专利名称：一个细胞因子衍生物的抗肿瘤作用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种具有广谱抗肿瘤作用的重组细胞因子衍生物，即肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)衍生物(TRAILD)。TRAILD是由6个组氨酸、凝血酶识别序列、含有肠激酶识别序列的亲水8肽(FLAG)和TRAIL胞外区组成的融合蛋白，具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的功能，可用于治疗肝癌、乳腺癌、肾癌和多种白血病等。
目前人类恶性肿瘤的发病率和患者的死亡率仍呈上升趋势，已成为首位致死性疾病。随着社会的发展、人类平均寿命的增加、人口的持续老年化，更加剧了恶性肿瘤对人类健康的威胁。目前肿瘤治疗的方法主要是放疗、化疗和手术切除三大疗法。迄今，提供临床使用的抗恶性肿瘤的化疗药物虽有60多种，正在进行临床试用的新抗癌物质也有数百种，但化疗药物致命的缺点是“敌我不分”，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，从而产生严重的毒副作用。因此，研制特异、高效低毒的新型抗肿瘤药一直是肿瘤治疗学上的重大难题。
近年来，随着细胞凋亡(apoptosis)规律的研究与发现，一些能诱导细胞凋亡的物质及其作用机制逐步得到阐明。其中Fas/CD95和TRAIL的生物学功能引起了生命科学界的普遍关注。Fas与其配体(FasL)结合后，能迅速诱导Fas+细胞的凋亡，但在动物实验中显示出致死性的剧烈毒副作用。TRAIL则能选择性地杀死肿瘤细胞，显示了巨大的临床应用前景。因而，美国Immunex公司于1996年6月25日申报了国际专利(专利号WO97/01633)，对TRAIL的cDNA序列及其编码的多肽和TRAIL的单克隆抗体进行了保护。1999年6月，美国Immunex和Genetech公司宣布将联手进行TRAIL的开发研究，国内也先后有三家实验室正在进行类似的研究。
本发明的目的是采用基因工程等现代生物学技术和方法，研制新的细胞因子衍生物(TRAILD)，具有特异性地杀死多种肿瘤细胞的功能，并在临床上用于治疗恶性肿瘤。
本发明的内容要点以中国正常人外周血淋巴细胞mRNA为模板，以5’ATAGGATCCGCTGCCTGGCTGACTTACA3’为上游引物(其中划线部分为BamHI切点)、5’CGCGAATTCTTTGGTTGTGGCTGCTCTAC3’为下游引物(其中划线部分为EcoRI切点)，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增人TRAIL的全长cDNA。以EcoRI和BamHI消化TRAIL的全长cDNA，并与经同样酶切的pGEX-3X原核表达载体连接。转化大肠杆菌HB101，选择阳性克隆。小量提取阳性克隆的质粒DNA，经酶切和测序鉴定获得正确的目的基因后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，以0.1mmole/L的异丙酰-β-D-巯基半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白谷胱甘肽转移酶(GST)-TRAIL表达。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定该重组融合蛋白分子量与文献报道一致。将SDS-PAGE上的相应区带切下，免疫家兔，制备抗TRAIL的特异性多克隆抗体。该抗体可用于实验室研究和临床诊断。
