专利名称：被称作胞外体的细胞囊泡,其制备方法及在免疫刺激中的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明的目的为提供一种使抗原呈递细胞敏感化的新颖方法，实施该方法的新颖方式以及具有免疫原特性的新颖膜囊泡。
自从证明对在第I类分子环境内的肿瘤抗原具有特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞确实存在(Rosenberg等人，1996；Boon，1992)后，数个实验室已能证明抗肿瘤免疫治疗在动物模型中为有效的治疗策略(Pardoll，1995)。免疫治疗的原理是诱导出对抗特异性肿瘤抗原的有效免疫反应。至目前为止，其可以数种不同方式进行。首先，表达重组共刺激分子和/或免疫调节细胞因子的肿瘤细胞在活体内能刺激抗肿瘤反应而根除实体肿瘤(Zitvogel等人，1996{a})。同样地，以各种化学形式(包括使用脂质体或病毒如腺病毒或痘病毒做为载体)被注射的肿瘤抗原(或在肿瘤细胞中表达的外源抗原)的肽衍生物能使肿瘤缓解。最后，专业的抗原呈递细胞诸如用衍生自肿瘤抗原的肽敏感化的树状细胞，当被再注射入活体时，在小鼠体内会诱生强烈的抗肿瘤反应以及使小鼠已生成的实体肿瘤缓解(Mayordomo等人，1995)。
使用树状细胞的免疫疗法在以小鼠进行的研究中显示具有效力。结果，该治疗最近已被转用于临床。在美国，正在进行多个试验以证明带有肿瘤肽的树状细胞能明显增加特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的比率。
该途径的第一个限制在于用衍生自肿瘤抗原的肽使树状细胞敏感化。事实上，大多数肿瘤特异性抗原尚未被鉴定出。对肿瘤具特异性的抗原只在由病毒诱生的肿瘤(子宫颈瘤)、黑色素瘤(自体抗原、突变抗原、分化抗原)或一小部分的乳房肿瘤(致癌基因或已发生突变的肿瘤抑制基因的产物)中为已知。不过，这些肽或肿瘤抗原在人体中与清除肿瘤的关系尚待证明。因此，抗原呈递细胞诸如树状细胞的新颖敏感化方法显然是必需的。这些方法的目的是诱生在MHC的第I类及第II类分子的环境中的特异性抗肿瘤反应。
目前树状细胞敏感化的大多数方法使用对应于表位的肽，该表位与第I类分子一起被呈递且通过对肿瘤具特异性的CTL克隆而在肿瘤细胞中被鉴定出。不过，这些方法可能并非最佳，因为其未将在第II类分子的环境中鉴别到的表位考虑在内，而第II类分子对于获得最佳细胞毒性反应所需的辅助性T淋巴细胞的增殖相当重要。再者，肿瘤细胞所呈递的表位与抗原呈递细胞(例如树状细胞)所呈递的那些可能不同。最后，通过CTL鉴别到的肿瘤肽只有在一小部分的具有适当第I类单倍体型的分子的患者中可以得到。
理想的敏感化方法，亦即一种可应用于任何肿瘤且其免疫选择性极小的方法，必须不局限于少数已被鉴定的肿瘤抗原。同样地，该方法应利用完整的蛋白质抗原而非肽，以使树状细胞能制备它们并将肽与第I类及第II类分子的适当组合呈现出来，以及该方法对任何个体皆是可行的。
最近，Gilboa及其同僚(Boczkowsky等人；1996)已证明从带有树状细胞的肿瘤活体解剖制备的信使RNAs在活体中可能具有抗肿瘤作用。不过，RNAs非常不稳定以及有潜力的RNA的量与全部RNA相较可能极低。Zitvogel等人(Zitvogel等人，1996{b})已证明从酸性肿瘤洗脱物(酸性肽洗脱物APE)制得的肿瘤肽可被载入树状细胞中。如此负载的细胞一旦被注射，具有使肿瘤缓解的能力，不过，在不表达第I类分子的肿瘤(代表大部分的转移性人类肿瘤)的场合，或在肿瘤在细胞悬浮液中不会分解的场合，使用酸性洗脱物的途径极为无效且不具再现性。
以使用树状细胞为基础的免疫疗法的第二个限制是在将这些细胞维持在培养基中或接受不同处理时，可能发生表型改变。此可能导致细胞群体极不均匀以及无足以供治疗使用的特定特征。
所以需要一种使抗原呈递细胞敏感化的改良方法，以增加这些途径的效率及扩大其的应用范围，同时开发出承载抗原及其他分子的新颖方式。
本发明提供这些问题的解决方法。本发明的目的事实上为提供一种将抗原呈递细胞(尤其是树状细胞)敏感化的新颖方法，以及具显著免疫原性质的新颖膜囊泡的鉴定、分离及鉴定特征的方法。
更具体而言，本发明的特征之一是提供一种通过肿瘤抗原使抗原呈递细胞敏感化的新颖、可再现的方法。
本发明的再一特征是提供一种通过肿瘤抗原使抗原呈递细胞敏感化的新颖、可再现的方法，其中肿瘤抗原无需为已知的。
本发明的另一特征是提供一种可以建立肿瘤抗原库的方式。
本发明的又一特征在于由肿瘤细胞或树状细胞产生的具有免疫原性质的脂质膜囊泡，以及其在抗原库的制造、抗原呈递细胞的敏感化或抗原的承载上，尤其是在免疫治疗途径方面的用途。
关于此，本发明的第一目的涉及衍生自肿瘤细胞的囊泡，其具有下列特征—其自天然环境游离出，—其包含环绕胞质部分的脂质双层(被称为“表面”)，以及可选择地具有下列特征—其在表面上显示主要组织相容性复合物(MHC)的第I类分子和/或主要组织相容性复合物(MHC)的第II类分子，以及可选择性地带有抗原肽和/或粘附分子和/或淋巴共同刺激分子，和/或—其在胞质部分含有肿瘤抗原分子和/或免疫调节剂和/或化学-吸引剂和/或激素和/或核酸。
囊泡被细胞分泌是现有技术所描述的一种现象(网状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞)。这些囊泡通常被通称为“胞外体”，此术语反映其通过内部囊泡的胞外分泌而制造的机制。不过，这些囊泡的生理角色未曾被真正确立。再者，这些囊泡的结构特征、性质及功能视其自何种细胞类型衍生而有何不同。
出乎意料之外地，本发明者现已证明肿瘤细胞能分泌显示特别令人感到兴趣的免疫性质的囊泡。这些囊泡通常对应于肿瘤细胞的胞内体中所含的内部囊泡，以及在该胞内体的外膜与上述肿瘤细胞的细胞膜融合后被该肿瘤细胞分泌。基于该形成机制、其细胞来源及原始功能性质，这些囊泡被称为“肿瘤细胞胞外体”(texosome)。
术语“自其天然环境游离出”意指囊泡与衍生其的细胞发生物理性分离，甚至其被部分分离或纯化。囊泡通常通过胞外分泌被细胞制造，然后被部分分离或纯化以制造富化组合物。该术语表示囊泡不仅在多囊泡胞内体与浆膜融合时被细胞分泌，而且还指它不再被胞内体腔内的可溶性成分环绕或者其缺乏完整的细胞。术语“衍生自肿瘤细胞”表示囊泡具有肿瘤细胞的结构成分。该囊泡通常“衍生”自肿瘤细胞的意思为在其发育的特定阶段，其至少部分地被肿瘤细胞制造继而释出。
按照本发明的一有利实施方案，本发明的肿瘤细胞胞外体展示带有抗原肽的MHC分子和/或表达黏附分子和/或表达淋巴共同刺激分子，但在其胞质部分缺乏肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。
按照本发明的另一有利实施方案，本发明的肿瘤细胞胞外体为其中的MHC分子“空着”(即未带有抗原性肽)的，以及该肿瘤细胞胞外体在其胞质部分包含肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。其MHC分子为空着的肿瘤细胞胞外体一则可自(例如)缺乏肽转运蛋白(TAP)的肿瘤细胞得到，一则可通过冲洗肿瘤细胞胞外体或肿瘤细胞以将与MHC分子缔合的肽解离而得到。
按照本发明的一有利实施方案，本发明的肿瘤细胞胞外体为其MHC分子带有抗原肽和/或表达粘附分子和/或淋巴共同刺激分子，以及该肿瘤细胞胞外体在其胞质部分含有肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。
术语“肿瘤细胞”在其广义上包含任何衍生自肿瘤，例如实体或液体肿瘤的任何细胞，以及在体外被转化或无限增殖化的细胞。其优选指实体、腹水性或造血性肿瘤。
可被提及的例子为恶性黑色素瘤型的癌细胞(衍生自在活体外建立的原发性细胞系，或者甚至为衍生自战场的被分解细胞)，该癌细胞在其表面表达肽，如在MHC的第I类分子的环境中的MART-1/Melan-A，HLA-A 02-01，以及含有蛋白质抗原MART-1。
亦可被提及的例子为衍生自肾脏癌(透明细胞腺癌)或白血病的细胞，其会表达特异性移位产物。
因此，可能带有MHC分子的抗原肽为衍生自下列抗原者例如衍生自黑色素瘤的那些，诸如MART-1、酪氨酸酶、MAGE-1/2/3、P53(在不同的肿瘤中)或HER2/Neu、PSA、CEA或PSMA。其他肿瘤抗原是例如曾被Rosenberg的论文(Immunology Today 18(1997)175)引述的那些，该文被列为本说明书的参考文献。
更一般而言，可提及的有融合/移位产物、致癌基因或抗-致癌基因的产物，甚至肽本身或突变肽的分化抗原或肽。
淋巴共同刺激分子是指例如当第I类及第II类分子-肽复合物与T细胞受体交互作用时，赋予T淋巴细胞额外信号的分子。
可提及的例子例如有CD80、CD86、ICAM、LFA、CD40、TNF R族群的某些成员以及粘附或化学-吸引分子(允许专业抗原呈递细胞与效应子淋巴细胞接触，或允许其他细胞的细胞内运输/特异性定位(“运送/定居”)至接种疫苗或发炎部位)。
胞液所含或肿瘤细胞胞外体所呈递的肿瘤抗原分子衍生自被肿瘤细胞选择且丰沛地表达的蛋白质。
可能存在于肿瘤细胞胞外体的胞液中的免疫调节剂例如有—TNF-α，或—白细胞介素1，或—白细胞介素15，或—C-CR(趋化因子)。
可能存在于肿瘤细胞胞外体的胞液中的核酸衍生自肿瘤细胞本身。这些核酸在肿瘤细胞胞外体的胞液中被发现，为肿瘤细胞胞外体形成机制的直接结果。其亦可能为异源核酸。
本发明的肿瘤细胞胞外体的更特别特征如下—它们为肿瘤细胞分泌的小型膜囊泡，约60至100nm，更常为约60至90nm，尤其是60至80nm，—它们具有常存在于胞内体中的分子，—它们含有肿瘤抗原，例如在黑色素瘤细胞的场合它们含有MART-1，
—它们无死细胞和/或细胞残渣，—它们无污染物诸如膜污染物、内质网、高尔基体、线粒体或核成份，—它们在其膜上携带连有肿瘤抗原肽的第I/II类功能分子，—它们在活体外能刺激特异性T淋巴细胞的增殖，—它们在活体内及活体外能使树状细胞敏感化，而后者然后能活化肿瘤-特异性T细胞，—它们被接种于活体内时，尤其是经由皮内接种时，具有使被移植生长的实体肿瘤缓解的能力，—它们携带淋巴共同刺激分子，诸如CD40及CD80，和/或—它们含有(热休克)蛋白质HSP70，—它们无蛋白质gp96，—它们含有白细胞介素或化学-吸引剂或免疫调节剂。
肿瘤细胞胞外体的另一令人感到兴趣的特征为在其外层含有磷脂酰丝氨酸(PS)。磷脂酰丝氨酸为细胞膜的主要成分之一，通常在脂质双层的内层存在极大的量。在某些情况，诸如编程性细胞死亡(apoptosis)的早期步骤，PS被重分布于外层。在编程性细胞死亡细胞的细胞膜的外层中出现PS，构成供巨噬细胞识别的信号。为了测定是否PS被暴露于肿瘤细胞胞外体的表面，通过Aupeix等人所述的方法(J.Clin.Invest.991546-1554，1997)分析从FON人类黑色素瘤细胞的上清液纯化得的胞外体制剂。在FON样本的外层中(含有390微克/毫升蛋白质)磷脂酰丝氨酸含量为460nM的PS。因此胞外体在其外层含有的PS的量是相当可观的。
可用来证明本发明的肿瘤细胞胞外体具有通常存在于胞内体的分子的测定系由电子显微镜检及免疫印迹(蛋白质印迹)组成。这些测定可以证明本发明的肿瘤细胞胞外体表达运铁蛋白受体、LAMP(“与膜蛋白相关的溶菌酶”)分子、第I/II类的分子及肿瘤抗原。
可用来证明本发明的肿瘤细胞胞外体不含污染物的测定为电子显微镜检及用钙联接蛋白(存在于内质网上)的抗体免疫印迹。
