相对于时间的起始浓度的百分比测定本发明所述蛋白质组合物的稳定性。
将本发明所述稳定蛋白质组合物给药哺乳动物后，它能使蛋白质维持疗效水平，从而蛋白质能在持续时期内提供治疗或有益效果。本文中(除非另有说明)术语“持续时期”表示在将本发明所述稳定蛋白质组合物给予哺乳动物后或者可选择地体外使用前或储存期间能维持蛋白质疗效水平的一段时间。
持续时期的蛋白质疗效水平能在哺乳动物体内保证更长时期的改善或治疗作用，比将同样的蛋白质给予哺乳动物而没有稳定缓冲液的可能时间更长，例如与蛋白质溶于水或PBS的对照溶液比较。或者，在体外储存的条件下，持续时期的蛋白质疗效水平能提供更长时期内增强的蛋白质稳定性，比没有稳定缓冲液存在时可能将相同的蛋白质储存的时间更长，例如与蛋白质溶于水或PBS的对照溶液相比)。优选，持续期至少3天。最优选，持续期大约7天或更长。
文中(除非另有说明)使用的术语“疗效水平”表示在各种给药疗法中产生治疗作用的蛋白质的用量。本领域技术人员很容易确定这个量。蛋白质的用量取决于感染的类型和严重程度、给药途径等。
“稳定缓冲液”是指任何在与本发明所述稳定组合物中的蛋白质结合后，能提供稳定的蛋白质组合物的缓冲液，该组合物能够在持续时期内维持所述蛋白质的疗效水平。疗效水平的维持可以通过本领城已知的方法(例如，测量蛋白质活性)确定。优选，稳定缓冲液在生理pH下操作。稳定缓冲液包括，但不限于有机缓冲液(例如通常称为“优良缓冲液”，在pH6到8.5操作的那些两性离子缓冲液)。这样的稳定缓冲液实例包括HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)和TRICINE(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、二甲次砷酸、双(2-羟乙基)-亚氨基-三(羟甲基)甲烷(BISTRIS)、哌嗪-N，N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、咪唑和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。能够用于本发明所述稳定蛋白质组合物的缓冲液的例子见表2。
表2
本发明所述稳定蛋白质组合物的pH可以在大约4.0到大约8的范围内。
文中(除非另有说明)使用的术语“生理pH”表示存在于哺乳动物(包括人、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗和猫)的pH范围。哺乳动物的生理pH通常在大约6.5到大约8.0的范围内。
本发明所述稳定蛋白质组合物的温度可以在约20℃到约50℃的范围内。
文中(除非另有说明)使用的术语“生理温度”表示存在于哺乳动物(包括人、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗和猫)的体温范围。哺乳动物的生理温度通常在大约37℃到大约41℃的范围内。某些代表性哺乳动物的生理温度如下人37℃；牛39℃；猫38℃；狗39℃；山羊39℃；马37℃；和猪37℃。
优选，本发明所述稳定蛋白质组合物含有蛋白质G-CSF，更优选，溶于稳定缓冲液的牛G-CSF，该缓冲液选自HEPES缓冲液、TES缓冲液和TRICINE缓冲液。所得稳定蛋白质组合物能在牛的生理pH和其大约40℃的生理温度，将疗效水平的bG-CSF活性维持至少3天的持续时间。
利用已知的常用结合技术，通过结合蛋白质和稳定缓冲液制备稳定蛋白质组合物。制备稳定蛋白质组合物的特定方法包括使用根据本领域技术人员已知的蛋白质纯化技术制备的纯化形式的蛋白质。
对于有医疗价值的特定蛋白质，可以将该蛋白质(以其最大溶解度)溶于不同浓度，如从0.05到2M的各种缓冲液，例如HEPES、TES、TRICINE或其它缓冲液。另外，溶液的pH是可变的，通常从大约pH4.0到大约8.0。蛋白质在特定缓冲液中的最大溶解度可以通过本领域已知的常规手段确定。随后可将溶液储存于该蛋白质溶液将要给药的哺乳动物的生理温度，确定蛋白质在溶液中的量(作为时间的函数)。溶液中的疗效水平的蛋白质可以通过蛋白质的回收％确定(作为时间的函数)。可以将蛋白质的残留量或回收％与已知的蛋白质产生疗效所需阈值水平进行比较。然后可将溶液中残留的蛋白质的量等于或大于已知的蛋白质产生疗效所需阈值水平的天数定为持续时间。可作为稳定缓冲液的缓冲液是这样的缓冲液，当其与特定蛋白质结合时，能将蛋白质的疗效水平维持延长的时间，即比没有稳定缓冲液时，将相同蛋白质给药哺乳动物可能的时间长。
可以通过测量蛋白质活性(对时间的函数)确定蛋白质的稳定性。蛋白质的伸展温度(Tm)可以作为溶液稳定性以及蛋白质在体内的稳定性的标志。特定蛋白质的伸展温度表示蛋白质失去二级结构，通常也失去活性的温度，这可以用本领域技术人员已知方法，例如差示扫描热量测定法测定。