为了制备重组的TRAILD，以全长TRAIL的cDNA为模板，以5’GCCGCTCGAGgactacaaggacgacgatgacaagACCTCTGAGGAAACCATTTC3’为上游引物(其中划线部分为XhoI酶切位点，小写字母为FLAG序列，小写字母之后的ACC为编码TRAIL的N-末端第95号氨基酸残基的密码)，5’GCGGATCCttaGCCAACTAAAAAGGC3’为下游引物(其中划线部分为BamHI的酶切位点，小写字母tta为TRAIL的C-末端终止密码)，采用PCR法扩增了人TRAIL胞外区的cDNA。以XhoI和BamHI消化人TRAIL胞外区的cDNA，并与经同样酶切的pET15b原核表达载体连接，从而获得TRAILD的重组表达载体。转化大肠杆菌，获得阳性克隆后，小量制备质粒DNA，酶切和序列分析(图1A、图1B)证明其核苷酸序列与设计相同，其序列为ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCTCGAggactacaaggacgacgatgacaagACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACACAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAA(其中划线部分为编码6个组氨酸残基的序列，斜体部分为编码凝血酶识别位点的序列，小写部分为FLAG序列。)TRAILD的氨基酸序列为MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEDYKDDDDDKTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSQTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHKEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSLWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG重组表达载体转染大肠杆菌BL21(DE3)后，获得阳性克隆。经IPTG诱导表达分析表明，TRAILD重组蛋白以不溶的蛋白聚合物-包含体形式存在，产量占菌体总蛋白的30％左右。经反复传代和诱导突变，获得了稳定表达重组融合蛋白TRAILD的工程菌，该重组蛋白以可溶形式存在于细菌胞浆中。
表达TRAILD重组蛋白的工程菌在LB培养基(每升培养基中含酵母提取物5克，酪蛋白水解物10克，氯化钠10克，pH7.4)中发酵，以0.1mmole/L IPTG诱导重组蛋白表达。发酵完成后，以超声波破碎菌体，释放可溶性蛋白。离心去除菌体碎片后，采用金属螯合树脂亲和层析法，分离纯化TRAILD重组蛋白，在SDS-PAGE胶上显示为一条带(图2)。以Lowrey法进行蛋白定量分析，每升工程菌培养液约可获得16mg纯化的TRAILD重组蛋白。
TRAILD的体外生物学活性测定，将肿瘤细胞(每毫升500,000个细胞)悬浮于含10％胎牛血清、100微克/毫升链霉素和100微克/毫升青霉素的1640培养液中，于96孔细胞培养板中每孔加入100微升细胞悬液，培养20小时后，加入纯化的TRAILD(0.1~1μg/mL)，继续培养4~8小时后，以碘化丙啶(PI)进行细胞染色，以流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。结果表明，TRAILD在体外能强烈地诱导所试肝癌(7721)、乳腺癌(MCF-7)、白血病(K562、HL60、JK、TJK)和肾癌(293)等7种肿瘤细胞株的细胞凋亡，但不能诱导正常小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和正常人外周血淋巴细胞(HPBL)凋亡，证明TRAILD具有选择性地杀伤肿瘤细胞的能力(图3)。
TRAILD的体内抗肿瘤作用分析，选择BALB/C-nu小鼠，经适当照射后，皮下接种BEL-7402肝癌细胞(5×106/只)，待肝癌细胞长成合适大小的实体瘤后，将荷瘤小鼠分为3组，分别经腹腔和瘤内注射重组TRAILD(11.25μg/天/只)，共注射8天。停药后，继续观察5天。对照组注射生理盐水。从给药之日(第0天)起，动态测量瘤块直径，计算瘤块体积(mm3)。体内研究证明，TRAILD(11.25μg/只)能显著抑制肝癌细胞株7402在BALB/C裸鼠体内的增殖(表1，图4)。