可用来证明肿瘤细胞胞外体在其膜上携带带有肿瘤抗原肽的第I/II类功能分子的测定为将抗原呈递给对相关肿瘤的抗原具特异性的T淋巴细胞(对抗原及限制性第I类MHC具特异性的T克隆的增殖试验)。
亦可以采用通过上述T克隆分泌细胞因子(IFNγ、GM-CSF、TNFβ)的试验。
可用来证明在活体及活体外能活化肿瘤-特异性T细胞的树状细胞被敏感化的测定被示于图7中(抗原-特异性T克隆的增殖和/或细胞因子分泌的试验，其通过“交叉-致敏”法肿瘤(MART-1+，HLA-A2-)的肿瘤细胞胞外体被载至树状细胞(MART-1-，HLA-A2+)而进行)。
可用来证明肿瘤细胞胞外体在被接种尤其是经由皮内接种时，具有使被移植生长的实体肿瘤缓解的测定被示于图6中。
举例言之，在携带有肿瘤的动物(啮齿动物，诸如小鼠)体内，将10至40μg的肿瘤细胞胞外体皮内注射于已移植生长3至10日的肿瘤的相同脊腹部，结果观察到先前移植生长有7至10日的肿瘤逐渐消失。
本发明的肿瘤细胞胞外体的益处是，如上文所界定的，在其表面具有可选择性地带有抗原肽的MHC的第I类和/或第II类分子，以及在其胞质部分含有肿瘤抗原分子。更特定而言，优选的肿瘤细胞胞外体亦包含一种或多种淋巴共同刺激分子和/或蛋白质HSP70。在一特定实施方案中肿瘤细胞胞外体不含蛋白质gp96。
依照一有利实施方案，本发明涉及如上文定义的肿瘤细胞胞外体—在其表面表达主要组织相容性复合物(MHC)的第I类和/或第II类分子、和/或为肿瘤特征的抗原、和/或淋巴共同刺激/粘附分子、和/或免疫调节剂和/或化学吸引剂，它们与衍生该胞外体的肿瘤细胞为异源的，或者—含有肿瘤抗原、和/或免疫调节剂、和/或核酸或细胞毒剂或激素，它们与衍生该胞外体的肿瘤细胞为异源的。
本发明亦涉及如前文定义的肿瘤细胞胞外体的制法。该法包含提供生物样本的步骤及将肿瘤细胞胞外体自该样本分离的步骤。
生物样本宜由膜部分、肿瘤细胞的培养上清液或溶胞产物，甚至新鲜的肿瘤悬浮液构成。
生物样本可为肿瘤片段，其来自手术切除后的操作(第I类)或者甚至来自带有肿瘤的器官(通过手术切除的器官)(第2类)，其分别通过机械分解(第I类)或长时间灌流(第2类)得到。
最终的细胞悬浮液以与处理培养物上清液的相同方式处理。
该样本亦可为通过数次相继的冷冻/融解循环处理的细胞。
按照一有利实施方案，本发明方法所用的生物样本为—自被分离的带肿瘤器官的输出静脉取得的血液样本，或—病人的循环血液的血浆或血清样本，或—用手术切下器官且在活体外用分离灌流回路处理以引流其所携带的肿瘤所得的引流产物(可能含有地塞米松(dexamethasone)或刺激肿瘤细胞胞外体的胞外分泌作用的细胞毒剂)，或
—在活体外被解离的肿瘤外植体的上清液，被分离的带肿瘤器官的输出血液样本相当于手术摘除前采自带肿瘤器官的主要输出静脉的20至50毫升血液。
通过手术切下器官且在活体外用被分离的灌流回路处理所得的引流产物以下述方式得到。
在呈现输入动脉及输出静脉的器官的场合，动脉的特征为一小塑胶管被连接至含有生理血清及可选择性含有其他药剂的向上倾斜袋。该器官被引流，而且液体由被另一插入向下倾斜静脉内的小管回输(例如在肾脏癌或脑成胶质细胞瘤的场合)。
在引流产物中可选择性含有的地塞米松的使用目的是为增加细胞应力以及促进肿瘤细胞进行肿瘤细胞胞外体的胞外分泌。
在活体外被解离的肿瘤外植体的上清液以下述方式得到—进行肿瘤的机械分解而生成单细胞组成的悬浮液，其含有肿瘤细胞及肿瘤基质细胞以及免疫系统的细胞；该悬浮液可被照射以及通过差速离心回收。
如上文所示，在本发明的一特别实施方案中，生物样本可被一种或多种刺激肿瘤细胞胞外体制造的药剂处理。该处理包含添加类固醇剂(例如地塞米松)、药剂(例如细胞毒剂诸如紫杉烷、顺氯氨铂等)及可能增加多囊泡胞内体量的试剂，和/或照射样本。
关于照射，其必须能足以诱生肿瘤细胞的细胞生长抑制作用。肿瘤细胞的照射可在培养肿瘤细胞之前、当时或之后进行。再者，宜当肿瘤细胞为存活时进行照射，即照射对象为—被切下的带肿瘤于灌流之前的器官，
—或在培养基中的细胞，—或被机械分解的细胞悬浮液；但在所有情况，皆是在缺氧/血管坏死/脱水造成肿瘤细胞产生应力之前进行。
关于用类固醇处理，其能使细胞活化而造成肿瘤细胞胞外体的胞外分泌。
关于用药剂处理，其可能—修改细胞骨架及重排细胞内隔室以扰乱内在化及胞外分泌的现象，及—使微管解聚。
关于用可能增加多囊泡胞内体量的药剂的处理，其于培养细胞时进行，其中可被提及的药剂有诺考哒唑(造成微管解聚的药物)、巴非罗微素(bafilomycin)(一种抑制液泡ATP酶的药物)(“巴非罗微素”一类来自微生物、动物细胞及植物细胞的膜ATP酶抑制剂)(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857972-7976)。
依照本发明的肿瘤细胞胞外体的有利制法按下述进行a)用肿瘤细胞的培养物进行，包括—肿瘤细胞于培养之前、当时或之后被照射，照射强度足以诱生肿瘤细胞的细胞生长抑制作用，但不超过15,000拉德，且以不超过10,000拉德为较佳，或者—于肿瘤细胞培养期间用类固醇(例如地塞米松)或细胞毒剂(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)或顺氯氨铂、docetaxel、蒽环素、纺垂体毒药、抗嘧啶或白细胞介素如IL10、IL2、IL15及GM-CSF)处理，或—用能增加多囊泡胞内体的量的药剂(例如诺考哒唑)处理[Gruenberg J等人，(1989)，“在活体中早期胞内体及推定胞内载体囊泡的特征以及在活体外囊泡融合的测定”，The Journal of CellBiology 1081301-1316]，因而增加肿瘤细胞胞外体的制造；b)用手术切下器官且在活体外用分离灌流回路处理以引流其所携带的肿瘤而得的生理血清的样本被用于进行制备肿瘤细胞胞外体；或c)用在活体外被解离的肿瘤外植体的上清液进行制备，包括—用类同醇(例如地塞米松)或细胞毒剂(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺氯氨铂、紫杉烷或白细胞介素如IL-10、IL-2、GM-CSF)处理。
肿瘤细胞胞外体的分离步骤可通过离心、层析、电泳、毫微过滤等不同方法进行。举例言之，其可能涉及肿瘤细胞的培养上清液或溶胞产物或者新鲜肿瘤悬浮液的膜部分的差速离心，以及含有该肿瘤细胞胞外体的部分的回收(Raposo等人，J.Exp.Med.1996，1831161-1172)。在该特定实施方案中，上清液膜部分为在100,000g离心后所得者。其宜包含液相电泳，该电泳按照生物物质所带的电荷而造成生物物质的分离。下述的实施例显示该法可被有利地用于分离肿瘤细胞胞外体且具有良好产率。该法对于工业规模的生产尤其有利。
本发明的目的亦为提供前文定义的肿瘤细胞胞外体的制法，其还包括—用编码主要组织相容性复合体(MHC)的第I类和/或第II类分子的外源基因和/或编码为肿瘤特征的抗原的基因和/或编码共同刺激/粘附分子或化学吸引趋化因子的基因对肿瘤细胞进行遗传修蚀，因而可以发现这些外源基因的产物在肿瘤细胞胞外体的表面被表达和/或被留在肿瘤细胞胞外体的内部，—或将肿瘤细胞产生的肿瘤细胞胞外体在活体外进行改质，诸如将蛋白质或核酸或药剂引进(通过电穿孔、与合成脂质体融合、重组病毒或化学方法)至肿瘤细胞胞外体的内部或之上。
本发明亦涉及能按照上述方法得到的肿瘤细胞胞外体。
按照上述转染的肿瘤细胞胞外体被回收及被用做肿瘤疫苗。
如上述在活体外被改质的肿瘤细胞胞外体被设计成在活体外或在活体中能将外源物质输送至靶细胞者。
关于与合成脂质体的融合，例如按照Nabel等人(1996)或Walker等人(1997，Nature 387，Pages 60 et seq.)所指示的进行。
本发明还涉及抗原呈递细胞，尤其是B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞或树状细胞，它们带有上文定义的肿瘤细胞胞外体。以树状细胞为佳。
本发明的树状细胞尤其具有下列特征—在不表达第I类分子以致不具有刺激CD8+T细胞的能力的肿瘤模型中，带有肿瘤细胞胞外体的树状细胞可以将这些肿瘤肽呈递给在MHC的第I类分子的环境中的细胞毒性T细胞(1号特征)。
—经由静脉注射或皮下注射的带有肿瘤细胞胞外体的树状细胞亦十分有效(2号特征)。
下列测定能证明1号特征。
在人类系统中，于存在第I类分子-阳性的树状细胞下培育的第I类分子-阴性性肿瘤细胞胞外体可刺激对肿瘤细胞胞外体所含的抗原具特异性的CD+8T克隆(见图7)。
下列试验可以证明2号特征。
在肿瘤为第I类分子-阴性的且肿瘤细胞胞外体本身亦缺乏第I类分子的小鼠系统中，当这些肿瘤细胞胞外体被培育及载于树状细胞之上时，可以介导抗肿瘤免疫反应，而当其被单独皮内注射后则不能产生抗肿瘤免疫反应。
本发明亦涉及上文定义的抗原呈递细胞的制法，其包括于存在前文定义的肿瘤细胞胞外体下培育抗原呈递细胞以及回收带有上述肿瘤细胞胞外体的上述抗原呈递细胞的步骤。
本发明亦涉及带有肿瘤细胞胞外体及能通过上述方法得到的呈递细胞。
本发明的目的亦为肿瘤细胞胞外体诸如前文定义的胞外体在抗原-呈递细胞(尤其是B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞或树状细胞)的敏感化或特异性T淋巴细胞的刺激上的用途。
本发明亦涉及自天然环境游离出、由带有前文定义的肿瘤细胞胞外体的抗原呈递细胞所分泌的膜囊泡。
为了得到前文定义的膜囊泡，必须用包含下述步骤的方法—制备前文定义的肿瘤细胞胞外体的步骤，—将肿瘤细胞胞外体与抗原呈递细胞一起培育的步骤，—将带有肿瘤细胞胞外体的上述抗原呈递细胞的培养上清液或溶胞产物的膜部分予以差速离心的步骤，以及—回收含有上述膜囊泡部分的步骤。
本发明的目的亦为提供如前文定义及能按照前述方法得到的膜囊泡。
在此方面，本发明涉及由树状细胞制造的膜囊泡。出乎意料之外，本发明者事实上已证明树状细胞能制造具有特别有利的免疫性质的膜囊泡。这些囊泡尤其可从树状细胞(特别是人类未成熟的树状细胞)的培养上清液见到、分离出来并鉴定。不像先前所述的囊泡，这些囊泡同时且以可观数目呈递主要组织相容性复合物的第I及II类分子，以致极为有利。这些膜囊泡包含环绕胞质部分的脂质双层，以及在下文中根据它的来源及不寻常的生物及生化性质而称为“树状细胞胞外体”(dexosome)。这些囊泡事实上具有显著的免疫原性质，因为其在活体内及活体外皆能刺激细胞毒性T淋巴细胞的制造及活性，以及在活体中能以依赖MHC-限制性T淋巴细胞的方式抑制被移植肿瘤的生长。所以树状细胞胞外体特别适于做为免疫治疗的非细胞途径中的活性成分。
就本发明而言，特别的膜囊泡为能通过树状细胞制造以及携带一种或多种主要组织相容性复合体的第I类分子及一种或多种主要组织相容性复合体的第II类分子的囊泡。
携带淋巴共同刺激分子的树状细胞胞外体是有利的，尤其是携带CD63和/或CD82和/或CD86分子者，以至少携带CD86为较佳。实施例中的研究显示树状细胞胞外体可被特异性对抗这些共同刺激分子的抗体强烈地标记。
再者，电了显微镜检分析显示树状细胞胞外体为均匀的且具有在约60nm与100nm间的直径，以在约60与90nm间为最常见。
本发明的特佳变型以直径在约60nm与90nm间且得自树状细胞的树状细胞胞外体为代表，其包含—一种或多种主要组织相容性复合体的第I类分子，—一种或多种主要组织相容性复合体的第II类分子，—一个或多个CD63分子，—一个或多个CD86分子，以及
—一个或多个CD82分子。
在本发明的一具体实施方案中，树状细胞胞外体另包含一种或多种抗原肽和/或是从未成熟树状细胞得到的。