本发明所述稳定蛋白质组合物中的蛋白质含量可以在大约0.1mg/ml到大约5mg/ml。对于G-CSF，优选的范围在大约0.1mg/ml到大约3mg/ml。
根据本发明，稳定蛋白质组合物的一个例子是一种含有bG-CSF和HEPES缓冲液的组合物，其中所述bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约5mg/ml，HEPES缓冲液的浓度范围为大约0.1M到大约2M。更优选bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约3mg/ml。
根据本发明，稳定蛋白质组合物的另一个例子是一种含有bG-CSF和TES缓冲液的组合物，其中所述bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约5mg/ml，TES缓冲液的浓度范围为大约0.1M到大约2M。更优选bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约3mg/ml。
根据本发明，稳定蛋白质组合物的再一个例子是一种含有bG-CSF和TRICINE缓冲液的组合物，其中所述bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约5mg/ml，TRICINE缓冲液的浓度范围为大约0.1M到大约2M。更优选bG-CSF浓度范围在大约0.1mg/ml到大约3mg/ml。
本发明所述稳定蛋白质组合物可以用本领域技术人员已知的常规手段制备成冷冻形式或冻干形式。冻干形式的蛋白质可以用稳定缓冲液重配。或者，储存液态形式的溶液以便立即使用。优选，本发明所述稳定蛋白质组合物处于液态，它能在长期保存中保持活性。
本发明所述稳定蛋白质组合物可以经口、肠胃外(皮下、血管内、腹膜内和肌内)、鼻(例如通过吸入)、眼内或皮内或用本领域技术人员已知的方式通过灌输方法给药。优选肠胃外给药。
无论哪种给药途径，都可通过本领域技术人员已知或显而易见的常规方法将本发明所述稳定蛋白质组合物配制成药物学可接受的剂型。
本发明所述稳定蛋白质组合物的医药可接受的剂型，优选适于皮下给药。用于皮下给药的医药可接受的剂型通常体积不大于20ml(例如给药马和牛)，是无菌的(适用于哺乳动物)，并且哺乳动物对其耐受性好(即不会诱发注射部位肿胀、疼痛或坏死)。
通常，本发明所述医药可接受的剂型可以含有其它医药可接受的成分，例如表面活性剂或去污剂、粘性调节剂、糖或蛋白质，这些附加成分用量适合有效、安全的药用给药。例如，可以按照惯例用载体、稳定剂、稀释剂和/或防腐剂将本发明所述稳定蛋白质组合物制成医药可接受的剂型。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂可以包括清蛋白等。其它的合适载体和添加剂对本领域技术人员是已知或显而易见的。
可以用试剂盒形式提供本发明所述稳定蛋白质组合物，该试剂盒包括含有治疗有效量蛋白质的第一个容器和含有医药可接受的稳定缓冲液的第二个容器。蛋白质可以是固态(如冷冻或冻干形式)或液态。然后可将稳定缓冲液与蛋白质合并，并给药哺乳动物，从而第一个容器的治疗有效量蛋白质在与第二个容器的医药可接受的稳定缓冲液合并时，能够将所述蛋白质的疗效水平在哺乳动物体内维持一段延长的时期。
本发明具体实施方案包括其中的蛋白质的量足够保护哺乳动物至少3天的试剂盒。
本发明医药可接受的剂型可以在大约0.1μg/kg到大约50μg/kg的范围，优选从大约1μg/kg到大约25μg/kg，最优选从大约3μg/kg到大约25μg/kg。对bG-CSF最优选的剂型是大约24μg/kg。该剂量至少在大约3天内有效。
以下的实施例用于阐明本发明的具体实施方案，但本发明的范围并非仅限于列举的实施例所描述。
实施例1bG-CSF在HEPES、TES和TRICINE缓冲液中的持续稳定性分别制备浓度为0.1M、1M、2M的三种缓冲液HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)和TRICINE(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)。缓冲液购自Fluka Biochemica USA。用氢氧化钠(J.T.Baker，USA)将每种缓冲液的pH调至7.5。缓冲液用0.2μm GV滤膜(Millipore USA)过滤除菌。制得的缓冲液浓度为HEPES缓冲液0.1M、1M和2M；TES缓冲液0.1M、1M和2M；TRICINE缓冲液0.1M、1M和2M。
在具有上述浓度的各种缓冲液(TES、TRICINE和HEPES)中制备含有0.1mg/mlbG-CSF的溶液。方法是将4.69mg的bG-CSF(根据效价为53.3％)加入25ml体积烧瓶，然后用适宜的缓冲液浓度补足体积。
