专利名称：受体选择性增强的睫状神经营养因子变体及其选择方法
背景技术：
本发明涉及神经元受体选择性增强的CNTF变体，该变体可用于治疗神经病或其它疾病或障碍。
睫状神经营养因子(CNTF)是23-KDa的神经-细胞因子，自胚胎后期开始，外周和中枢神经系统中都表达CNTF(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。起初鉴定出CNTF促进鸡胚副交感神经元体外存活的能力，后来又证明CNTF对包括运动神经元，感觉神经元，交感神经元，海马神经元和少突神经胶质细胞的多种神经元和神经胶质细胞产生强有力的生长促进和/或分化作用(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。体内施用CNTF可防止发育过程中小鸡脊运动神经元退化，轴突切开术大鼠面运动神经元退化，和患进行性运动神经元病的突变小鼠的运动神经元退化。CNTF的神经保护性作用使其成为治疗人运动神经元疾病和或许其它神经退化性疾病的候选药物(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。
除了对神经元的作用以外，CNTF也对如胶质(Hughes等，1988；Louis等，1993)，肝细胞(Schooltnik等，1992)，骨骼肌细胞(Helgren等，1994)，胚胎干细胞(Conover等，1993)，骨髓基质细胞(Gimble等，1994)和肿瘤浆细胞(Zhang等，1994)等非神经元细胞产生生物学作用。
CNTF蛋白质之治疗用途的相关问题的一个起因可能是CNTF的功能多向性。CNTF体内半衰期短(Davies等，1994)，需要以高剂量给药才能在靶组织中达到药理学有用的浓度。高剂量的CNTF产生副作用，如体重减轻和急性期反应(Dittrich等，1995)。因此，需要能模拟CNTF的神经营养作用而不会产生CNTF的所有或部分副作用的药物。
CNTF通过结合，连续装配和激活多亚单位受体复合物来行使其生物学作用，所述复合物由配体-特异性的a-受体(CNTFR)和信号转导亚单位gp130和白血病抑制因子受体-b(LIFR)组成(Ip和Yancopoulos1996)。CNTF与CNTFR的结合引发了随后的gp130和LIFR的结合和异二聚体化，导致由Jak族蛋白质酪氨酸激酶和STAT转录激活物介导的信号级联放大系统激活。与介导gp130同二聚体化的IL-6 a-受体gp80类似，CNTFR可以膜结合的形式或可溶性形式起作用(Ip和Yancopoulos 1996)。CNTFR的膜结合形式(m-CNTFR)经糖基磷脂酰肌醇键锚着于细胞表面，它主要表达于神经元和骨骼肌细胞(Davies等，1991；Ip等，1993)。CNTFR的可溶性形式(s-CNTFR)可由磷脂酶C介导的m-CNTFR裂解产生，它可用作加强CNTF对表达gp130和LIFR之细胞的作用的辅因子(Davies等，1993)。在脑脊髓液和血清中检测到可溶性的CNTFR(Helgren等，1994；Davis等，1993)，这表明它可能参与介导CNTF的一些非神经元作用，如急性期反应(Dittrich等，1994)。
由于CNTF的神经元作用需要m-CNTFR，而据认为s-CNTFR介导了非神经元作用，对m-CNTFR的选择性增强的经修饰CNTF蛋白有望产生更具神经元特异性的药理学活性谱。发明描述本发明涉及CNTF变体，该变体因本发明特定氨基酸取代的作用，其结合CNTFR的能力比天然CNTF低，由可溶性CNTFR介导的生物活性降低，由膜结合的CNTFR介导的生物活性保持不变。
这些变体基于治疗人和动物神经元病和障碍的方法。在一个实施方案中，在人肝细胞瘤细胞+可溶性CNTFR和稳定表达CNTFR的人肝细胞瘤细胞之间比较了CNTF变体的生物活性，这提供了评估膜结合受体选择性的方法。
在优选的实施方案中，通过用异亮氨酸取代hCNTF(SEQ ID NO1)第169位的氨基酸苏氨酸，用丙氨酸取代第174位氨基酸组氨酸可得到本发明的变体(下文将该变体称为Thr169Ile/His174Ala/hCNTF；IA-CNTF，或SEQ ID NO2)。此变体的特征在于结合可溶性CNTFR的能力降低。
在可溶性CNTFR的存在下，在人肝细胞瘤细胞中测定经修饰的hCNTF刺激急性期蛋白质触珠蛋白产生的能力。如下文所述，相对于野生型CNTF而言，经修饰的CNTF表现出效力降低。
在另一个实施方案中，测定了经修饰的人CNTF蛋白刺激人成神经细胞瘤细胞系中产生胆碱乙酰基转移酶的能力。如下文所述，在此试验中，经修饰的CNTF表现出与野生型CNTF蛋白相同的效力。