又按照一具体的实施方案，树状细胞胞外体缺乏H2-M标记、li链及钙联接蛋白(一种内质网的特殊标记)。
再者，按照一有利实施方案，本发明的树状细胞胞外体在其外层尚含有磷脂酰丝氨酸(PS)。因此，自骨髓衍生的树状细胞上清液纯化所得的胞外体制剂通过Aupeix等人所述的方法分析(J.Clin Invest.991546-1554，1997)。在BMDC样本(含有35微克/毫升蛋白质)之外层中的磷脂酰丝氨酸含量为80nM的PS。因此树状细胞胞外体在其外层含有的PS的量是相当可观的。
树状细胞胞外体可按照包含下列步骤的方法制备得到树状细胞或含有树状细胞的细胞培养物的第一步骤，使细胞对被研究的抗原敏感化的第二步骤(此步骤非一定需要)，以及自这些细胞培养物制造树状细胞胞外体的第三步骤。这些不同步骤宜按照下文所述的方法进行。树状细胞的制备该法的第一步骤包含提供树状细胞的培养物。其可为富含树状细胞的细胞培养物，甚至为主要由树状细胞组成的细胞培养物。其显然宜为人类树状细胞。
树状细胞的制备已被详细记载于文献中。因此，已知这些细胞可从免疫系统的干细胞或从单核细胞前体得到，甚至可直接以分化形式分离到(载于Hart，Blood 90(1997)3245)。
树状细胞从干细胞的制造例如曾被Inaba等人(J.Exp；Med.176(1992)1693)，Caux等人(Nature 360(1992)258)或Bernhard等人(Cancer Res.55(1995)1099)说明。这些文献具体地记载了树状细胞可于存在颗粒性白血球-巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)下通过骨髓的培养物制造，更确切而言，将造血干细胞(CD34+)于存在细胞因子的组合(GM-CSF+TNFα)下培育而制造。
树状细胞从单核细胞前体的制造例如曾被Romani等人(J.Exp；Med.180(1994)83)，Sallusto等人(J.Exp；Med.179(1994)1109)，Inaba等人(J.Exp；Med.175(1992)1157)或Jansen等人(J.Exp；Med.170(1989)577)说明。这些方法主要以收集血液中的单核化细胞及将其于存在各种细胞因子的组合下培养为基础。一特别的方法包括将血液中的单核细胞前体于存在细胞因子的组合诸如白细胞介素-4+GM-CSF或白细胞介素-13+GM-CSF下处理。该法亦被Mayordomo等人(1995)说明。再者，其亦可将单核细胞前体用供细胞分化用的药剂(诸如钙离子通道活化剂)处理。
树状细胞的另一制造途径包含将被分化的树状细胞从生物样本中分离出来。该途径例如已被Hsu等人说明(Nature Medicine 2(1996)52)。该研究小组所述的方法主要由下列步骤组成收取外周血液样本以及将其分级及离心，以及自其提取树状细胞。这些方法在实施例中将被例示说明。更具体而言，在本发明的范围中，优选使用于存在GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13的组合下处理的单核细胞前体(被含在血液或骨髓中)所得到的树状细胞。
再者，为了实施本发明，宜使用包含未成熟树状细胞的树状细胞群。以使用主要由未成熟树状细胞组成(即其占至少60％，较佳70％)的树状细胞群为特别有利。树状细胞的未成熟状态相当于其发育的早期，此时其显示高度的内吞活性以及在其表面表达低量的MHC的第I及第II类分子以及淋巴共同刺激分子。令人惊异地，本发明者已发现只有未成熟的树状细胞能制造显著量的膜囊泡。因为已知树状细胞在未成熟阶段刺激T淋巴细胞的能力低，以致生物活性低(Cella，NatureLondon，388(1997)782)，该发明尤其令人感到惊异。
本发明方法的第一步骤因此宜包括制备未成熟树状细胞的树状细胞群，尤其宜从单核细胞前体开始，更优选将其用细胞因子的组合诸如GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13处理。
再者，在本发明的范围内可以使用树状细胞的无限增殖化群落。其可为树状细胞的无限增殖化细胞系(实施例所用的D1系或通过将真菌致癌基因引进树状细胞所制造的任何其他细胞系)。其亦可为在活体外制备继而被无限增殖化的树状细胞。无限增殖化树状细胞的价值在于可构成对特定抗原群敏感的细胞库，其在工业上可被用于制备能给药至所有各类病人的树状细胞胞外体。
该树状细胞一旦被制成，可以被保持在培养基中，被进一步纯化，贮存或直接用于该法接下来的步骤。树状细胞的敏感化本发明的树状细胞胞外体可从未带有抗原(即其膜上或其胞液中没有特异抗原)的树状细胞制备。该树状细胞胞外体被称为“无经验”或“处女”胞外体。
不过按照一较佳实施方案，本发明的树状细胞胞外体从被一抗原或一群抗原敏感化的树状细胞制备。在该实施方案中，树状细胞胞外体本身带有该抗原，因此能诱生对其的反应。
可用不同的方法使树状细胞对抗原敏感化。这些方法已被述于上文，尤其包括—将树状细胞与抗原肽接触(肽脉冲)。该途径包括使树状细胞与一种或多种抗原肽(即衍生自抗原的肽，诸如将该抗原用抗原呈递细胞处理所生成的肽)一起培育一段可变时间(通常为约30分钟至5小时)。该途径曾使用例如HIV病毒、流行性感冒病毒或HPV的抗原肽，或衍生自抗原Mutl、Mart、Her 2或Neu的肽[Macatonia等人，J.Exp.Med.169(1989)1255Takahashi等人，Int.Immunol.5(1993)849Porgador and Gilboa，J.Exp.Med.182(1995)255；Ossevoort等人，J.Immunother.18(1995)86；Mayordomo等人，如前提及；Mehta-Damani等人，J.Immunol(1994)996]。亦可能按照Zitvogel等人所述的方法(1996，如前述)将树状细胞与肿瘤细胞的酸性肽洗脱物一起培育。
—将树状细胞与一种或多种抗原接触(抗原脉冲)。该途径由使树状细胞与完整的抗原而非与一种或多种抗原肽一起培育所组成。该法的价值事实上在于抗原将通过树状细胞的天然机制转变成抗原肽，以致树状细胞呈递的抗原肽应提供更佳的免疫原性。该法例如已被Inaba等人(J.Exp.Med.172(1990)631)或Hsu等人(Nature Medicine2(1996)52)说明。
—将树状细胞与一种或多种抗原蛋白质复合物接触。该法类似前述方法，但可增加抗原的处理和/或呈递的效率。更具体而言，抗原可以可溶形式使用，或与能寻找膜受体如甘露糖受体或免疫球蛋白受体(Rfc)的寻靶成分复合。亦可能制造抗原粒子以改善其渗透性，甚至能被细胞吞噬。
—将树状细胞与表达抗原或抗原肽的细胞或细胞的膜接触。该途径以抗原或抗原肽通过细胞或细胞膜的融合而直接转移为基础。该法曾通过在树状细胞与肿瘤细胞的膜间进行融合而被例示说明(Zou等人，Cancer Immunol.Immunother.15(1992)1)。
—将树状细胞与含有抗原或抗原肽的膜囊泡(尤其是来自肿瘤细胞的胞外体，诸如上文所述的那些)接触。如本发明所显示，用胞外体使树状细胞敏感化的该途径特别有利，因为其不需知道具体的抗原肽以及不需要负载的抗原肽为“原始”构型。该技术将在实施例中被例示说明。
—将树状细胞与含有抗原或抗原肽的脂质体接触(Nair等人，J.Exp.Med.175(1992)609)。
—将树状细胞与编码抗原或抗原肽的RNAs接触(见Boczkowsky等人，1996，如前述)。
—将树状细胞与编码抗原或抗原肽的DNAs(可被掺入质粒载体、病毒或化学型的载体中)接触。因此，一使树状细胞敏感化的方法例如为用病毒感染树状细胞，对所述病毒的防卫是人们所希望的。例如曾经使用流行性感冒病毒(Bhardwaj等人，J.Clin.Invest.94(1994)797；Macatonia等人，如前述)。另一途径为通过病毒或其他核酸转移载体输送编码抗原或抗原肽的DNA。该途径例如曾被Arthur等人(Cancer Gene Therapy，1995)或Alijagie等人(Eur.J.Immunol.25(1995)3100)例示说明。一些病毒诸如腺病毒、AAV或逆病毒能被用于该目的，以将核酸输送入树状细胞。
在本发明范围内的较佳方法为用膜囊泡(胞外体型)、抗原肽、载体、RNAs或肿瘤的酸性肽洗脱物(APE)进行敏感化的方法。膜囊泡的使用以及“肽脉冲”及APE法在实施例中被例示说明且是特别优选的。树状细胞胞外体的制造当得到树状细胞群及使其对一种或多种抗原敏感化时，可以制备树状细胞胞外体。
该制备包括处理细胞的第一步骤(非必需)及分离树状细胞胞外体的第二步骤。
细胞的第一处理步骤系源自本发明的发明人发现树状细胞生成胞外体为一种可调节的现象。因此，在未处理的情况下，树状细胞胞外体的产量相对较低。尤其当使用事先未被刺激的成熟树状细胞群时，事实上无法检测到树状细胞胞外体的制造。本发明因此证明树状细胞胞外体的制造主要依赖树状细胞的类型以及对这些细胞处理的实施。这些要素可使具有用性质的树状细胞胞外体以能供工业用的产量获得。因此宜进行树状细胞的处理，以刺激这些细胞制造树状细胞胞外体。该刺激处理可通过在某些细胞因子存在下培养细胞，通过照射细胞，通过降低培养物pH值或通过这些不同类型处理的组合而进行。
在第一实施方案中，树状细胞于存在细胞因子下培育，其中该细胞因子优选选自γ-干扰素(IFNγ)、白细胞介素-10(IL-10)及白细胞介素-12(IL-12)，而以γ-干扰素及白细胞介素IL-10为较佳。如实施例所例示说明的，这些细胞因子似乎对树状细胞胞外体的制造(因子3至5)产生十分强的刺激作用。再者，令人惊异地，于存在IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IL-15等细胞因子时未观察到刺激作用，以及甚至于存在脂多糖(LPS)或TNFα时观察到抑制作用，不过LPS及TNFα被描述为可刺激树状细胞的成熟。所以这些结果显示(i)树状细胞胞外体的制造具可被调节的特性，以及(ii)某些细胞因子对于该制造具特殊作用。此外，这些结果说明使用未成熟的树状细胞具有令人吃惊的价值，以及细胞因子(尤其是IL-10)诱生细胞的未成熟状态在刺激步骤上的用途。在该实施方案中，细胞因子的用量可被本领域的技术人员调整，其为下列因子的函数(i)细胞因子，(ii)细胞群及(iii)可能进行的其他处理。应了解细胞因子优选以低于毒性的剂量使用。白细胞介素的剂量通常在1与100ng/ml之间，以及优选在1与50ng/ml之间。该干扰素可以在1至500IU/ml间的剂量使用，该剂量优选为5至200IU/ml。
在第二实施方案中，树状细胞接受照射。实施例所列出的结果事实上显示对细胞的照射可能增加树状细胞胞外体的制造水平。照射通常在1000与5000拉德间进行，较佳在2000与4000拉德间进行，以及最佳于约3000拉德下进行。
第二步骤由树状细胞胞外体的分离组成。该步骤的目的是自树状细胞和/或培养基分离树状细胞胞外体。该步骤尤其可能得到富含树状细胞胞外体且基本上无完整细胞的组合物。该步骤较佳生成包含至少70％(较佳至少85％)的树状细胞胞外体的组合物。
树状细胞胞外体的分离可按照所用生物材料用不同分离方法进行，如前文所述的分离肿瘤细胞胞外体的方法，这些方法视树状细胞胞外体的尺寸、质量、电荷或密度而有所不同。
因此，树状细胞胞外体可通过将树状细胞的培养基或培养上清液或膜部分或溶胞产物予以离心而分离。该分离例如可通过差速离心和/或密度梯度离心，继而回收含有该树状细胞胞外体的部分而进行。该类型方法基于通过相继离心而一方面分离出膜囊泡，另一方面分离出细胞、细胞残渣、内部囊泡等。在该特定实施方案中，含有树状细胞胞外体的部分通常于100,000g超速离心后得到。该法尤其被例示说明于实施例1及8中。