在具有表1所述浓度的各种缓冲液(TES、TRICINE和HEPES)中制备含有2mg/ml bG-CSF的溶液。方法是将93.8mg的bG-CSF(根据效价为53.3％)加入25ml体积烧瓶，然后用适宜的缓冲液浓度补足体积。
随后用0.22μm低蛋白结合滤膜(Millipore USA)过滤bG-CSF制剂。将1ml各钟制剂装入1ml小瓶中，然后在40℃烤箱放置9天。制得的bG-CSF缓冲液稳定溶液为0.1mg/ml bG-CSF溶于(1)HEPES缓冲液0.1M、1M和2M；(2)TES缓冲液0.1M、1M和2M；和(3)TRICINE缓冲液0.1M、1M和2M。每3天从各个瓶中取样，进行体积排阻HPLC(SEC-HPLC)分析。结果示于图1到6及表3和4。
表3<
表3显示如上所述制备的0.1mg/ml bG-CSF溶液的回收率％(剩余)(时间的函数)。溶液保存在40℃。
表4
表4显示如上所述制备的2.0mg/ml bG-CSF溶液的回收率％(剩余)(时间的函数)。溶液保存在40℃。
图1至3显示分别溶于各种浓度(0.1M、1M和2M)HEPES、TES和TRICINE缓冲液的0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)，在40℃保存条件下的稳定性。如图1至3所示，当缓冲液浓度增加到1M和更高时，bG-CSF活性的稳定性或残余量提高。在0.1mg/ml bG-CSF时，1M HEPES中的bG-CSF回收率为90％(图1)。
图4至6显示分别溶于各种浓度(0.1M、1M和2M)HEPES、TES、TRICINE缓冲液的2.0mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)，在40℃保存条件下的稳定性。如图4至6所示，当缓冲液浓度增加到1M和更高时，bG-CSF活性的稳定性或残余量同样提高。
表3和4以及图1至6中的数据表明缓冲液(HEPES、TES和TRICINE)的存在显著地将bG-CSF活性维持持续时期，3到9天。
实施例2在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE缓冲液中制备的bG-CSF的体内效果取牛进行实验检测在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE缓冲液中制备的bG-CSF的体内效果。按24μg/kg的剂量对牛给药，监测PMN(嗜中性粒细胞)的数量。
图7显示用在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE缓冲液中制备的bG-CSF处理的牛的外周血PMN总数(以对照的百分比，0小时的数值表示)。注射一次，三种缓冲液都给出接近100小时的康复期。这表明三种缓冲液都在体内使注射部位的蛋白质活性延迟。
实施例3HEPES缓冲液对bG-CSF的体外稳定性的影响在各种缓冲液体系中配制bG-CSF(如下所述)，使其浓度为0.1mg/ml，pH在大约7.0到大约8.5。上样前，用0.2微米滤膜(GV Millipore USA)将全部样品过滤。于40℃将稳定样品装柱，经反相HPLC(RP HPLC)、SEC HPLC和生物测试监测7到10天。用VP-DSC MicroCalorimetry系统(USA)测量bG-CSF的伸展温度。
图8给出bG-CSF在各种缓冲液体系中的稳定性的比较结果，缓冲液体系包括作为对照的Neupogen(市场有售，USA，人G-CSF)、HEPES(pH7.4)、PBS(pH7.0)、Hanks缓冲液(市场有售，USA)和重碳酸盐缓冲液。结果表明配制于1M HEPES缓冲液的bG-CSF是所有被测制剂中最稳定的，并且显示出与Neupogen缓冲液(pH4.0)相似的稳定性。由于以前认为bG-CSF在中性或生理pH及大约40℃或更高温度是不稳定的，HEPES缓冲液中的bG-CSF的稳定性(图8所示)是令人惊奇、出乎意料的。在PBS(pH7.0)、Hanks缓冲液和重碳酸盐缓冲液中制备的bG-CSF不稳定。表5证实了这一结果。
表5
*较高数值对应较低活性溶于Neupogen和HEPES缓冲液的bG-CSF，于40℃保存7天未失去活性。还表明，较之起始活性，PBS中的bG-CSF活性低10倍，而Hanks和重碳酸盐缓冲液中的bG-CSF活性低100到1000倍。
图9显示40℃时，HEPES缓冲液浓度(1000mM、500mM、100mM、50mM和20mM)对HEPES中的bG-CSF的稳定性的影响。如图9所示，随HEPES浓度下降，bG-CSF的稳定性显著减弱。