表1 TRAILD给药处理过程中，小鼠体内瘤块体积(mm3)动态测量结果。测量时 对照组瘤内 注射 组 腹腔 注射 组间1#2#3#1#2#3#1#2#3#(天)0 79187 8896 40 16411414 745 160 436 289 70 47 25 76 43 638 237 583 480 81 98 40 10530 5511 202 994 824 87 68 40 10432 3613 220 833 784 72 10546 25646 46体内毒性实验，以大剂量(100μg/只)TRAILD连续给药14天，未见TRAILD对正常小鼠有任何毒副作用。
本发明的优点与效果是构建了一个细胞因子衍生物TRAILD的原核表达载体，获得了在胞浆中稳定高效表达融合蛋白TRAILD的工程菌，易于大规模生产；TRAILD的N-末端中含有凝血酶、肠激酶的识别序列，易于进行TRAILD的修饰和改造；同时含有多聚组氨酸序列，使之易于分离纯化；所制备的抗TRAIL的多克隆抗体可用于临床检测和实验室研究；重组融合蛋白TRAILD在体内、外具有杀伤和抑制肿瘤细胞增殖的生物学功能，但对正常细胞无任何毒副作用，可成为新一代抗肿瘤药物。
图1A、自动核苷酸序列分析仪测定TRAILD正链核苷酸序列的结果。
图1B、自动核苷酸序列分析仪测定TRAILD负链核苷酸序列的结果。
图2重组TRAILD的SDS-聚丙烯凝胶电泳图谱。1未诱导；2诱导；4超声上清；5经亲和层析纯化的TRAILD。
图3在体外，重组TRAILD特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的功能分析。A细胞凋亡百分率(％)；1-9分别代表NIH3T3正常鼠成纤维细胞、正常人外周血淋巴细胞PBL、人肝癌7721细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人白血病K562、HL-60、Jurkat、Jurkat基因修饰细胞和人肾癌293细胞。
图4重组TRAILD抑制肝癌细胞在小鼠体内增殖的功能分析。4A给药第11天后活体动物的照片。1-3对照组；4-6瘤体内浸润注射给药组；7-9腹腔注射给药组。4B给药后小鼠瘤块体积的大小。第1排对照组；第2排瘤体内浸润注射给药组；第3排腹腔内注射给药组。
权利要求
1.一个细胞因子衍生物TRAILD的抗肿瘤作用，其特征是所说的细胞因子衍生物的抗肿瘤作用包括以下步骤1)细胞因子衍生物TRAILD的制备；2)细胞因子衍生物TRAILD的抗肿瘤作用。
2.按照权利要求1所述的细胞因子衍生物的抗肿瘤作用，其特征是1)以中国正常人外周血淋巴细胞mRNA为模板，采用RT-PCR扩增TRAILD的cDNA，该cDNA序列包括多聚组氨酸、凝血酶识别序列、FLAG和TRAIL胞外区序列，TRAILD的cDNA克隆入pET15b中，获得TRAILD的重组原核表达载体，转化人肠杆菌后，获得稳定表达TRAILD重组融合蛋白的工程菌，经反复传代筛选，使该蛋白以可溶形式在细菌胞浆中表达。2)表达TRAILD重组蛋白的工程菌在LB培养基中发酵，以超声波破碎菌体，释放可溶性蛋白，采用亲和层析法，分离得到纯化的TRAILD重组蛋白。
3.按照权利要求1所述的细胞因子衍生物的抗肿瘤作用，其特征是1)TRAILD的体外生物学活性测定，以纯化的TRAILD分别处理肿瘤细胞和正常细胞，能迅速诱导肝癌、乳腺癌、白血病和肾癌细胞凋亡，但不能诱导正常小鼠成纤维细胞和正常人外周血淋巴细胞凋亡。2)TRAILD的体内抗肿瘤活性分析，在BALB/C-nu小鼠皮下接种BEL-7402肝癌细胞，形成实体瘤后，分别经腹腔和瘤内注射TRAILD，显著抑制肝癌细胞在裸鼠体内的增殖。
全文摘要
本发明涉及一个细胞因子衍生物TRAILD的抗肿瘤作用,以中国正常人外周血淋巴细胞mRNA为材料,扩增了TRAILD的cDNA,获得TRAILD的重组原核表达载体稳定表达TRAILD的工程菌,该蛋白以可溶形式在细菌胞浆中表达,经发酵和分离纯化,得到重组融合蛋白TRAILD,能在体外迅速诱导肝癌、乳腺癌、白血病和肾癌细胞凋亡,但不能诱导正常小鼠成纤维细胞和正常人外周血淋巴细胞凋亡,能显著抑制肝癌细胞在裸鼠体内的增殖,由于其特异性地杀伤肿瘤细胞的作用,有望成为新一代抗肿瘤药物。
文档编号A61K38/19GK1243748SQ99111039
公开日2000年2月9日 申请日期1999年7月28日 优先权日1999年7月28日
发明者郑德先, 刘彦信, 马振宇, 朱迅 申请人:中国医学科学院基础医学研究所