树状细胞胞外体的该分离步骤亦可通过层析、电泳和/或毫微过滤进行。
液相和/或密度梯度电泳可被有利地进行。该液相电泳(按照生物物质所带的电荷分离出生物物质)十分有利。下文的实施例11事实上显示该法可被用于分离胞外体且产率良好。该法对于工业规模的制造尤其有利。
纯化可通过层析进行。特别可提及的有离子交换层析、凝胶渗透(或排阻)层析或疏水性层析。鉴于树状细胞胞外体的脂质本质，离子交换层析特别有用。毫微过滤可按照已知的方法对细胞上清液进行。
层析和/或电泳法和/或毫微过滤构成本发明的另一重要特征，因为相对于目前的技术，其能使产品品质改良且其产量适合工业(尤其是药业)使用。
在此方面，本发明还涉及膜囊泡的制法，其包括至少一通过电泳、层析和/或毫微过滤的分离步骤。该法尤其适于制备胞外体型的膜囊泡，诸如肿瘤细胞胞外体或树状细胞胞外体。在该法中，通过电泳或层析的分离步骤可直接对培养物上清液、细胞溶胞产物或欲纯化的制剂进行。电泳优选为液相电泳。
树状细胞胞外体具有显著的性质，其将在实施例中被说明。因此，树状细胞胞外体刺激细胞毒性T淋巴细胞在活体外的增殖。再者，树状细胞胞外体在活体中能抑制肿瘤生长。这些囊泡因此能极有效率地呈递抗原以及MHC的第I类及第II类分子。所以树状细胞胞外体例如在癌症以及寄生性或感染性疾病领域具有非常多的用途。此外，在高剂量(可能诱生耐受性)下，树状细胞胞外体亦可用于治疗诸如过敏、哮喘或自体免疫疾病等疾病。此外，这些“无经验”(naive)的树状细胞胞外体亦可用做刺激和/或调节免疫反应的佐剂。
本发明的目的亦在于下列物质的用途—如前文定义的肿瘤细胞胞外体，或—如前文定义的抗原呈递细胞，或—如前文定义的树状细胞胞外体，亦即它们在活体外对于上述肿瘤细胞胞外体、抗原呈递细胞或树状细胞胞外体或者B淋巴细胞所含的抗原具特异性的T淋巴细胞予以刺激及可选择性地增殖的用途，尤其是在活体外刺激及增殖T淋巴细胞的用途。
本发明亦涉及前文定义的肿瘤细胞胞外体或前文定义的抗原呈递细胞或前文定义的树状细胞胞外体在活体外选择能识别上述肿瘤细胞胞外体、抗原呈递细胞或树状细胞胞外体所含的特异性抗原的全部T淋巴细胞的用途。
本发明的目的亦为提供一种药剂，其含有至少一种做为活性成分的前文定义的肿瘤细胞胞外体、前文定义的抗原呈递细胞和/或前文定义的树状细胞胞外体，以及药业上允许的载剂。
本发明亦有利地涉及前文定义的药剂在治疗癌症、寄生性或感染性疾病上的用途。
该药剂更优选含有前文定义的肿瘤细胞胞外体或树状细胞胞外体。
按照另一实施方案，本发明涉及前文定义的药剂在治疗过敏、哮喘或自体免疫疾病上的用途。
关于适当的配方，肿瘤细胞胞外体或树状细胞胞外体可被含在置于安瓿或任何其他适当装置(注射器、袋子等)内的生理血清中。其可于使用之前即时制备，或者被例如冷冻贮存于-80℃。所用的溶液可由食盐水溶液组成，可选择性地添加稳定剂和/或佐剂。稳定剂具体可为蛋白质或高分子量分子。特别可被提及的有蛋白质诸如人类血清白蛋白或分子，诸如萄聚糖或聚环氧烷类。
本发明的组合物亦可含有一种或多种佐剂或与其合用。该佐剂更具体而言可为任何免疫刺激药剂诸如细胞因子(尤其是白细胞介素-12)。该药剂通常被用于临床疗程或疫苗组合物中。再者，按照本发明的佐剂亦可为在活体中能刺激树状细胞制造的药剂。举例言之，可被提及的有化合物Flt3。该类型药剂的组合的使用能够增加树状细胞的数目，因此可能增进本发明组合物的效率。
因此，本发明的另一目的涉及肿瘤细胞胞外体和/或树状细胞胞外体与刺激用佐剂的组合，它们被分开使用或间隔使用。
本发明药剂的适当给药方式包含注射，尤其是皮内或皮下注射。当药剂的活性成分由带有肿瘤细胞胞外体或树状细胞胞外体的树状细胞组成时，该给药方式特别适当。
适当的剂量为0.01至10，尤其是0.10至5，更加适当的是0.15至2微克/公斤体重，对于皮内反应试验而言，为10微克。
本发明的药剂用于预防性疫苗接种处理时为100微克。
本发明的药剂被设计成能达到下列目的—迟发性过敏反应(对于癌症患者的试验)，—预防性治疗，或—通过限制性稀释过程检测特异性细胞毒性淋巴细胞前体的频率或干扰素的分泌。
该目的为在抗肿瘤治疗(标准处理或特异性主动免疫)之前、当时及之后，使用与本发明的肿瘤细胞胞外体预培育的自体或同种异体树状细胞做为带有肿瘤个体的外周淋巴细胞的靶标。
本发明亦涉及前文定义的肿瘤细胞胞外体、前文定义的抗原呈递细胞和/或前文定义的树状细胞胞外体在制备用于治疗肿瘤(尤其是实体肿瘤以及腹水及造血方面的肿瘤)的药剂上的用途。
关于实体肿瘤，可被提及者有肾脏、乳房、结肠、肺、胃及肝的癌症，黑色素瘤及肉瘤等。
关于造血方面的肿瘤，可被提及者有白血病、何杰金氏及非何杰金氏恶性淋巴瘤。
如前文所示，本发明的组合物，尤其是含有树状细胞胞外体的组合物亦可被用于治疗寄生性或感染性疾病。就此类型的用途而言，树状细胞胞外体带有寄生物或感染物(病毒)的抗原或肽。
本发明亦涉及前文定义的肿瘤细胞胞外体或前文定义的树状细胞胞外体，在癌症的迟发性过敏试验方面或在做为诊断工具以研究特异性细胞毒性CTL前体的频率方面的用途。
本发明亦涉及肿瘤细胞胞外体，或者前文定义的肿瘤细胞胞外体或前文定义的树状细胞胞外体之一部份或构成成分，在活体外或活体内将生物物质移入细胞的用途。
本发明亦涉及自相同或不同组织学类型的肿瘤细胞衍生得的肿瘤细胞胞外体库的建立。
白不同组织学类型的肿瘤细胞衍生得的肿瘤细胞胞外体库由自特定类型癌症的多种肿瘤细胞系制得的肿瘤细胞胞外体混合物组成。这些肿瘤细胞胞外体库使得抗原呈递细胞尤其是树状细胞，可被敏感化以对抗该类型的所有肿瘤。
本发明亦涉及肿瘤细胞胞外体或树状细胞胞外体的混合物。
举例言之，可被提及者有遗传相关肿瘤(乳房及卵巢的癌症)或者显示已知p53、p16突变的肿瘤(乳癌、肉瘤)的肿瘤细胞胞外体的混合物。
亦可被提及者为肿瘤细胞胞外体与囊泡的混合物，其中该囊泡衍生自无限增殖化细胞以及被转染而能表达共同刺激分子、粘附分子及吸引剂趋化因子(与在肿瘤细胞胞外体上表达者不同)的细胞。
本发明将通过下列实施例更详细地说明，这些实施例系用于说明目的而非限制目的的。附图及表的说明表1.肿瘤细胞系被培育24小时，以达到密度为100万细胞/毫升，然后通过差速离心自培养基制备肿瘤细胞胞外体(见实施例)。肿瘤细胞胞外体蛋白质浓度通过布莱德福德(Bradford)试验测量(BioRad蛋白质测定{BioRad})。
MZ-2被述于Traversari等人(1992)中。
*表示不同的原发性细胞系是由古斯塔夫·罗西学院的临床生物实验室建立并鉴定了特征的细胞系以及于要求时可以提供。
图1A及B.衍生自TS/A细胞的多囊泡胞内体及肿瘤细胞胞外体的形态。
A.TS/A细胞的超薄切片通过电子显微镜分析。细胞质的细节显示含有直径为60-80nm的囊泡的胞内隔室。
B.得自TS/A细胞的肿瘤细胞胞外体制剂按照对完整囊泡所进行的步骤(Raposo等人，(1996))进行电子显微镜分析。肿瘤细胞胞外体制剂含有的主要囊泡群是直径为60-80nm且尺寸及形态与A所示的多囊泡胞内体的内部囊泡相似的囊泡。
图2.肿瘤细胞的胞外体中存在的不同标记A.2微克肿瘤细胞胞外体蛋白质(Exos)或2×105个肿瘤细胞通过蛋白质印迹分析，其在对下列分子具特异性的单克隆抗体的帮助下进行MHC的第I类分子[Machold Robert P.等人(1995)“影响游离的主要组织相容性复合物的第I类分子重链的折叠及细胞内运输的肽”，J.Exp.Med.1811111-1122]，运铁蛋白受体(TfR)(对应抗体为H68.4，被述于Biochimica et Biophysica Acta(1992)1136(1)28-34)，Lamp1及2(大家鼠抗-小鼠单克隆抗体，Pharmingen)以及钙联接蛋白(Hebert Daniel N.等人(1995)，“通过葡萄糖剪切及再葡萄糖基化而测定在内质网中与钙联接蛋白缔合的糖蛋白”，Cell 81425-433)。
B.黑色素瘤细胞系(FON)的肿瘤细胞胞外体蛋白质10微克或得自相同细胞的全部蛋白质10微克，在抗-MART-1抗体{Marincola F.等人，(1996)，“在转移性黑色素瘤细胞系中及于原损伤处与黑色素瘤相关的抗原MART-1及gp100的表达的分析”，Journal ofImnmnotherapy 19192-205}的帮助下，通过蛋白质印迹分析。
C.黑色素瘤细胞系(FON)的肿瘤细胞胞外体蛋白质或相同细胞的全部蛋白质在抗-HSP70抗体的帮助下通过蛋白质印迹分析。
D.黑色素瘤细胞系(FON)或MZ-2系的肿瘤细胞胞外体蛋白质在抗-gp96抗体的帮助下，通过蛋白质印迹分析。
图3.衍生自MART-1阳性肿瘤系(FON)的肿瘤细胞胞外体刺激对MART-1具特异性的T克隆。
将T克隆LT8(或LT12，结果未示出)的2万个细胞与衍生自FON(MART-1及HLA-A2阳性细胞系)的肿瘤细胞胞外体或衍生自GIAM(肾瘤系的细胞，MART-1阴性)的肿瘤细胞胞外体(做为阴性对照)一起培育48小时。T克隆细胞制造的TNFβ用SEHI细胞(Espavik等人)通过生物测定法测量。肿瘤细胞胞外体诱使T克隆制造IFN，因此在肿瘤细胞胞外体的表面显示存在衍生自MART-1的HLA-A2/肽复合物。
—“LT8+TexGIAM”对应于在衍生自GIAM肿瘤细胞胞外体存在下培育的LT8T克隆；—“LT8+TexFON”对应于在衍生自FON肿瘤细胞胞外体存在下培育的LT8T克隆；—“LT8+TumFON”对应于在衍生自GIAM肿瘤细胞胞外体存在下培育的LT8T克隆。
特定条件的细胞被示于横轴以及TNFβ的产量(pg/ml)被示于纵轴。
图4.衍生自表达βGal的P815细胞的肿瘤细胞胞外体刺激被重组βGal腺病毒免疫的小鼠的脾脏细胞。
将2个月前用106pfu的重组βGal腺病毒免疫且已对表达βGal的肿瘤表现出排斥的BALB/c鼠的脾脏细胞(105)与衍生自P815细胞(空心菱形，◇)或P815-βGal细胞(实心正方形，■)的肿瘤细胞胞外体一起培育。未与肿瘤细胞胞外体一起培育的脾脏细胞做为背景组并以实心圆●标示。培养5日后，在每培养孔加入1μCi的氚标记的胸苷。18小时后测量被纳入细胞DNA中的氚量。按照费契尔(Fisher)的精确方法，属于差异显著的结果的以*标记。
衍生自P815肿瘤细胞胞外体的量(μg/ml)被示于横轴以及计数/分钟(CPM)被示于纵轴。
图5.肿瘤细胞胞外体所含的肿瘤抗原MART-1可通过树状细胞向T淋巴细胞呈递。
将逐渐增加剂量的衍生自肿瘤细胞系FON(MART-1+，HLA-A2+，A1-)及MZ2(MART-1+，HLA-A2-，A1+)的肿瘤细胞胞外体与LT12T克隆(96孔微量滴定板的每孔含20,000个细胞)(对HLA-A2/MART-1的肽具特异性)，于存在衍生自循环巨噬细胞(DCA2)的HLA-A2+树状细胞下培育(Sallusto，F.And LanzavecchiaA.，1994，“经培养的人类树状细胞对可溶性抗原的有效呈递通过GM-CSF及IL-4维持并被TNFα向下调整”，J.Exp.Med.1791109-1118)。横轴所示的IFNγ分泌量是于2日后在培养上清液中测得。衍生自FON的肿瘤细胞胞外体以及衍生自MZ2的那些诱使LT12及LT8分泌IFN(结果未示出)。FON细胞亦诱使T克隆分泌大量IFNγ，而MZ2细胞(未表达足够单倍体型HLA分子(HLA-A2)不诱生IFNγ的制造。)—“LT12+DCA2”对应于在HLA-A2+树状细胞的存在下培育的LT12T克隆；—“LT12+DCA2+TexFON”对应于在带有衍生自FON肿瘤细胞胞外体的树状细胞存在下所培育的LT12T克隆。