图10是两种不同bG-CSF溶液的温谱图。上面的温谱图(最高温度为47℃)是在PBS(pH7.5)中制备的bG-CSF，下面的温谱图(最高温度为59℃)是在1MHEPES(pH7.5)中制备的bG-CSF。没有HEPES缓冲液时，bG-CSF在pH7.5的伸展温度约为40℃(开始的温度)，而在1M HEPES中的bG-CSF伸展温度增加10℃。伸展温度的增加代表更稳定。
实施例4在1M HEPES中制备的bG-CSF的体内效果取牛进行实验，检测在1M HEPES中制备的bG-CSF的体内效果。按12μg/kg的剂量对牛给药，监测白细胞(WBC)和PMN(嗜中性粒细胞)的数量。结果见图11。
图11是随时间变化的PMN％(嗜中性粒细胞)图，它将三种制剂进行了比较溶于水(作为对照)、1M HEPES、1M HEPES+10％ polaxamer的bG-CSF。如图11所示，PMN的数量在阈值(与保护力相关的水平)以上停留了3天或72小时。每种制剂检测了6头牛。
在第二项研究中，按24μg/kg的剂量对牛给予，用溶于1M HEPES+10％polaxamer的bG-CSF，一次注射能提供约200小时的保护，或接近8天的康复期。这一结果显示HEPES缓冲液提高了bG-CSF的体内稳定性，从而使其活性维持期延长，蛋白质的递送期延长。
实施例5bG-CSF在1M HEPES中的溶解度确定bG-CSF在1M HEPES(pH7.5)中的溶解度。将接近80mg bG-CSF溶解在30ml 1M HEPES缓冲液(pH7.5)中。蛋白质溶液经0.2μm GV Millipore滤膜过滤，然后转入50ml超滤池。该池装有截留分子量(MW)为10000的低蛋白质结合膜。用超滤池将蛋白质溶液浓缩。在不同时刻，从池中取样于310nm进行UV-Vis分析(测量光散射)，并经RP HPLC浓缩。用310nm的吸光度对浓度作图。310nm的吸光度随浓度线性升高；在饱和浓度处310nm曲线突然变化，吸光度剧增。在该点的浓度就是最大溶解度。这种方法是本领域技术人员已知的，常用于测定蛋白质溶液度。如图12所示，bG-CSF在1M HEPES(pH7.5)中的最大溶解度约为5mg/ml。曲线突变处的浓度表示蛋白质的最大溶解度。在浓度约为5mg/ml的地方，310nm的吸光度突然升高，对应蛋白质的最大溶解度。
实施例6HEPES、TES和TRICINE缓冲液对bG-CSF伸展温度的影响制备1M HEPES、2M HEPES、1M TES、2M TES和1M TRICINE中含有0.5mg/mlbG-CSF的溶液；以及1M HEPES、2M HEPES、1M TES、2M TES和1M TRICINE中含有2mg/ml bG-CSF的溶液。这些溶液是以与实施例1所述相同的方式制备的。用PBS(Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液，pH7.4)制备对照溶液。bG-CSF溶液的pH为7.5。用差式扫描量热法(Microcal Inc.USA)取每小时60度的扫描速率，在20℃到90℃的温度范围测定bG-CSF的伸展温度。结果见表6。
表6伸展温度(℃)
伸展温度是溶液稳定性以及蛋白质在体内稳定性的标志。表6中的结果表明溶于1M和更高浓度HEPES、TES或TRICINE缓冲液的bG-CSF的伸展温度Tm)比PBS对照显著升高。三种缓冲液使Tm升高了大约2℃到11℃。缓冲液的浓度极大地影响Tm升高的程度。bG-CSF的Tm随缓冲液浓度增加而增加。当HEPES浓度由1M增加到2M，升高大约3℃，当TES浓度由1M增加到2M，升高大约5℃。而bG-CSF浓度增加时，其Tm下降。HEPES和TES中的bG-CSF浓度由0.5mg/ml增加到2mg/ml时，均降低了2℃左右。TES缓冲液在缓冲液浓度为2M、bG-CSF浓度为0.5mg/ml时使bG-CSF的Tm升高11℃以上。
表6中的结果显示，与PBS相比，三种缓冲液(HEPES、TES和TRICINE)都使bG-CSF的Tm显著升高。较之其他缓冲液，溶于2M TES的bG-CSF溶液稳定性最高。
实施例7溶于PBS和HEPES的人和牛G-CSF制剂的稳定性比较在磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s PBS，pH7.4)和1M HEPES缓冲液(1M HEPES，pH7.5)中制备0.15mg/ml hG-CSF和bG-CSF制剂。将制剂装入1ml瓶(容积400ml)中，于40℃储存10天。每3天通过体积排阻层析(SEC-HPLC)和目视检测一次样品。
图13显示与PBS相比，溶于1M HEPES缓冲液的人G-CSF稳定性显著提高。在PBS(pH7.4)中制备时，人G-CSF于40℃储存10天即降解，而在1M HEPES缓冲液中制备时，观察到回收率为65％。