在优选的实施方案中，将不能表达CNTFR的人肝细胞瘤细胞改造为能表达全长的人CNTFR，使用这些细胞测定经修饰的CNTF蛋白刺激触珠蛋白产生的能力。将此试验中的生物活性与存在可溶性CNTFR时在亲代肝细胞瘤细胞中测定的生物活性相比较。此方法可测定膜结合CNTFR对可溶性CNTFR选择性激活生物反应的能力。如本文所述，在此试验中，经修饰的CNTF蛋白与野生型人CNTF具有相同的效力，这表明经修饰的CNTF通过膜结合的CNTFR维持高生物活性，而通过可溶性CNTFR显示出特异性降低的活性。如本文所述，在表达CNTFR的肝细胞瘤细胞中，以前显示出具有增强的神经元受体选择性的CNTF变体(意大利专利申请RM96A000492)(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His/人CNTF或AKDH-CNTF；其氨基酸152至167含有意大利专利申请RM96A000492中的SEQ ID NO3所示序列的人CNTF变体)也与野生型CNTF效力相同。这些结果表明可使用此检测系统来鉴定CNTF变体，所述变体通过可溶性的和膜结合的CNTFR表现出不同的生物活性。
配体保留假说(Baumann等，1994)为具有膜结合和可溶性受体同工型之细胞因子变体的药理学表现提供了似乎最合理的解释。Baumann及其同事(见Baumann等，1994)计算出细胞表面的细胞因子受体浓度为微摩尔范围(远大于细胞因子-受体平衡解离常数)，并提出这可导致几乎单向性的配体捕获。细胞因子受体的高膜浓度可解释受体结合亲和性有所改变的细胞因子变体为何仍通过膜结合受体显示出未经改变的激动剂效力。因此，CNTF及其CNTFR亲和性有所改变的变体在神经元细胞中效力相同可能是因为m-CNTFR准-不可逆的配体捕获所致，这类似于在饱和浓度的s-CNTFR的存在下，非神经元细胞中的状况(意大利专利申请RM96A000492)。
因此，根据本发明，人CNTF野生型蛋白质中的某些氨基酸取代会导致膜结合(神经元)对可溶性(非神经元)CNTFR的选择性增加的经修饰人CNTF蛋白，因此，有望具有增强的治疗特性。
通过在原核和真核系统中克隆和表达，可制备用于本发明实践的CNTF修饰分子。可用允许稳定的生物活性蛋白质进一步形成的任何方法表达和纯化所得的重组基因。
本发明的目的如下睫状神经营养因子(CNTF)变体和人CNTF变体，其中第169位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代，第174位的组氨酸残基被丙氨酸残基取代，这些变体对(膜)受体的选择性增强。含有权利要求1或2所述的CNTF变体和药物可接受的载体的药物组合物。
根据本发明，按本文所述产生的经修饰的CNTF分子，或其杂合体或突变体可用于在体外或体内促进对CNTF反应之细胞的分化，增殖或存活。本发明也可用于治疗对CNTF反应之任何细胞的病理学，在优选的实施方案中，可治疗表达膜结合的CNTF受体之神经元细胞的病理学。
评估CNTF变体对膜结合受体增强的选择性的方法是通过膜结合的CNTF受体或可溶性的CNTF受体诱导生物反应。通过上述方法选择的CNTF变体。编码CNTF变体的分离的和纯化的DNA分子。含有上述DNA的DNA重组分子，上述DNA与在所述重组DNA中控制表达的序列功能性结合。被重组DNA转化的单细胞宿主，单细胞宿主可选自细菌，酵母，真菌和动物和植物细胞。上述变体用于制备治疗神经疾病或障碍之药物的用途。这些神经疾病或障碍包括如视网膜病理学的退化病理学，涉及脊髓，胆碱能神经元，海马神经元的疾病或病理学，或涉及运动神经元的疾病或病理学。
本发明的变体也可用于治疗由神经系统损害引起的，由创伤，外科手术，心脏病发作，感染和恶性肿瘤，或暴露于毒性剂导致的疾病或病理学。上述变体与其它蛋白质或其它分子的缀合物。上述变体与针对允许变体穿过血脑屏障的转移受体之抗体的缀合物。上述变体与降低所述变体之免疫原性的聚乙二醇的缀合物。
图1显示出CNTF和IA-CNTF与CNTFR的结合。在缺乏(对照)或存在CNTF(()，或IA-CNTF(()时测定生物素化的人CNTF与固定化的CNTFR的结合。结果被表示为对照结合的百分比，并描述了重复试验测定结果的平均值±偏差。数据得自重复3次类似结果的代表性实验。
图2显示出HepG2细胞中由s-CNTFR介导的生物活性。在80ng/mls-CNTFR和CNTF(()或IA-CNTF(()的存在下测定对HepG2细胞中触珠蛋白产生的刺激。结果被表示为最大CNTF-诱导反应的百分比。每个点是至少2个独立实验的平均值±s.e.m。
图3显示出IMR-32细胞中由m-CNTFR-介导的生物活性。测定IMR-32细胞中由CNTF(()或IA-CNTF(()诱导的胆碱乙酰转移酶(Chat)活性。结果被表示为最大CNTF-诱导反应的百分比。每个点是重复实验培养皿的平均值±s.e.m。
图4显示出HepG2细胞中由CNTF+s-CNTFR联合介导的早期信号传递反应和HepG2/CNTFR细胞中由CNTF介导的早期信号传递反应。或者不用任何细胞因子处理细胞(-)，或者用100ng/ml IL-6，LIF，CNTF或100ng/ml s-CNTFR+100ng/ml CNTF(CNTF+s-R)将细胞处理15分钟。通过电迁移率变动分析测定细胞STAT因子的激活。箭头表示结合的STAT3同二聚体(a)，Stat1Stat3异二聚体(b)，Stat1同二聚体(c)的迁移位置。图中的n表示非特异性结合。