—“LT12+DCA2+TexMZ2”对应于在带有衍生自MZ2肿瘤细胞胞外体的树状细胞存在下所培育的LT12T克隆。
图6A及6B.在活体中肿瘤细胞胞外体的抗肿瘤作用。
将10万个TS/A肿瘤细胞注射入BALB/c鼠(A)或裸鼠(B)。3日后，各鼠接受二次相继的20μg至30μg肿瘤细胞胞外体的皮内注射(在图中以D3及D4表示)，两次注射相隔24小时。然后每星期测量肿瘤的尺寸二次。按照费契尔(Fisher)的精确方法进行统计分析(95％显著性以*表示)。
A.二群(5只/群)小鼠接受衍生自TS/A的肿瘤细胞胞外体(实心三角形)或衍生自MCA38(衍生自C57BL/6小鼠的结肠腺癌细胞系)的肿瘤细胞胞外体(空心三角形)，后者做为阴性对照组。只有衍生自TS/A的肿瘤细胞胞外体在活体中具有抗肿瘤作用。
B.二群裸鼠接受相同剂量的以相同方法制得的肿瘤细胞胞外体制剂(■TS/A胞外体；□MC38胞外体)。
未观察到对裸鼠有抗肿瘤作用。因此T淋巴细胞对于肿瘤细胞胞外体在活体中的抗肿瘤作用是必需的。
时间(日数)被示于横轴以及肿瘤的平均尺寸(mm2)被示于纵轴。
图7.被衍生自肿瘤细胞的胞外体敏感化的衍生自骨髓的树状细胞在活体中完全根除被移植生长的实体肿瘤。
将50万个P815细胞于治疗前10日注射入DBA/2小鼠的右脊腹部。在相同脊腹部但距肿瘤一段距离处单次注射肿瘤细胞胞外体(10μg/小鼠)。另一群则静脉注射先前曾与P815肿瘤细胞胞外体一起培育3小时的树状细胞(衍生自用GM-CSF+IL-4处理5日的骨髓；Mayordomo等人，1995)。测量肿瘤以及结果如图6所述被分析。被P815肿瘤细胞胞外体敏感化的树状细胞对被移植生长的肿瘤产生排斥。微粒体对于肿瘤的生长无显著的作用。插图显示无肿瘤小鼠的百分率(纵轴)，实心长条图只对应于实心正方形代表的动物群，时间(日数)被示于横轴。这些动物于再次注射最低肿瘤剂量的2倍剂量后未再生成肿瘤，此显示小鼠已发展出抗肿瘤免疫力。图中所用代号的意义如下○与对照肿瘤细胞胞外体一起培育的树状细胞，■与P815肿瘤细胞胞外体一起培育的树状细胞，▲经由皮内注射的P815肿瘤细胞胞外体，及×未治疗动物。
时间(日数)被示于横轴以及肿瘤的平均体积被示于纵轴。
图8A，8B及8C.细胞毒性剂/化学治疗剂以及照射可刺激肿瘤细胞胞外体的胞外分泌。
使用鼠白血病L1210及原始人类肾癌细胞系GIAM(图8C)。将200万个肿瘤细胞于存在递增量的5-FU(在L1210的场合)或顺氯氨铂(CDDP)(在GIAM的场合)下培育16小时。
将上清液回收，然后按表1所述接受不同的离心。
亦将GIAM与1000IU/ml的IL-2或地塞米松(10-6M)一起培育，或以10,000拉德照射。
高剂量的化学治疗及照射在这些肿瘤模型中为正向调节肿瘤细胞胞外体的胞外分泌的良好例子。该结果在其他肿瘤(图8A及8B)中亦被发现；尤其照射似乎为最有力的胞外分泌刺激剂。
图8A对应于前述的FON黑色素瘤以及图8B对应于被命名为EL4的鼠淋巴瘤(J.Nat.Cancer Ins.(1972)48265-271)。
于不同条件下培育的FON细胞被示于图8A中1)CM基本培养基(含有10％胎牛血清的RPMI)，2)DXM＝存在地塞米松，3)照射用10,000拉德照射，4)无血清，5)IL-10＝存在10ng/ml的IL-10。
上述照射对于EL4、L1210及GIAM细胞亦有效。
图9A，9B及9C.被处理而对黑色素瘤肿瘤抗原敏感的树状细胞所产生的膜囊泡(树状细胞胞外体)在刺激对这些黑色素瘤具特异性的T淋巴细胞上有效，以及它的制造由细胞因子调节。
—LT8(CM)对应于在图8A界定的基本培养基中培育的LT8T克隆，—DexTexNUN对应于带有源自NUN肿瘤细胞的肿瘤细胞胞外体的树状细胞所衍生得的树状细胞胞外体，—DexTexFON对应于带有源自FON肿瘤细胞的肿瘤细胞胞外体的树状细胞所衍生得的树状细胞胞外体，—TumFON对应于FON肿瘤细胞。
A.增殖测定将FON肿瘤细胞胞外体(图3所用者)与HLA-A2树状细胞一起培育3小时，然后用9％食盐水溶液冲洗及在酸性培养基(pH6.3)中培育18小时。然后自上述HLA-2树状细胞的培养上清液回收树状细胞的膜囊泡(树状细胞胞外体)。
然后将源自带有肿瘤细胞胞外体的树状细胞的膜囊泡(DexTex)与对在HLA-A2环境中呈递的MART-1具特异性的LT8克隆一起培育(FON肿瘤细胞胞外体含有抗原MART-1)。用NUN肿瘤细胞胞外体(HLA-A2-阴性肾癌细胞系，MART-1阴性)做为阴性对照。被照射的肿瘤细胞系FON(Tum FON)或被预吸附在塑胶上的抗-CD3抗体(anti-CD3Ab)被用作阳性对照。DexTex与LT8克隆的培育持续48小时，然后在每200μl孔中加入1μCi的氚标记的胸苷。18小时后测量LT8淋巴细胞的增殖。
每分钟计数被示于纵轴。
B.进行相同的操作，不过IFNγ在培养上清液中于48小时时通过ELISA测量。IFNγ含量(pg/ml)被示于纵轴。
C.自于存在或不存在LPS(20μg/ml)、IFN-γ(100IU/ml)或IL-10(10μg/ml)下培育48小时后的树状细胞上清液中分离树状细胞胞外体。
图10.在免疫-电子显微镜检中树状细胞胞外体的显微照片。
树状细胞胞外体具有在50及90nm之间的均匀直径以及被抗-CD63抗体充分标记(图10A)。这些树状细胞胞外体的绝大部分亦被抗-MHC-I(图10B)及抗-MHC-II(图10C)抗体标记。直线长度250nm。
图11.于带有肽的树状细胞胞外体或对照树状细胞胞外体存在下培育的T淋巴细胞所分泌的γ-干扰素的浓度的测定。将树状细胞(2×106/毫升)悬浮于柠檬酸(pH3.7)中，或于10μg/ml的抗原肽MART-1/Melan A(27-35)存在下，于10μg/ml肽gp100(280-288)(对照群)存在下培育3至12小时，然后分离树状细胞胞外体。继而将LT12克隆(限制性HLA-A2 CTL克隆，对MART-1(27-35)具特异性)的细胞(100,000 CTL/孔)与递增剂量的树状细胞胞外体或gp100肽(对照群)在96孔板中一起培育5日。被细胞分泌的γ-干扰素然后通过ELISA(Genzyme)测量。
图12.在衍生自骨髓的树状细胞所制造的树状细胞胞外体(1.4及10μg)上存在的标记的蛋白质印迹分析H-2K(MHC-I)，I-Aα(MHC-II)CD86、CD63、TfR(运铁蛋白受体)、Clx(钙联接蛋白)、lip31(不可变的链)。
图13.在肥大细胞瘤(P815)肿瘤模型中树状细胞胞外体的活体内抗肿瘤作用。Dex-H2d-APE-P815带有肿瘤P815的酸性肽洗脱物且衍生自骨髓树状细胞的树状细胞胞外体。Dex-H2d-APE-脾带有脾细胞的酸性肽洗脱物且衍生自骨髓树状细胞的树状细胞胞外体。
图14.在哺乳动物肿瘤模型(TS/A)中，带有酸性肿瘤肽洗脱物且衍生自骨髓树状细胞的树状细胞胞外体在活体内的抗肿瘤作用。图中符号的意义见图13。(A)对有免疫能力小鼠进行的实验。(B)对裸鼠进行的实验。
图15.放射活性铬(51Cr)的释出测定。该测定显示本发明的树状细胞胞外体在活体中会引发特异性的CTL反应。靶细胞P815，白血病细胞系L1210，对NK细胞不敏感的YAC系。
图16比较树状细胞胞外体与树状细胞的效力。该图显示树状细胞胞外体比制造其的未成熟树状细胞更能有效根除活体内被移植生长的肿瘤。将500万个带有脾脏(空心菱形)或肿瘤P815(空心三角形)的酸性肽洗脱物的树状细胞于第8至10日，通过静脉内或皮内途径施给具有被移植生长的P815肿瘤的小鼠。另一方面，将这些细胞与脾脏(空心菱形)或肿瘤P815(空心三角形)的肽培育18小时后，收集其上清液，将之超速离心及分析有关树状细胞胞外体含量的特征。从500万个树状细胞可以得到5至10μg的树状细胞胞外体，该量可使五只小鼠免疫(通过皮内注射施至相同胁腹部)。于第8-10日进行树状细胞胞外体的单次施给。每星期测量肿瘤尺寸二次且将结果示于图上。*代表按照费契尔(Fisher)的精确方法，与注射食盐水溶液者(空心正方形)或被脉冲的树状细胞相较，结果具95％显著性。插图显示在不同群的5只鼠中，于实验期间(第21日)及实验结束时(第60日)，被免疫以对抗P815的鼠中显示肿瘤全部消失者的百分率。
图17树状细胞通过液相电泳而纯化。实施例1.肿瘤细胞胞外体通过鼠及人类肿瘤细胞系的制造该实施例说明肿瘤细胞制造脂质囊泡的能力。
这些源自白血病或实体肿瘤(肾或结肠黑色素瘤)的鼠或人肿瘤细胞(见表1)被培育24小时，至其密度为100万个细胞/毫升。然后将培养基(含有10％胎牛血清的RPMI)于300g离心10分钟而与细胞分开。细胞残渣继而通过相继离心二次，每次于800g离心15分钟(以及可选择在10,000g离心30分钟)而去除。肿瘤细胞胞外体最后通过于100,000g离心60分钟而被回收，然后用PBS于相同条件下冲洗一次。在肿瘤细胞胞外体制剂中蛋白质的浓度通过布莱德福德法(BioRad蛋白质测定{BioRad})测量。
所有被测试的人类及鼠肿瘤细胞系(实体肿瘤或造血性、原发性肿瘤或被移植生长或源自被解离的新鲜肿瘤)均会制造肿瘤细胞胞外体(表1)。不过制造效率随不同的细胞系而变。所用鼠肿瘤细胞是在24小时后每50毫升细胞产生100至200微克肿瘤细胞胞外体蛋白质。而人类黑色素瘤及肾肿瘤细胞系在24小时后每两千万细胞产生10至100微克肿瘤细胞胞外体蛋白质。
2.肿瘤细胞制造的囊泡来自胞内为了决定自肿瘤细胞系上清液纯化得的囊泡是否来自胞内，通过电子显微镜进行作为这些肿瘤系之一的TS/A(鼠乳癌细胞系)的形态研究(参见Nanni P.等人(1983)，TS/A“一种新的来源于BALB/c自发性乳腺瘤的转移性细胞系”，Clin.Exp.Metastasis 1373-380)。如前文所述肿瘤细胞被固定及制备以供电子显微镜检。肿瘤细胞胞外体被直接沉积在格栅上及被分析。
图1A显示在肿瘤细胞内被观察到的具多囊泡外观的细胞内隔室的例子。这些胞内隔室的直径为200-300nm(在图1A及1B底部的线条代表200nm)以及由环绕多个内部囊泡(直径68-80nm)的外膜组成。肿瘤细胞胞外体制剂主要含有直径为60-80nm的囊泡群(图1B)，其有时呈聚集物以及在形态上类似在细胞内部所观察到的多囊泡胞内体的内部囊泡(图1A)。这些结果暗示在胞内体的外膜与细胞膜融合后，肿瘤细胞胞外体被分泌入细胞外介质中。事实上，该细胞分泌模式在这些细胞中被观察到(资料未被示出)。
为了决定肿瘤细胞胞外体是否确为胞内来源，对于衍生自肿瘤细胞系TS/A及P815(鼠肥大细胞瘤)(参见由比利时布鲁塞尔T.Boon，Ludwig学院提供的肥大细胞瘤资料)的肿瘤细胞胞外体中呈递的标记(如下文定义)进行蛋白质印迹分析。为了进行该分析，通过丙烯酰胺凝胶分离出2微克肿瘤细胞胞外体蛋白质或200,000个TS/A细胞的溶胞产物，然后转移入尼龙膜(Amersham)。然后，可能存在的不同标记在特异性抗体帮助下被显示。TS/A及P815的肿瘤细胞胞外体含有MHC的第I类分子以及胞内途径中的各种标记(运铁蛋白受体，溶酶体糖蛋白Lamp1及2)(图1A)。另一方面，内质网(ER)的标记特征，钙联接蛋白，在肿瘤细胞胞外体制剂中则不存在，此显示肿瘤细胞胞外体未被ER膜污染。
3.由黑色素瘤产生的肿瘤细胞胞外体含有胞质肿瘤抗原这些结果显示肿瘤细胞分泌的肿瘤细胞胞外体相当于多囊泡胞内体的内膜。这些胞内体内囊泡通过缩入，继而由胞内体的外膜朝向胞内体的内部芽生而形成。这些胞内体内囊泡以及从其衍生的肿瘤细胞胞外体因而应含有胞质部分。此在抗肿瘤免疫疗法中特别重要，因为一些肿瘤抗原，包括MART-1(最常被研究者之一)，为胞质蛋白质。因此测定肿瘤细胞胞外体中是否存在MART-1。