图13和14显示牛G-CSF在HEPES和PBS制剂中的稳定性略好于人G-CSF。溶于1M HEPES的牛G-CSF制剂于40℃储存10天后的回收率约为80％，而人G-CSF为65％。两种蛋白质(人和牛G-CSF)在1M HEPES缓冲液中比在PBS中稳定得多。
实施例8人和牛G-CSF在1M HEPES制剂中的稳定性在1M HEPES缓冲液(1M HEPES，pH7.5)中制备0.1mg/ml hG-CSF和bG-CSF的制剂。将制剂装入1ml瓶(容积400□l)中，于40℃储存10天。每3天通过体积排阻层析(SEC-HPLC)和目视检测一次样品。
图15显示牛G-CSF和人G-CSF在1M HEPES制剂中的稳定性。于40℃储存10天后，牛G-CSF的回收率约90％，人G-CSF的回收率约70％。
实施例9制剂的pH值对bG-CSF稳定性的影响在pH4.0和pH7.5的1M HEPES和1M TES缓冲液中制备0.1mg/ml bG-CSF溶液的制剂。将制剂装入1ml瓶(容积400□l)中，于40℃储存10天。每3天通过体积排阻层析(SEC-HPLC)检测一次样品。
如图16和18所示，在pH4.0，于40℃储存10天后bG-CSF回收率约100％，而图17和19显示bG-CSF制剂为pH7.5时，回收率约80-85％。
实施例10溶于1.0M HEPES和TES制剂中的bG-CSF 6个月取样的长期热稳定性研究以下给出该项研究包括的制剂。商品1.0M HEPES制剂购自GibcoBRL(Lot#1016436)，1.0M Tes用购自Fluka Scientific的粉末(Lot#PA12602)制备。调节缓冲液pH值至7.5。BG-CSF(纯度为53.3％)由Bioprocess(Lot#BP185-11)提供。
在1.0M HEPES和1.0M TES缓冲液中制备0.1mg/ml和2.0mg/ml的bG-CSF制剂。
样品储存使用带有13mm 1888 Gray T/F塞子(Lot#R05619-7487)的3.5mlFlint Type 1瓶(Lot#R04105-7322)，用1.0ml容积。表7给出全部样品储存和取样点。每种制剂储存5瓶用于各个检测时间点。
表7样品储存和效价检测时间点一览表
进行HPLC检测前将2.0mg/ml bG-CSF制剂稀释10倍。
从每个储存室中取出各制剂的3个样品(5、30、40℃)，通过RP和SEHPLC检测bG-CSF的效价。每个样品测3次。用预先绘制好的标准曲线计算浓度。确定每组检测样品的占起始bG-CSF浓度的百分率(％)，计算各制剂在每个时间点的均值。将每个储存温度下的起始bG-CSF浓度的百分率％均值对时间做图，示意bG-CSF效价的下降。图20和21分别是RP和SE HPLC的结果(样品储存于5℃)。图22和23给出样品储存于30℃的结果，样品储存于40℃的结果可见图24和25。
除了溶于1M TES的0.1mg/ml蛋白质制剂，储存于5和30℃的样品中的bG-CSF降解很小。
实施例11HEPES缓冲液对生物治疗蛋白质的稳定能力用MicroCal(VP-DSC型)微热量计测定以下讨论的蛋白质在磷酸和HEPES缓冲液中的Tm值。用购自Aldrich的Na2HPO4(Lot#08019PQ)制备25mM磷酸缓冲液，调pH至7.5。1.0M HEPES缓冲液购自GibcoBRL(pH7.5，Lot#1016436)。用搅拌超滤池(8010型，Amicon Inc.)，结合使用YM10或YM30 Diaflo超滤膜(Amicon Inc.)(取块于蛋白质大小)进行缓冲液交换。
将购自Bioprocess的2.0mg冻干的pST(Lot#41509-217-2)在2.0mlMilli-Q水中重新配置。交换5次后，用YM10膜将1.0ml重配蛋白质转入25mM磷酸缓冲液。剩下的1.0ml交换到1.0M HEPES缓冲液中。制备1.0mg/ml蛋白质浓度的样品，然后进行微量量热分析。pST的微量量热分析在磷酸和HEPES缓冲液中均进行两次。
约2.0ml浓度为2.97的NIF(Lot#440631-22-7)购自Bioprocess。将来自Bioprocess的样品分成两份。1.0ml该蛋白质交换到25mM磷酸缓冲液中，剩下的NIF交换到1.0M HEPES缓冲液中。每种情况中，均用YM30膜交换5次。在适当的缓冲液中制备浓度为1.0mg/ml的溶液，通过微量量热法测定Tm值。
检测的生物治疗蛋白质及在磷酸和HEPES缓冲液中测定的各自的Tm值列于表8。
表8用微量量热法得到的四种生物治疗蛋白质在磷酸盐和HEPES缓冲液中的Tm值
表8显示HEPES缓冲液使NIF、pST的稳定性都得以提高。