图5表示HepG2/CNTFR细胞中由m-CNTFR介导的生物活性。详细实验和结果的处理如图2所述。受试的蛋白质是CNTF(()，IA-CNTF(()和AKDH-CNTF(()。保藏物于1997年2月12日将被编码SEQ ID NO2的核苷酸序列转化的大肠杆菌HB2151细菌保藏于国家工业和海生细菌保藏股份有限公司(NCIMB)，Aberdeen，Scotland，UK.保藏号为NCIMB 40860。
上文已给出本发明的一般性描述，借助于下列实施例，将给出本发明具体实施方案的更详细描述，以更清楚地说明本发明的目的，特征，优点和操作方法。实施例实施例1制备经修饰的CNTF蛋白a)构建编码经修饰的CNTF蛋白的DNA制备Thr169Ile/His174Ala/人CNTF(IA-CNTF；SEQ ID NO2)，使用pHenD-CNTF载体(Baumann等，1993)为模板，通过重叠延伸PCR(Horton和Pease，1991)产生突变。使用寡核苷酸引物组1(5’-GATCGTCGACATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGC-3’)+2(5’-AGAAATGAAACGAAGGTCAGCGATGGACCTTACTGTCCA-3’)和3(5’-TGGACAGTAAGGTCCATCGCTGACCTTCGTTTCATTTCT-3’)+4(5’-GAAACCATCGATAGCAGCACCGTAAT-3’)，以94℃2分钟，50℃2分钟和72℃3分钟为循环进行两个独立的PCR扩增。使用Qiaex试剂盒分离两个PCR产物，混合，并在第二个PCR反应中扩增。在缺乏引物1+4时进行5轮PCR循环(如上所述)，在存在引物1+4时进行35轮循环。用SalI和ClaI消化PCR产物，通过Qiaex纯化，亚克隆至经SalI/ClaI消化的pHenD-CNTF载体中，产生载体pHenD-IA-CNTF。DNA测序揭示出存在产生预期由所用诱变引物所致的His174Ala取代的突变，以及在编码的蛋白质序列中产生Thr169Ile取代的其它点突变(可能是聚合酶的错误所致)。使用下列方法将IA-CNTF的编码序列亚克隆至pRSET质粒，该质粒可以使细菌高水平表达蛋白质(Horton和Pease，1991)。使用寡核苷酸引物5(5’-GTCACCATGGCTT TCACAGAGCATTCACCG-3’)和6(5’-TGACGCGGCCGCCCTACACATTTTCTTGTTGTTAG CAATATA-3’)，以pHenD-IA-CNTF载体为模板进行PCR扩增，以94℃2分钟，50℃2分钟和72℃2分钟进行25轮循环。用NcoI和BamHI消化PCR产物，使用Wizard PCR试剂盒纯化PCR产物，并亚克隆至经NcoI/BamHI消化的质粒pRSET-CNTF(Horton和Pease，1991)。通过DNA测序进一步证实最后的构建体的同一性。b)产生和纯化经修饰的CNTF蛋白在大肠杆菌中产生重组蛋白质并根据前述方法(Saggio等，1995；Di Marco等，1996)通过反相HPLC纯化该重组蛋白质。实施例2经修饰的CNTF蛋白的受体结合活性使用前述方法(Saggio等，1994；Saggio等，1995)，通过测定蛋白质和生物素化的CNTF竞争与固相-固定化CNTFR结合的能力来测定CNTF和IA-CNTF的CNTFR结合活性。如图1所示，IA-CNTF对CNTFR的亲和性比野生型蛋白质低15倍。实施例3非神经元细胞中由可溶性CNTFR介导的生物活性人肝细胞瘤细胞系HepG2表达LIFR和gp130，但不表达CNTFR(Baumann等，1993)。在HepG2细胞中加入可溶性的CNTFR可导致对CNTF反应性的剂量-依赖性增加，这是高亲和性CNTF受体复合物形成所致。IA-CNTF的生物活性示于图2。s-CNTFR的浓度为亚饱和时，此变体在HepG2试验中作为完全的激动剂起作用，其EC50值比CNTF的高5倍，这与其对CNTFR的亲和性降低一致。实施例4在神经元细胞中由膜结合的CNTFR介导的生物活性对IMR-32细胞中胆碱乙酰转移酶活性的刺激测定CNTF和IA-CNTF在表达m-CNTFR的人成神经细胞瘤细胞系IMR-32(Baumann等，1993；Halvorsen等，1996)中诱导胆碱乙酰转移酶的能力。与HepG2细胞形成对照的是，如图3所示，CNTF和IA-CNTF在此试验中效力相同。实施例5经改造可表达膜结合的CNTFR的非神经元细胞中的生物活性为了检测膜结合的CNTFR是否足以赋予经修饰的CNTF蛋白(尽管其对CNTFR的亲和性降低)以高反应性，用编码全长CNTFR的表达载体稳定转染HepG2细胞。为此，通过由SH-SY5Y细胞逆转录-PCR得到编码全长人CNTFR(编码氨基酸1-372的核苷酸264-1382(Davis等，1991))的人cDNA，并将此cDNA克隆至真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen)的EcoRV位点，所述质粒携有新霉素抗性基因。DNA(20mg)作为磷酸钙沉淀物被转染至HepG2细胞中(Graham和Vander Eb，1973)，在添加有1mg/ml G418的完全培养基(含有青霉素，链霉素和10％胎牛血清的极限必需培养基)中对细胞进行选择。以CNTF表面结合和CNTF-诱导的对触珠蛋白产生的刺激为基础鉴定稳定表达CNTFR(HepG2/CNTFR)的亚克隆。在添加有0.2mg/ml G418的完全培养基中维持HepG2/CNTFR细胞。