为进行上述测定，将10微克肿瘤细胞胞外体蛋白质或200,000个人类黑色素瘤细胞系(M10)细胞(比利时布鲁塞尔T.Boon，Ludwig学院提供)的溶胞产物，如前文所述，通过蛋白质印迹分析。然后通过特异性抗-MART-1抗体(S.Rosenberg，NCI，Bethesda，U.S.A.)的帮助显示可能存在的MART-1。通过FON肿瘤细胞系(来自病人FON的黑色素瘤，从法国巴黎巴斯德研究所的F.Faure获得)分泌的肿瘤细胞胞外体含有肿瘤抗原MART-1。用蛋白酶K(西格玛公司)进行的保护实验显示可被该单克隆抗体识别的MART-1表位是位于肿瘤细胞胞外体的内部(结果未被示出)。
该研究的第一部分显示—肿瘤细胞产生及分泌囊泡，—这些囊泡为胞内来源的囊泡，在其外膜上发现有不同的膜分子(MHC的第I类，不同的胞内体标记)，—这些囊泡含有胞质部分，其包括胞质肿瘤抗原如MART-1。
这些结果证明被称为肿瘤细胞胞外体的囊泡具有下列生物活性。
4.肿瘤细胞胞外体在活体外会刺激CD8 T淋巴细胞既然肿瘤细胞胞外体在其表面有MHC的第I类分子，因此测定其是否能刺激CD8 T淋巴细胞。使用二种T克隆LT8及LT12，其由法国巴黎巴斯德研究所的F.Faure提供，能识别衍生自MART-1及HLA-A2的肽(Dufour等人，1997)。为达此目的，既然FON肿瘤细胞为HLA-A2，将LT8或LT12克隆的细胞与自FON上清液制得的肿瘤细胞胞外体一起培育，或与完整的FON细胞一起培育做为阳性对照。T淋巴细胞的活化度通过TNF β的分泌量而测量。FON肿瘤细胞胞外体以剂量-依赖方式诱使LT8及LT12分泌TNF β(图3)。FON细胞亦诱使TNF分泌，而衍生自不表达MART-1的肿瘤细胞的胞外体则不诱导TNF的分泌。
所以，HLA-A2/MART-1肽复合物存在于肿瘤细胞胞外体的表面。
在小鼠中用被β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞可以得到相同的结果。
肿瘤细胞胞外体从P815肥大细胞瘤或表达β-gal的P815细胞(A.Albina，Gustave Roussy Institute，Villejuif，France)的上清液制得，或从不表达β-gal的另一肿瘤(L1210，H2α鼠白血病)的细胞的上清液制得。然后将递增浓度(0.3μg/ml至20μg/ml)之这些不同肿瘤细胞胞外体制剂与用重组腺病毒表达的β-gal免疫的小鼠的脾脏细胞一起培育4日。只有表达β-gal的P815细胞(在20μg/ml的最高浓度)的肿瘤细胞胞外体诱使脾脏细胞有意义的增殖，虽然仅为中度(见图4)(通过氚标记的胸苷的摄入量测量)。这些结果显示表达β-gal的P815细胞产生的肿瘤细胞胞外体在其表面带有H2α/衍生自β-gal的肽的复合物，以及能够活化鼠的T淋巴细胞。
5.肿瘤细胞胞外体能将其所含的胞质抗原输送至抗原呈递细胞以将其向T淋巴细胞呈递。
为达到此目的，将能特异性识别衍生自MART-1(MART-127-35＝AAGIGILTV，Dufour E.et al；细胞毒性黑色素瘤-特异性免疫反应的多样性，J.Immunol.1997，1583787-3795)的肽的LT8及LT12与HLA-A2合用。已证明通过FON人类黑色素瘤细胞系(其为HLA-A2)产生的肿瘤细胞胞外体含有肿瘤抗原MART-1(见图2)以及能直接活化LT8及LT12克隆。为了提供亦含有MART-1，但无法直接刺激LT8及LT12克隆的肿瘤细胞胞外体，使用MZ2黑色素瘤细胞系(比利时布鲁塞尔T.Boon，Ludwig学院)，其为MART-1阳性但仅表达限制成分而非HLA-A2(限制成分为HLA-A1)。事实上，MZ2细胞以及衍生自这些细胞的肿瘤细胞胞外体不能活化LT8及LT12克隆(结果未被示出)，此结果与FON细胞及衍生自这些细胞的肿瘤细胞胞外体不同(图3)。另一方面，当将这些衍生自MZ2的相同肿瘤细胞胞外体于表达HLA-A2的树状细胞存在下培育时，如同在衍生自FON的肿瘤细胞胞外体的场合所观察到的，会刺激LT8及LT12克隆(图5)。
在衍生自MZ2的肿瘤细胞胞外体的场合，既然MZ2不表达适当的限制成分(HLA-A2)，T克隆的活化并非由于原先存在的HLA-A2与衍生自MART-1的肽的复合物。所以其只可能为肿瘤细胞胞外体所含的抗原被抗原呈递细胞摄取及降解为肽，其然后再与呈递细胞的HLA-A2分子结合。肿瘤细胞胞外体因此使抗原在肿瘤细胞与抗原呈递细胞之间的传递。肿瘤细胞胞外体因此具有与“天然脂质体”相似的功能。
6.肿瘤细胞胞外体诱使在活体内被移植生长的实体肿瘤缓解。
最后，既然肿瘤细胞胞外体在活体外能刺激T淋巴细胞及使树状细胞敏感化，以活化肿瘤-特异性T淋巴细胞，因此在活体中测试肿瘤细胞胞外体的抗-肿瘤活性。
为了分析该抗肿瘤活性，在鼠的胁腹部注射为最低肿瘤生成剂量(105)的2倍的来自哺乳动物肿瘤的肿瘤细胞(H2d单倍体型的TS/A细胞，与BALB/c细胞同系)。将自TS/A细胞上清液制得的肿瘤细胞胞外体或来自MC38细胞的肿瘤细胞胞外体(做为阴性对照)(S.Rosenberg，NCI，Bethesda，U.S.A.)(H2b单倍体型的肿瘤细胞)或相似体积的PBS，注射于带有被移植生长的肿瘤的动物，共注射二次(第3天或第4天)。在接种TS/A肿瘤细胞胞外体制剂的鼠群中，肿瘤的平均尺寸与对照鼠群相较减小许多。因为带有肿瘤及同样用肿瘤细胞胞外体制剂接种的裸鼠(缺乏T淋巴细胞的突变鼠)未显示肿瘤质量减少，该抗肿瘤作用显然依赖T细胞(图6B)。
在该系列的实验中，在使用自H2d单倍体型的P815肥大细胞瘤制得的肿瘤细胞胞外体时观察到抗肿瘤作用，此暗示该二肿瘤表达共同的抗原。用另一致免疫的肿瘤模型，即肥大细胞瘤P815(与DBA/2鼠为同系，且为H2d单倍体型)，得到相似结果。在该模型中，显示将肿瘤细胞胞外体经皮内注射于带有被移植生长10日的肿瘤(P815)的小鼠胁腹部时，超过60％的病例的肿瘤被根除。再者，这些鼠显示长期的抗肿瘤免疫力(结果未被示出)。在该系列的实验中，自H2d单倍体型的鼠白血病细胞所分离到的L1210淋巴细胞以及TS/A细胞制得的肿瘤细胞胞外体皆被观察到具抗肿瘤作用，此显示在这三种肿瘤间亦存在共同的表位(二肿瘤P815及TS/A共有已突变的p53)。
肿瘤细胞胞外体的抗肿瘤作用或可用下述二机制解释。
第一，肿瘤细胞胞外体一旦被注射可能会直接活化宿主的肿瘤-特异性T淋巴细胞。以此方式，肿瘤-特异性T淋巴细胞群落的扩增或T细胞的“致敏”可能发生。第二个假设涉及被注射的肿瘤细胞胞外体与宿主的树状细胞交互作用。然后可能刺激抗肿瘤反应。为了测试该第二种假设，对于经由静脉注射了衍生自骨髓且带有来自肿瘤细胞的胞外体的树状细胞的小鼠，监测肿瘤的生长。因此将DBA/2小鼠(法国奥尔良的IFFA CREDO)注射2倍于最低致肿瘤剂量(50×105)的P815肥大细胞瘤细胞。10天后，对每只小鼠注射5×105带有9μg肿瘤细胞胞外体并被致敏了的树状细胞。在这些条件下肿瘤的平均尺寸，与注射PBS或注射带有对照肿瘤MC38细胞的肿瘤细胞胞外体的鼠群中的肿瘤相较，显著减小。事实上，于实验结束时，被治疗的动物中超过60％不再具有肿瘤。再者，长时期内未观察到复发(80％至100％的病例)。令人感兴趣的是经由皮内注射低于最佳剂量的肿瘤细胞胞外体时没有作用，此暗示所用的树状细胞比真皮的树状细胞或朗格汉斯细胞更能有效地制备含有肿瘤抗原的树状细胞胞外体。使用乳房肿瘤TS/A细胞的模型时亦得到相似结果。
在本发明范围内得到的结果显示肿瘤细胞胞外体能有效使树状细胞敏感化。如此敏感化的细胞对于不同肿瘤的病例，有能力在活体中诱生强烈的抗肿瘤反应。这些结果暗示在活体内直接接种肿瘤细胞胞外体后所观察到的抗肿瘤作用是由于使宿主的树状细胞敏感化。单次注射被敏感化的树状细胞后显然可以观察到抗肿瘤作用。大部分被治疗的小鼠显示完全的肿瘤缓解或由于肿瘤缓解所造成的生命延长(60日相对于对照群的20日)。
本发明的呈递细胞的敏感化方法与现有技术的方法相较具有下列优点i)其无需事先知道肿瘤抗原，既然在大部分的肿瘤中肿瘤抗原皆是未知，因而此点特别重要；ii)本发明的方法可被应用于任何会产生肿瘤细胞胞外体的肿瘤；至目前为止，超过15种的肿瘤细胞系被测试，只有一种不产生肿瘤细胞胞外体(被测试的6个黑色素瘤细胞系之一)；iii)该方法不依赖病人及肿瘤细胞的MHC单倍体型，因为肿瘤细胞胞外体中存在的肿瘤抗原通过病人的抗原呈递细胞的MHC分子而被再制备及向T淋巴细胞呈递；iv)本发明的方法原则上在不同来源的肿瘤间有效，因为不仅特定类型的肿瘤间存在共同的肿瘤抗原(例如黑色素瘤中的MART-A)，而且对于完全不同的肿瘤间亦存在共同的抗原(如涉及肿瘤生成的分子，例如p53)；v)肿瘤细胞胞外体的使用亦被证明在治疗表达低浓度的MHC的第I类分子或完全不表达这些分子的肿瘤(这些肿瘤代表40％至50％的人类转移性癌症)上有效。事实上，肿瘤细胞胞外体允许完整的抗原在肿瘤细胞与树状细胞间传递，这些抗原然后被树状细胞的MHC分子向T淋巴细胞呈递。初步的结果显示肿瘤细胞胞外体诱导产生对表达低浓度的MHC的第I类分子的鼠肿瘤(如MCA101，S.Rosenberg，NCI，Bethesda，U.S.A.)的排斥。这一现象可能由于诱生有效免疫反应所需的MHC分子的表达水平远比效应期(产生细胞毒性)间所需的表达水平要高；vi)肿瘤细胞胞外体本身，由于它具有致免疫的效力，可以单独构成预防性或治疗性疫苗接种的新颖、有效方法。
7.树状细胞制造免疫原性膜囊泡(树状细胞胞外体)本实施例证明树状细胞产生膜囊泡以及这些囊泡为强有力的致免疫囊泡，可供抗肿瘤免疫接种使用。这些囊泡特别有利，因为其可免除在活体中注射全部树状细胞的步骤。
树状细胞疗法既无法确保被注射细胞的表型稳定，亦无法确保所用细胞组合物为均匀的。但通过施用这些细胞所分泌的稳定产物，即上述膜囊泡，可以确保给予带有肿瘤的宿主以免疫效力。
在本实施例中，将用GM-CSF+IL-4处理5日的骨髓(Mayordomo等人，1995)所衍生的树状细胞与肿瘤细胞的胞外体一起培育3小时。然后将如此敏感化的细胞在酸性培养基中培养18小时(以刺激囊泡的制造)，然后按照实施例1所述的方法观察及收获囊泡。为了决定这些囊泡的免疫原效价，将其在活体中与对MART-1抗原具特异性的细胞毒性T淋巴细胞一起培育。被示于图9的结果显示0.6μg这些被称为Dex Tex FON的膜囊泡(即由与衍生自FON肿瘤细胞的胞外体一起培育的树状细胞所衍生的树状细胞胞外体)，可以直接刺激对MART-1具特异性的LT8克隆增殖及分泌IFNγ；这是0.6μg源自树状细胞的树状细胞胞外体与NUN肿瘤细胞的胞外体一起培育所得的DexTexNUN(NUN为肾肿瘤，HLA-A2阴性，MART-1阴性)所无法达到的结果。这些结果因此证明树状细胞产生膜囊泡以及这些膜囊泡为强效的免疫原。
此外，图9C展示的结果出乎人们意料之外地显示树状细胞胞外体的制造对树状细胞而言为一可调节的现象，其于某些细胞因子诸如IFNγ及IL-10存在下可被刺激。因此，所展示的结果显示IFN-或IL-10显著地增加树状细胞的制造(约5倍)。相当的结果在使用IL-12时亦被观察到。
8.确定树状细胞产生的膜囊泡的特征树状细胞产生膜囊泡的能力首先在产自人类单核细胞前体的树状细胞及鼠D1树状细胞系中被证实。
D1细胞系及这些细胞系的成熟条件曾被Winzler等人描述(J.Exp.Med.185(1997)317)。