实施例12用HEPES缓冲液延长重组牛粒细胞集落刺激因子(rbG-CSF)的体内活性牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)购自Bioprocess Research andDevelopment-Pfizer(Grotor，CT)，甘露糖醇购自E.M.Industries(Hawthorne，NY)，1×Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(PBS)购自GibcoBRL(GrandIsland，NY)，柠檬酸钠和醋酸钠购自Aldrich(Milwaukee，WI)，Tween-80、氯化钠和盐酸购自J.T.Baker(Phillipsburg，USA)。
RP-HPLC体积排阻层析(SEC)通过RP-HPLC和SEC监测溶液的稳定性。用Vydac Protein C4柱子进行RP-HPLC，流动相0.1％TFAH20(溶剂A)和0.1％TFA CAN(溶剂B)；流速1ml/min；UV监测220nm；温度25℃。用TosoHaas，TSK-GEL SWXL(7.8mm ID×30cm)柱子做体积排阻层析，其中利用流动相溶于0.05M柠檬酸缓冲液(pH5.75)的0.3MNaCl；流速1ml/min；UV监测280nm；温度25℃。
微量量热法检测用VP DSC系统(MicroCal，Inc.)测量变性温度(TD)。将约1ml溶液加入池中，以大约10℃/min.的速率相对参比的空白对照制剂进行。
圆二色性用配备温度扫描测量附件的圆二色性分光光度仪(CD*ORD J-710/720型-Japan Spectroscopic Co.，LTD)监测bG-CSF的二级结构。
生物学测试用鼠骨髓细胞增殖检测(BMC法)确定bG-CSF制剂的体外活性。从雌性CF1小鼠(Charles River)的股骨中无菌操作收集骨髓细胞，方法是取下股骨，用3cc/23G注射器和Hanks平衡盐溶液(Gibco BRL)轻轻地从骨中冲出骨髓。细胞悬液经尼龙筛过滤除去残渣，于室温在1100rpm离心10分钟。弃上清，将沉淀重悬于15ml补加10％胎牛血清(Gibco BRL)、1％青霉链霉素(10000单位/ml)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRQ)的RPM1培养基(Gibco BRL).用Coulter Channelyzer256测定骨髓细胞的数量，将细胞浓度调至6.67×105细胞/ml。向96孔平板的每个孔中加入约105细胞。然后在每个孔中加入不同浓度牛粒细胞集落刺激因子(一式三份)。于37℃保温3天后，于5％CO2保温3天，向每个孔中加入3H-胸苷(New England Nuclear，Boston，Mass)至终浓度2μCi/ml。放射性标记于37℃，(5％CO2)进行至少18小时。将板在-20℃冷冻，融化后用Brandel细胞收集器(Biomedical Research and DevelopmentLaboratories，Gaithersburg，Maryland)将细胞收集到玻璃96孔纤维片。用Wallac 1205 Betaplate液体闪烁计数仪(Wallac Gaithersburg，Maryland)测定活性。将每分钟的样品计数除以每分钟的介质对照计数(对背景的倍数)确定bG-CSF制剂的活性。对背景的3或更高倍作为阳性。
bG-CSF体内活性在年轻的杂交牛(体重在约100-150kg范围)中测试bG-CSF制剂的体内活性。将买到的牛运至动物健康研究中心(Terre Haute，Indiana)，进行实验前使其对设备至少适应两天。多数牛用于一项实验，让它们休息至少一周，然后进行第二项实验。不用牛做两项以上实验。进入一项实验前，在实验开始前1-3天将牛通过评估直肠温度、体重、体质和总的白细胞(WBC)计数和分类进行预筛。通常直肠温度≥104℃及总的WBC数<4000/mm3>或12000/mm3的牛被排除在外。在0天，处理前取牛血并称重。根据体重计算在处理时间内给予每头牛的bG-CSF制剂的剂量(24μg/kg)，并经颈部前肩胛处皮下注射给药。处理后，于预定时间在颈部经静脉穿刺将血样收集到EDTA抗凝血剂中进行WBC/分类计数。在NovaCelltrak I血细胞计数器中用1∶250稀释在等压稀释液的全血计数总WBC。利用用Diff-Quik染色装置(Dade)染色的干燥血液涂片，进行分类WBC计数。在带有100×油镜和12.5×目镜(总放大倍数＝1250×)的Zeiss光学显微镜上计数100个WBC并分类。
pH和温度对bG-CSF溶液稳定性的影响表9显示温度对bG-CSF稳定性的影响。用温度影响bG-CSF溶液的稳定性后，进行RP-HPLC、SEC-HPLC、生物学检测和目测(制剂0.1mg/ml bG-CSF，5％甘露糖醇，10mM醋酸缓冲液，0.004％Tween-80，pH4.0)。从表9可看出bG-CSF的稳定性在40℃或更高温度有中断。RP-HPLC和SEC-HPLC中，在40℃和更高温度均丢失了母体蛋白质峰。在较高温时，母体蛋白质峰消失，随之溶液中的微粒增加。目测和在310nm光散射监测均观察到这一结果。于40℃储存3周的牛G-CSF溶液比储存在5℃和30℃的活性低10-100倍。于50℃储存3周后，bG-CSF比储存在5℃和30℃的溶液低100-1000倍。