通过缺乏s-CNTFR时，CNTF快速诱导STAT转录因子激活的能力进一步证实HepG2/CNTFR细胞中功能性m-CNTFR的存在。与之形成对照的是，如图4所示，HepG2细胞中由CNTF所致的STAT激活需要s-CNTFR的存在。电迁移率变动分析将HEPG2和HEPG2/CNTFR细胞平铺于100ml的培养皿中，24小时后，当生长为半铺满时使用。将细胞血清饥饿4小时，然后用多种试剂处理15分钟。再用含50mM NaF的磷酸盐缓冲液的冰冷溶液洗涤细胞，离心收集细胞并将细胞冷冻于液氮中。按前述方法(Demartis等，1996)制备总的细胞提取物。使用10g细胞提取物，根据Sadowsky和Gilman(见Sadowsky和Gilman，1993)的电迁移率变动分析测定激活的STAT因子与寡核苷酸SIE m67(Wagner等，1990)的高亲和性结合。在[(-32P]dATP和[(-32P]dCTP(3000Ci/mmol)的存在下，用Klenow酶标记寡核苷酸探针的5’末端。在含5％甘油的2.5％/0.5TBE(Tris-Borato 45mM，EDTA 0.5mM，pH7.8)中，在聚丙烯酰胺凝胶上分辨复合物，然后干燥并进行放射自显影。
在HeG2/CNTFR细胞中，CNTF和IA-CNTF刺激触珠蛋白产生的效力相同(图5)，这表明非神经元细胞中CNTFR的膜锚着足以赋予类似于在神经元IMR-32细胞中观察到的相对生物活性分布。以前显示出具有增强的神经元受体选择性的人CNTF变体AKDH-CNTF(意大利专利申请RM96A000492)(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His/人CNTF)在表达CNTFR的肝细胞瘤细胞中也非常有效。这些结果表明此试验可用于鉴定对膜结合的CNTFR选择性增强的CNTF变体。参考文献(1)Manthorpe，M.，Louis，J.C.，Hagg，T.，e Varon，S.(1993)于神经营养因子(Neurotrophic factors)(Loughlin，S.E.e Fallon，J.H.，eds)p.443-473，科学报道(Academic Press)，San Diego，CA(2)Ip，N.Y.e Yancopoulos，G.D.(1996)神经科学年评(Annu.Rev.Neurosci.)19，491-515(3)Hughes，S.M.Lillien，L.E.，Raff，M.C.，Rohrer，H.，eSendtner，M.(1988)自然(Nature)335，70-73(4)Louis，J.-C.，Magal，E.，Takayama，S.，e Varon，S.(1993)科学(Science)259，689-692(5)Schooltink，H.，Stoyan，T.，Roeb，E.，Heinrich，P.C.，eRose-John，S.(1992)FEBS快讯(FEBS Lett.)314，280-284(6)Helgren，M.E.，Squinto，S.P.，Davis，H.L.，Parry，D.J.，Boulton，T.G.，Heck，C.S.，Zhu，Y.，Yancopoulos，G.D.，Lindsay，R.M.，e Distefano，P.S.(1994)细胞(Cell)76，493-504(7)Conover，J.C.，Ip，N.Y.，Poueymirou，W.T.，Bates，B.，Goldfarb，M.P.，DeChiara，T.M.，e 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His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val85 90 95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu100 105 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile115 120 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145 150 155 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu165 170 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His180 