衍生自人类单核细胞前体的树状细胞得自单核化细胞的粘附部分，所述单核化细胞采自健康个体，在含有L-Glu、抗生素、1000IU/ml的rhGM-CSF及rhIL-4(美国新泽西州肯尼尔沃斯市Schering Plough公司)的AIMV培养基中培育7-8日。培养8日后，微弱粘附的细胞及在悬浮液中的细胞显示树状细胞的形态，表达高浓度的MHC分子I及II以及CD40及CD86。这些细胞的主要部分对CD1a及CD11b为阳性以及对CD2、CD3、CD14、CD19及CD83为阴性。
这些细胞的显微镜检分析显示存在富含MHC分子I及II的膜囊泡。这些囊泡通过离心分离及通过免疫电子显微镜检分析。更具体而言，收获树状细胞的上清液，于300g离心20分钟，然后在10,000g及4℃离心30分钟，以去除细胞及细胞残渣。然后树状细胞胞外体通过于100,000g及4℃离心1小时而分离出来，继而用PBS在相同条件下冲洗(于100,000g及4℃离心1小时)。在树状细胞胞外体制剂中的蛋白质浓度通过布莱德福德(Bradford)法(BioRad蛋白质测定{BioRad})测量。
所得的结果(图10)显示为均质的囊泡群，它们的直径在约60及90nm之间。再者，超过95％的树状细胞胞外体被抗-CD63、抗-CD82、抗-MHC-I及抗-MHC II的抗体标记。
这些结果证明树状细胞产生显示抗原-呈递分子及淋巴共同刺激分子的膜囊泡。
9.树状细胞呈递在限制性MHC-1环境内的抗原树状细胞胞外体的有利特征之一在于存在MHC的第I类分子。这些分子事实上为产生有效的细胞反应，尤其是CTL细胞的活化及扩增所必需。因此测试树状细胞胞外体刺激CD8+淋巴细胞的能力以及所得淋巴细胞的特性。
为进行此测试，首先将得自人类单核细胞前体(HLA-A2个体)的树状细胞通过“肽脉冲”而使之对特殊的抗原敏感化。为达到此目的，将细胞(2×106/ml)或于存在10μg/ml的抗原MART-1/MelanA(27-35)，或于存在10μg/ml的肽gpl00(280-288)(对照)下，在柠檬酸悬浮液(pH3.7)中培育3至12小时。在该敏感化步骤后，将树状细胞胞外体按照实施例1所述分离。然后将LTl2克隆的细胞(限制性CTL克隆HLA-A2，对MART-1(27-35)具特异性)与递增剂量的树状细胞胞外体或肽gpl00(对照)在96孔板中培育5日(100,000 CTL/孔)。细胞所分泌的γ-干扰素量通过ELISA(Genzyme)测量。
如图11所示，携带MART-1的肿瘤细胞胞外体能以剂量-依赖的方式通过克隆LTl2刺激γ-干扰素的制造。另一方面，用对照肽gp100脉冲的树状细胞所产生的树状细胞胞外体对于该克隆无刺激作用。
这些结果确认本发明的树状细胞胞外体所表达MHC-I分子是有功能的。
10.树状细胞胞外体在活体中抑制肿瘤的生长该实施例证明本发明的树状细胞胞外体在活体中诱生免疫反应的能力，特别是诱生肿瘤-特异性细胞的增殖。从骨髓得到的树状细胞带有含不同肿瘤抗原肽的酸性肿瘤洗脱物。树状细胞的制备及敏感化技术已被Zitvogel等人(1996)说明。图12显示由这些树状细胞产生的树状细胞胞外体所表达的标记。如前文所示，该图显示存在丰富的MHC的第I及第II类分子以及标记CD86及运铁蛋白受体。另一方面，标记H2-M、li及钙联接蛋白虽然出现在细胞的溶胞产物中，但在胞外体制剂中则无法检测到。
选择二实验肿瘤模型以测试本发明的树状细胞胞外体在活体中的抗肿瘤性质。第一个模型-P815，为与DBA/2(H2d)同系的进行性肥大细胞瘤，对于被移植生长10日的此型肿瘤，仅有极少数的免疫疗法被报告有效。TS/A模型为弱免疫原性的自发乳房癌，其表达较低水平的MHC的第I类分子，与BALB/c(H2d)同系。将肿瘤P815或TS/A通过酸性处理洗脱出的肿瘤肽载至如前述衍生自骨髓的同系树状细胞上。然后从这些树状细胞上清液制备树状细胞胞外体及将其用于活体免疫。
小鼠和肿瘤细胞系6至8周龄的DBA/2J(H2d)及BALB/c(H2d)雌鼠自法国里昂IffaCredo实验室购得以及于无热原条件下饲养。裸鼠在被保护的人造小环境中饲养。P815细胞由T.Boon(比利时Ludwig学院)提供。TS/A模型由Guido Forni(意大利土林的免疫原及组织相容性中心)提供。所有肿瘤细胞系皆被贮存于RPMI 1640培养基中，该培养基尚补充有无内毒素的10％胎牛血清(Gibco BRL)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素、必需氨基酸基及焦葡萄酸盐。该培养基在下文中被称为CM培养基。
方法及结果将2倍最低致肿瘤剂量的肿瘤细胞(5×105P815，105TS/A)分别经由皮内接种于DBA/2及BALB/c小鼠的右胁腹的上部区域内。带有被移植生长3至4日的TS/A肿瘤之动物以或被移植生长6至10日的P815肿瘤的动物，然后通过在相同胁腹部的下部区域单次皮内注射3至5μg的树状细胞胞外体而被免疫。以相同方式对具免疫力动物及裸鼠进行这些步骤。对各鼠进行单次治疗注射。每星期检查肿瘤的尺寸二次，当其携带的肿瘤产生溃疡或太大时将小鼠处死。各系列的实验进行2或3次，对各个治疗使用由5只鼠组成的鼠群。所得结果被展示于图13。如图13B所示，被移植生长10日之P815肿瘤(具有50至90mm2)的治疗通过对每只鼠单次经皮内给予3至5μg的树状细胞胞外体而达成。一星期之内，在接受了衍生自树状细胞且带有自体肿瘤肽的树状细胞胞外体的鼠群中肿瘤生长停止，以及在40至60％的小鼠中肿瘤于60日时全部消失。
再者，这些动物显示持续的免疫反应以及排斥另外注射的P815(对于未经治疗的小鼠其通常会致死)。另一方面，这些小鼠对于同系白血病克隆L1210没有抵抗作用，此显示所得到的作用显然具免疫特异性。最后，用对照树状细胞胞外体(带有鼠脾脏的肽)免疫的鼠群，与未经治疗的鼠一样，未显示抗肿瘤作用。所以这些结果显示依照本发明带有肿瘤肽的树状细胞胞外体在活体中能诱使肿瘤缓解。
使用包含已被移植生长3/4日的肿瘤的TS/A肿瘤模型得到相似的抗肿瘤作用。在该系列的实验中，所有小鼠显示肿瘤生长被统计学上有意义地延迟，因而存活时间延长(图14)。如图14B所示，该抗肿瘤作用在Nu/Nu无胸腺鼠中未被观察到，此显示T细胞的存在对于本发明的树状细胞胞外体的抗肿瘤作用的表达为必需。
再者，接下来的实验显示树状细胞胞外体在具有肿瘤P815的动物中能直接刺激特异性CTL反应。将用树状细胞胞外体免疫后而排斥P815肿瘤的鼠的脾脏细胞于第90日时收获，并于表达抗原B7.1的经照射的P815细胞存在下培养5日，以增加特异性前体的频率。这些效应子细胞以铬-释出测定法测试其对抗(i)自体P815(H2d)肿瘤细胞；(ii)不相关的L1210细胞及(iii)YAC细胞的作用。在用树状细胞胞外体免疫的小鼠的脾脏细胞中观察到显著的对抗P815细胞的特异性细胞溶解活性(图15)。令人感到有趣的是，自发排斥肿瘤P815或呈递P815肿瘤的鼠的脾脏在相同条件下均没有显示该细胞溶解活性。这些结果显示单次注射由用抗原或对应抗原的肽敏感化的树状细胞所衍生的本发明树状细胞胞外体在活体中能有效激发特异性CTL抗-肿瘤反应。
为了测定树状细胞胞外体所诱生的免疫反应及抗-肿瘤反应是否受限于MHC而非仅由于肿瘤肽的直接作用，使衍生自H2d(DBA/2)或H2b(C57BL/6)鼠的树状细胞以相同方式带有自肿瘤P815洗脱出的肿瘤肽。这些树状细胞产生的树状细胞胞外体然后被分离及分别用于直接皮内注射入带有被移植生长至6/10日的P815肿瘤的DBA/2鼠中。
如图13B所示，只有携带同系肿瘤肽的树状细胞胞外体为有效的抗-肿瘤疫苗(诱导在60％的小鼠中肿瘤消失)，而异源树状细胞产生的树状细胞胞外体实际上未诱生抗-肿瘤作用。这些结果显示依照本发明的树状细胞胞外体在活体中可诱生受限于MHC的抗-肿瘤反应。
通过静脉而非皮内注射进行与前述者相似的实验。得到的结果被展示于图16中。它们首先显示静脉注射树状细胞胞外体后肿瘤缓解。再者，这些结果显示树状细胞胞外体在根除活体内肿瘤上比衍生其的树状细胞更有效。这些结果因而证明树状细胞胞外体具有显著且在意料之外的性质。
上述结果因此显示鼠或人类未成熟树状细胞分泌树状细胞胞外体，这些树状细胞胞外体不仅呈递MHC的第II类分子，亦呈递MHC的第I类分子及共同刺激分子，以及这些树状细胞胞外体具免疫原性且在活体中会诱使肿瘤缓解。
这些树状细胞胞外体可自树状细胞培养基(于存在GM-CSF+IL-4下衍生自骨髓的树状细胞，D1树状细胞系或从外周血液的单核化细胞分离得的人类单核细胞前体衍生的树状细胞)以相当高量(依据布莱德福德试验，1μg/100万个树状细胞/18小时)得到。树状细胞胞外体的特征通过生化学或形态学的方法确定。膜囊泡的免疫-电子显微镜检分析显示其为直径为约60至90nm的均质囊泡群。该树状细胞胞外体制剂显然不含反转录病毒、浆膜、线粒体成分或编程性细胞死亡体(apoptotic bodies)。这些树状细胞胞外体与浆膜相较，丰富地过度表达MHC的第I类及第II类分子、CD63及CD86。通过使用抗-钙联接蛋白抗体进行的蛋白质印迹检测树状细胞胞外体，未发现衍生自内质网的成分。编程性细胞死亡在这些使用不同条件的培养物中未被证实。令人感到兴趣的是，这些囊泡的制造显然为一种可调节的现象。如布莱德福德试验、蛋白质印迹及免疫-电子显微镜检所测定的，囊泡的数量似乎会通过诱生树状细胞的成熟而减少。再者，这些囊泡的分泌量可通过降低培养基的pH值或通过于存在某些细胞因子下培育细胞，甚至通过树状细胞接受照射处理而显著地增进。鉴于未成熟树状细胞通常被认为具有低效价的抗原呈递以致具有低免疫原活性，该现象特别出乎人的意料之外。结果显示在该阶段的未成熟树状细胞具有效制造树状细胞胞外体的性质。最后结果显示这些树状细胞胞外体在活体中及活体外引发有效的T细胞激发反应，它们在活体中亦能诱生肿瘤缓解。因此，这些囊泡确为使用非细胞系统的免疫治疗途径的特别有吸引力的候选剂。
11.通过液相电泳的胞外体纯化本实施例说明以液相电泳为基础的本发明胞外体纯化法的使用。
液相电泳法为生物物质依照其电荷分离的制备用方法。该方法曾通过等电聚焦而被用于分离蛋白质。该方法可能具有下列优点—其为一种允许连续注射物质以致能纯化大量囊泡的制备性方法，—该方法可以一或二个步骤纯化树状细胞胞外体且免去离心步骤。
为了测定该法是否能应用于胞外体的纯化，我们进行下列实验将借助于差速离心自鼠树状细胞的上清液分离得的树状细胞胞外体制剂，于Amigorena等人所述的一般条件(Nature，369(1994)，113)下注射入液相电泳中。收集40份并通过布莱德福德试验(BioRad)测定这些份中每一份的蛋白质浓度，以检测树状细胞胞外体的存在。如图17所示，90％树状细胞胞外体被发现集中在4个LPE份中。依照该技术树状细胞胞外体以狭窄峰移行，此证明电泳在做为树状细胞胞外体的分离方法上具实用性。参考文献Amigorena S.，Drake，J.R.，Webster，P.and Mellman，I.(1994)，在淋巴细胞的新颖胞内隔室中新颖的第II类分子的暂时蓄积(见评论)，自然，(Nature)，369，113-120。
Boczkowski，D.，Nair，S.K.，Snyder，D.and Gilboa，E.(1996)用RNA脉冲的树状细胞在活体外及活体内为强效的抗原呈递细胞，实验医药杂志(Journal of Experimental Medicine)184，465-72。
Boon，T.(1992).肿瘤排斥抗原的基因分析，癌症研究进展(Advances in Cancer Research)58，177-210。