表9 bG-CSF的稳定性与温度关系(3周的稳定性)
在鼠BMC中检测到的活性(注意高值代表低活性)用圆二色性(CD)跟踪温度对bG-CSF的影响。bG-CSF的CD光谱如图26所示。这个谱图提示bG-CSF的二级结构主要是α-螺旋，与人G-CSF在结构上非常相似。在不同温度测定CD光谱以确定变性温度(TD)。图27是222nm(α-螺旋的特征波长)波长下的摩尔椭圆率与温度的关系图。在40-50℃之间，摩尔椭圆率增加表明二级结构的丧失及bG-CSF变性。
还测试了pH对bG-CSF溶液稳定性的影响。为了仅描述pH对稳定性的影响，而不包括温度造成的变性的影响，将溶液保存在30℃(bG-CSF的TD在40-50℃之间)。表10总结了在30℃保存2周中，bG-CSF稳定性与pH的关系。蛋白质活性丧失速率随pH升高而增加。数据表明在低pH，bG-CSF中的半胱氨酸质子化，因此制剂更稳定。在高pH，该游离半胱氨酸参与二硫键交换反应，是导致不稳定的可能原因。
表10 bG-CSF稳定性与pH的关系(在30℃保存2周的稳定性
在鼠BMC测试中检测到的活性(注意较高值代表较低活性)HEPES缓冲液对bG-CSF溶液稳定性的影响我们观察到即使于40℃保存几天，溶于1M HEPES缓冲液中的bG-CSF制剂也显示更高的溶液稳定性。这是出乎意料的，因为已知bG-CSF在中性pH不稳定，在40℃或更高温度会变性。图28显示在保存温度为40℃，pH7.5时，HEPES缓冲液浓度对bG-CSF溶液稳定性的影响。bG-CSF的稳定性随HEPES缓冲液浓度下降而显著降低。通过微量量热法确定了1M HEPES对bG-CSF的变性温度(TD)的影响。图10(温谱图)比较了两种制剂(有和没有1M HEPES)对bG-CSF的TD的影响。没有HEPES缓冲液，吸热转换在大约40℃开始，而溶于1M HEPES的bG-CSF的TD起点在50℃左右。变性温度的升高通常是稳定作用的标志。
bG-CSF的体内活性我们在奶牛中评估了这种制剂的体内活性。图29是随时间的WBC计数图，将在1M HEPES中制备的bG-CSF与“对照”制剂进行了比较。“对照”是含有5％甘露醇、10mM醋酸缓冲液、Tween-80(pH4.0)的制剂。
由图29可知，WBC计数仅在大约24-30小时内停留在阈值(能防止感染的水平)以上(200％基线水平)。但是，当在1M HEPES中制备bG-CSF时，PMN数量最少在3天或72小时内(某些情况下WTC停留在阈值以上近一周)停留在阈值以上。该项实验有再现性(每次实验中，每种制剂用6头牛)。该实验结果提示HEPES缓冲液不仅可作为体外稳定剂，还能以某种方式提高bG-CSF的体内效果。
HEPES缓冲液影响bG-CSF的效果这一意外发现促使我们考察了类似的缓冲液，例如MOPS、HFPPS、TES和TRICINE。这些缓冲液与HEPES相似，也能提高bG-CSF的体外稳定性。对溶于TES和TRICINE缓冲液的bG-CSF进行了体内实验，与HEPES制剂相似，两种制剂均使bG-CSF在奶牛体内活性延长。
将bG-CSF溶于1M HEPES使bG-CSF在体内的活性延长。这种延长的活性可能是注射部位的bG-CSF稳定性提高的结果。在1M HEPES中制备bG-CSF时，bG-CSF在中性pH和40℃的温度下溶液稳定性显著提高。其它有机缓冲液(例如MOPS、HEPPS、TES和TRICINE)也能使bG-CSF稳定性提高。
权利要求
1.一种含有蛋白质和稳定缓冲液的稳定的蛋白质组合物，所述组合物能使该蛋白质的疗效水平维持延长的时期。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述蛋白质选自集落刺激因子、生长激素、细胞因子、抗体和抗原。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述蛋白质是集落刺激因子。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述蛋白质选自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述蛋白质是牛G-CSF。
6.根据权利要求1或5的组合物，其中所述组合物处于生理pH。
7.根据权利要求1或5的组合物，其中所述组合物处于约4.0到约7.5的pH范围。
8.根据权利要求1或5的组合物，其中所述组合物处于生理温度。