185 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195 200(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度200个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称(Thr169Ile/His174Ala)人CNTF；IA-CNTF(D)其它资料人CNTF的序列(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu1 5 10 15Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr20 25 30Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile35 40 45Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp50 55 60Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr65 70 75 80Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val85 90 95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu100 105 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile115 120 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145 150 155 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Ile Val Arg Ser Ile Ala Asp Leu165 170 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His180 185 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195 200
权利要求
1.睫状神经营养因子(CNTF)的变体，其特征在于其中第169位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代，第174位的组氨酸残基被丙氨酸残基取代，这些变体对膜受体的选择性增强。
2.权利要求1所述的变体，其中CNTF是人CNTF，其特征在于其中第169位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代，第174位的组氨酸残基被丙氨酸残基取代，这些变体对受体的选择性增强。
3.药物组合物，其特征在于含有权利要求1或2所述的CNTF变体和药物可接受的载体。
4.在通过膜结合的CNTF受体或可溶性的CNTF受体诱导生物反应的过程中评估CNTF变体对膜结合受体增强的选择性的方法。
5.CNTF变体，其特征在于是通过权利要求4的方法选择的。
6.编码权利要求1或2所述的CNTF变体的分离的和纯化的DNA分子。
7.含有权利要求6所述DNA的DNA重组分子，所述DNA与在所述重组DNA中控制表达的序列功能性结合。
8.被权利要求7所述的重组DNA转化的单细胞宿主。
9.权利要求8所述的单细胞宿主，该宿主选自细菌，酵母，真菌和动物和植物细胞。
10.权利要求1，2或5所述的变体用于制备治疗神经疾病或障碍之药物的用途。
11.权利要求1，2或5所述的变体与其它蛋白质或其它分子的缀合物。
12.权利要求11所述的权利要求1，2或5所述的变体的缀合物，它是与针对允许变体穿过血脑屏障的转移受体之抗体的缀合物。
13.权利要求11所述的权利要求1，2或5所述的变体的缀合物，它是与降低所述变体之免疫原性的聚乙二醇的缀合物。
全文摘要
本发明的目的是受体选择性增强的睫状神经营养因子变体(CNTF),该变体可用于治疗包括运动神经元疾病和肌肉退化性疾病的疾病和障碍。本发明的另一个目的是提供鉴定上述CNTF变体的方法。相对于人CNTF而言,本发明具有氨基酸取代的hCNTF变体经可溶性CNTFR引发生物作用的能力降低,而不会影响其激活膜结合神经元CNTF受体的能力,从而改善了它的治疗特性。图1显示了本发明的CNTF受体(IA－CNTF;SEQ ID NO:2)对CNTFR的结合亲和性降低。显然,与野生型人CNTF分子相比,该变体对CNTFR的结合亲和性降低。
文档编号A61K38/00GK1251132SQ98803484
公开日2000年4月19日 申请日期1998年3月20日 优先权日1997年3月20日
发明者I·戈劳古恩, A·狄马科, A·德马提斯, R·劳夫, I·萨吉奥 申请人:布·安格莱荻公司分子生物学研究所