Espevik，T.& Nissen-Meyer，J.(1986)免疫方法(J.Immunol.Methods)9599-103。
Felder，S.，Miller，K.，Moehren，G.，Ullrich，A.，Schlessinger，J.andHopkins，C.R.(1990).激酶活性控制多囊泡体内表皮生长因子受体的选择，细胞(Cell)61，623-634。
Mayordomo，J.I.，Zorina，T.，Storkus，W.J.，Zitvogel，L.Celluzzi，C.，Falo，L.D.，Melief，C.J.，Ildstad，S.T.，Kast，W.M.，Deleo，A.B.等(1995)。用合成肿瘤肽脉冲的衍生自骨髓的树状细胞激起保护性及治疗性抗肿瘤免疫力，天然药物(Nature Medicine)1，1297-1302。
Nabel，G.J.，Gordon，D.，Bishop，D.K.，Nicholoff，B.J.，Yang，Z.Y.，Avuga，A.，Cameron，M.J.，Nabel，E.G.，Chang，A.E.(1996)，用DNA-脂质体复合物转移同种异体第I类主要组织相容性复合物基因后在人类黑色素瘤中的免疫反应，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 9315388-15393。
Pardoll，D.M.(1995)，在癌症免疫疗法中的海百合细胞因子佐剂，Annual Review of Immunology 13，399-415。
Raposo，G.，Nijman，H.W.，Stoorvogel，W.，Leijendekker，R.，Harding，C.V.，Melief，C.J.M.and Geuze，H.J.(1996)，B淋巴细胞分泌呈递抗原囊泡，J.Exp.Med.183.1161-1172。
Rosenberg，S.A.，Kawakami，Y.，Robbins，P.F.and Wang，R.(1996)，编码癌抗原的基因的鉴定供癌症的免疫治疗，癌症研究进展(Advances in Cancer Research)70，145-77。
Traversasi，C.，Van Der Bruggen，P.，Leuscher，I.F.，Lurguin，C，Chamez，P.，Van Del，A.，De Places，E.，Amar-Costesec，A.and Boon，T.(1992)，被人类基因MART-1编码的九肽在HLA-A1上被对抗肿瘤抗原MZ2-E的细胞毒性T淋巴识别，J.Exp.Med.1761453-1457。
Walker，S.A.等(1997)，自然，(Nature)，第387卷，第61页etseq。
Zitvogel，L.，Robbins，P.D.，Storkus，W.J.，Clarke，M.R.，Maeurer，M.J.，Campbell，R.L.，Davis，C.G.，Tahara，H.，Schreiber，R.D.and Loze，M.T.(1996)，白细胞介素-12及B7.1共同刺激分子合作诱生有效的抗肿瘤免疫力及治疗被移植生长的肿瘤，欧洲免疫学杂志(EuropeanJournal of Immunology)26，1335-41(a)。
Zitvogel，L.，Mayordomo，J.I.，Tjandrawan，T.，Deleo，A.B.，Clarke，M.R.，Lotze，M.T.and Storkus，W.J.(1996)，用被肿瘤肽脉冲的树状细胞治疗鼠肿瘤依赖T细胞、B7共同刺激分子及与T帮助者细胞1-相关的细胞因子(见评论)，实验医药杂志(Journal of ExperimentalMedicine)183，87-97(b)。
权利要求
1.一种衍生自肿瘤细胞的囊泡，其特征为—其自天然环境中游离出来，以及—其由环绕胞质部分的脂质双层构成。
2.根据权利要求1所述的囊泡，其特征为在其表面上呈递有主要组织相容性复合体(MHC)的第I类和/或第II类分子。
3.根据权利要求1或2所述的囊泡，其特征为在表面上还呈递有粘附分子和/或淋巴共同刺激分子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的囊泡，其特征为在其表面上还呈递有可选择性地与MHC的第I类和/或第II类分子缔合的抗原肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的囊泡，其特征为在其胞质部分含有肿瘤抗原分子和/或免疫调节剂和/或化学-吸引剂和/或激素和/或核酸。
6.一种衍生自肿瘤细胞的囊泡，其特征为其具有在60与90nm之间的直径，在其表面呈递有具肿瘤特征的且与主要组织相容性复合体(MHC)的第I类和/或第II类分子结合的抗原肽，以及在其表面呈递有淋巴共同刺激分子。
7.根据权利要求6所述的囊泡，其特征为含有蛋白质HSP70。
8.根据权利要求6或7所述的囊泡，其特征为缺乏蛋白质gp96。
9.根据前述任一项权利要求所述的囊泡，其特征为还含有异源核酸。
10.一种制备权利要求1至9中任一项所述的囊泡(肿瘤细胞胞外体)的方法，包括提供生物样本的第一步骤以及涉及将肿瘤细胞胞外体自该样本分离出的第二步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征为生物样本由膜部分、培养上清液或肿瘤细胞溶胞产物或甚至新鲜肿瘤悬浮液组成。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征为将生物样本用一种或多种会刺激肿瘤细胞胞外体产生的试剂处理。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征为分离通过离心、电泳、层析和/或毫微过滤而进行。
14.一种抗原呈递细胞，其带有权利要求1至9中任一项所述的囊泡(肿瘤细胞胞外体)。
15.一种制备权利要求14所述的抗原呈递细胞的方法，其包括下列步骤于一种或多种如权利要求1至7中任一项的肿瘤细胞胞外体存在下培育抗原呈递细胞，以及回收如此得到的上述带有囊泡的抗原呈递细胞。
16.一种膜囊泡，其通过带有权利要求1至9中任一项所述的囊泡的抗原呈递细胞的分泌，而自其天然环境中游离出。
17.一种被称为树状细胞胞外体的膜囊泡，其特征为其衍生自树状细胞，以及包含一种或多种的主要组织相容性复合体(MHC)的第I类分子，及一种或多种的主要组织相容性复合体(MHC)的第II类分子。
18.根据权利要求17所述的囊泡，其特征为还包含一种或多种CD63分子。
19.根据权利要求17或18所述的囊泡，其特征为还包含一种或多种CD82分子和/或CD86分子，以至少包含CD86为较佳。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的囊泡，其特征为其直径在60nm与90nm之间。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的囊泡，其特征为还包含一种或多种抗原肽。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的囊泡，其特征为其衍生自未成熟的树状细胞。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的囊泡，其特征为其衍生自带有一种或多种抗原肽的树状细胞。
24.根据权利要求23所述的囊泡，其特征为其衍生自与权利要求1所述的囊泡一起培育的树状细胞。
25.根据权利要求23所述的囊泡，其特征为其衍生自无限增殖化的树状细胞。
26.一种制备权利要求17至25中任一项所述的囊泡的方法，包括分离树状细胞或含树状细胞的细胞培养物的第一步骤，使该细胞对目的抗原敏感化的第二步骤(非必需)，以及自这些细胞培养物制造囊泡的第三步骤。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征为第一步骤包含自单核细胞前体或骨髓中分离树状细胞。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征为第一步骤包含未成熟树状细胞(优选人的)的分离。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其特征为敏感化步骤通过使树状细胞与肽、抗原、表达抗原或抗原肽的细胞或膜或囊泡、脂质体或核酸接触而完成，所述核酸可被选择性地掺入化学或病毒载体中。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其特征为囊泡制备步骤包括涉及对细胞处理的可选择的第一步骤，以及接下来涉及囊泡的分离的第二步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征为通过在有利于未成熟状态的细胞因子存在下培养、照射或降低培养物的pH值，或者这些不同类型处理的组合而对树状细胞进行处理。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征为囊泡的分离按照权利要求13的方法实现。
33.一种衍生自细胞的膜囊泡的制备方法，其包括至少一个通过电泳、层析或毫微过滤的分离步骤。
34.根据权利要求1至9中任一项的肿瘤细胞胞外体或者根据权利要求14中所述的抗原呈递细胞或者根据权利要求16至25中任一项所述的树状细胞胞外体的用途，其被用于在活体外刺激及可选择地扩增T淋巴细胞，该T淋巴细胞对上述肿瘤细胞胞外体、抗原呈递细胞或树状细胞胞外体所含的抗原具特异性，其尤其可用于在活体外刺激及扩增T淋巴细胞。
35.根据权利要求1至9中任一项的肿瘤细胞胞外体或者根据权利要求14中所述的抗原呈递细胞或者根据权利要求16至25中任一项所述的树状细胞胞外体的用途，其被用于在活体外选择能识别上述肿瘤细胞胞外体、抗原呈递细胞或树状细胞胞外体所含的特异性抗原的T淋巴细胞。
36.一种药剂，其含有一种或多种如权利要求1至9中任一项所述的肿瘤细胞胞外体或者权利要求14所述的抗原呈递细胞或者权利要求16至25中任一项所述的树状细胞胞外体作为活性物质，以及可药用的载体。
37.根据权利要求36项所述的药剂，其被用于治疗癌症、寄生性及感染性疾病。
38.根据权利要求35或36所述的药剂，其特征为还含有稳定剂。
39.一种肿瘤细胞胞外体和/或树状细胞胞外体及免疫刺激佐剂的组合，其同时、分开或各相隔一段时间使用。
40.权利要求16至25中任一项所述的树状细胞胞外体的用途，其用于制备被设计用来治疗癌症、寄生性及感染性疾病的药剂。
41.一种γ-干扰素、白细胞介素10和/或白细胞介素12在制造树状细胞胞外体中的用途。
全文摘要
本发明的目的是提供一种使抗原呈递细细胞敏感化的新方法,实施该方法的新颖方式以及具有免疫原特性的新颖膜囊泡。本发明具体涉及肿瘤细胞胞外体(texosomes,衍生自肿瘤细胞的囊泡)及树状细胞胞外体(dexosomes,衍生自带有或未带有抗原的树状细胞的囊泡)及其在活体外或活体中引导及呈递抗原的用途,以及用于治疗癌症及感染性、寄生性或自体免疫性疾病的方法或组合物。
文档编号A61K35/14GK1265038SQ9880720
公开日2000年8月30日 申请日期1998年7月3日 优先权日1997年7月16日
发明者劳伦斯·齐沃格尔, 格拉萨·拉波索, 阿梅利·勒尼奥, 塞巴斯蒂昂·阿米戈雷纳 申请人:法国国家卫生及研究医学协会, 法国古士塔柏罗斯学院, 法国国家科学研究中心, 法国居里学院