9.根据权利要求1或5的组合物，其中所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE。
10.根据权利要求1或5的组合物，其中所述延长期至少约为3天。
11.根据权利要求1或5的组合物，其中所述延长期至少为在体内大约3天。
12.根据权利要求4或5的组合物，其中所述G-CSF的浓度从0.01mg/ml到5mg/ml。
13.根据权利要求1、4或5的组合物，其中所述稳定缓冲液浓度为大约0.05M到大约2M。
14.根据权利要求5的组合物，其中所述稳定缓冲液是HEPES，浓度为大约1M。
15.一种非肠道给药哺乳动物的稳定的蛋白质组合物的医药可接受剂型，它包含蛋白质和药用可接受的稳定缓冲液，该组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持一段时期，其中所述蛋白质含量足够给哺乳动物在预定时期内提供疗效。
16.根据权利要求15的医药可接受剂型，其中所述剂型还含有选自粘性调节剂和表面活性剂的组分。
17.根据权利要求15的医药可接受剂型，其中所述蛋白质是以大约0.01mg/ml到5mg/ml的浓度存在的牛G-CSF，稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE，哺乳动物是奶牛，预定的时间是至少约3天，组合物pH约7.5。
18.根据权利要求17的医药可接受剂型，其中所述缓冲液是HEPES，该HEPES浓度为大约0.05M到大约2M。
19.根据权利要求18的医药可接受剂型，其中所述牛G-CSF给药剂量为大约0.1μg/kg到大约50μg/kg。
20.一种非肠道给药哺乳动物的稳定的蛋白质组合物的医药可接受剂型的制备方法，包含将蛋白质和稳定缓冲液组合的步骤，这种稳定的蛋白质组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持持续时期，其中蛋白质的量足够保护哺乳动物至少大约3天。
21.一种治疗或防止哺乳动物感染的方法，包含以治疗有效量的稳定的蛋白质组合物给哺乳动物给药，其中这种稳定的蛋白质组合物含有蛋白质和稳定缓冲液，该组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持至少大约3天的持续时期。
22.一种治疗或预防牛乳腺炎、子宫炎或牛呼吸疾病的方法，包括以治疗有效量的稳定的G-CSF组合物给奶牛给药，其中这种稳定的G-CSF组合物含有G-CSF和稳定缓冲液，该组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持至少大约3天的持续时期。
23.一种将蛋白质在哺乳动物体内的疗效水平维持持续时期的方法，该方法包括以稳定的蛋白质组合物给药哺乳动物，其中这种稳定的蛋白质组合物含有蛋白质和稳定缓冲液，该组合物能够将所述蛋白质的疗效水平维持大约至少3天的持续时期。
24.根据权利要求20、21、22或23的方法，其中所述蛋白质是约0.01mg/ml到5mg/ml的牛G-CSF，稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE，所述组合物pH大约为7.5。
25.用于将稳定的蛋白质组合物给药哺乳动物的试剂盒，它包括含有治疗有效量蛋白质的第一个容器和含有医药可接受的稳定缓冲液的第二个容器，其中当所述第一个容器中的治疗有效量蛋白质与第二个容器中的医药可接受的稳定缓冲液合并时，能够将所述蛋白质在哺乳动物体内的疗效水平维持至少大约3天的持续时期。
26.根据权利要求25的试剂盒，其中所述蛋白质是约0.01mg/ml到5mg/ml浓度范围的牛G-CSF，所述稳定缓冲液选自HEPES、TES和TRICINE，所述组合物pH大约为7.5。
27.含有牛G-CSF和HEPES缓冲液的稳定的蛋白质组合物，该组合物能使延长保存期在大约3周到大约18个月的范围内。
28.根据权利要求27的组合物，其中所述HEPES缓冲液的浓度为大约0.05M到大约2M，该组合物pH约为7.5，该组合物的温度低于约40℃。
29.根据权利要求28的组合物，其中所述温度是大约4℃。
全文摘要
本发明涉及稳定的蛋白质组合物、该稳定蛋白质组合物的制备方法、将该稳定蛋白质组合物给药哺乳动物的剂型以及通过将该稳定蛋白质组合物给药哺乳动物预防或治疗哺乳动物感染的方法。具体说,本发明所述稳定蛋白质组合物含有治疗有效量的G－CSF(例如牛G－CSF),与稳定缓冲液例如HEPES、TES或TRICINE结合,可用于治疗和预防牛感染,包括乳腺炎。
文档编号A61K38/19GK1250668SQ99122020
公开日2000年4月19日 申请日期1999年8月17日 优先权日1998年8月17日
发明者P·C·肯宁, B·J·卡米克, K·卡斯莱恩 申请人:辉瑞产品公司