专利名称：一种空前体脂质体及其制备和在包封药物在临床中的应用的利记博彩app
该发明涉及一种药物制剂领域，更具体地说是一种加药物溶液后，形成等渗的脂质体混悬液的空前体脂质体，为一种干燥的产品药物制剂及用途专利。
脂质体(Liposome)作为药物载体，在药物传递系统(Drug Delivery System)中的研究和应用日益广泛展开，但也存在一定的局限性。一般脂质体混悬液以水分散体储存，易水解的药物稳定性受到很大影响。由于磷脂易被氧化、粒子沉降、聚集、融合导致包封药物泄漏等，这些因素使脂质体分散系不能长期存放。上述存在的不稳定问题是脂质体研究的重要课题；此外，注射用的脂质体在生产过程高温灭菌，将严重破坏其双分子结构和被包封的热不稳定、有活性的药物。近年来，开展了冻融、冻干等方法制备脂质体如L-门冬酰胺酶脂质体(EPA 0485 143A)，但存在制备中加入的活性药物L-门冬酰胺酶存在不必要的损失问题。除了上述脂质体本身和制备上的限制外，它的应用也受到限制，如另一种液态脂质体Lipofecetin虽不包封药物，但只适合体外细胞基因转染，因毒性大而在体内不能应用。正因为这些脂质体不足之处，限制了脂质体的商品化应用。为提高脂质体的稳定性，将液态的脂质体制备成固态储存的脂质体，使用前加水水合形成脂质体而被应用，这将避免与脂质体混悬液有关的诸多问题。进而，出现了前体脂质体方面的研究。
国外目前常规制备的前体脂质体均为包含某种药物的制剂，虽然加水即可形成脂质体，但在制备过程中，往往加入药物，如BYUNG-NAK AHN，et al.，J.Microencapsulation，1995，12(4)363-365。O.P.KATARE，et al.，J.Microencapsutation，1995，12(5)487-493报道，这不利于制备那些不稳定的具有活性的药物的脂质体。另外，由于大多数生物技术产品不耐热，常规制备工艺易导致这类产品破坏失效，因此，有必要研制一种前景广泛的新制剂，不把主药包在里面，临用时现配的空前体脂质体愈加重要。
本发明的目的在于提供一种不仅能包封蛋白类药物和核酸类药物，并且能静脉注射或其它途径给药，可以广泛用于临床的新前体脂质体制剂。
本发明涉及的技术根据以往脂质体的匀化法加以改进，在制备过程中将中间品经过灭菌，后冷冻干燥得乳白色产品。
根据本发明，空前体脂质体基本组成为大豆磷脂和胆固醇(摩尔比为7∶3)。
实施本发明的技术途径主要有(1)、类脂溶液的配制将大豆磷脂和胆固醇(摩尔比为7∶3)，在温热条件下溶于磷酸缓冲液(含甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮)，通氮气保护下经过组织捣碎机匀化，再通过高压乳化30～60Mpa压力5～10分钟制成脂溶液，其中脂类浓度0.1-8％，甘露醇浓度0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮0.02-6％。
(2)、将上述类脂溶液挤压过0.45μm聚碳酸酯微孔滤膜，得脂质溶液，在氮气保护下灌封，100℃30分钟流通蒸气灭菌。
(3)、灭菌的脂质溶液，在无菌条件下分装于安瓿中，经冷冻干燥，充氮气后熔封。制得白色空前体脂质体。
其中甘露醇还可以是蔗糖、乳糖、右旋糖苷、海藻糖或其它多糖。所制备的空前体脂质体，其特征在于加入药物溶液进行水合包封形成药物脂质体混悬液，具有维持动物或人体内白细胞在正常水平的能力。
前体脂质体(Proliposome)为一种干燥的产品，在加入水或药物水溶液后，分散或溶解形成一个等渗脂质体混悬液，适用于静脉或其它途径给药的新型工艺制品。
采用药用组成制备出不包封药物的空前体脂质体，既区别于由药物和脂类组成的常规前体脂质体，克服其包封药物稳定性问题(药物本身降解或被氧化)；又区别于常规脂质体混悬液，克服其混悬液稳定性问题(与脂类相关或药物从脂质体中泄漏)适合包封多种药物的前体脂质体。
本发明通过空白前体脂质体加入L-门冬酰胺酶液进行水合包封，形成L-门冬酰胺酶脂质体混悬液，保持了较高的酶活性并有稳定的包封率。所制备包封的L-门冬酰胺酶的脂质体比原来L-门冬酰胺酶毒性降低、静脉给药(高、中)剂量抗肿瘤疗效提高。即L-门冬酰胺酶脂质体(空白前体脂质体加得)i.p.(7400，3700 KU/kg)能显著延长移植性小鼠淋巴细胞白血病L1210、P388的存活天数(P＜0.01)，其效果优于L-门冬酰胺酶。另外，对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响；而L-门冬酰胺酶高剂量组(1000KU/kg)与对照组相比有显著降低小鼠外周血中白细胞总数及血小板数的作用(P＜0.05)。L-门冬酰胺酶脂质体对小鼠静脉注射的急性毒性明显小于L-门冬酰胺酶。细胞学研究结果表明，作用L-门冬酰胺酶脂质体于人或鼠的血液病细胞，经光学显微镜和逶射电镜观察均有明显变化。光学显微镜下，细胞变圆、生长缓慢、结构不清。电镜观察到癌细胞核缩小、异染色质增多、部分核固缩、部分细胞膜断裂、细胞不完整。特别是经流式细胞仪DNA含量分析HL-60细胞系的G0/G1期细胞明显增加、进入S期细胞减少；而且L-门冬酰胺酶脂质体组比L-门冬酰胺酶组S期细胞减少5-8％。P815细胞系的细胞增殖指数下降更显著，L-门冬酰胺酶脂质体组PI＝39.4％，对照组PI＝65％；HL-60、L1210细胞系L-门冬酰胺酶脂质体组与对照组相比，细胞凋亡比例显著增多，分别是18.19％、11.67％，对照组为2.68％、2.81％；前者增加8倍，后者增加5倍。这反映了L-门冬酰胺酶脂质体对体外肿瘤细胞作用更显著。
本发明用以下实施例予以解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
结合附图完成的实施例
图1空前体脂质体L-门冬酰胺酶溶液形成脂质体的透射电镜照片(×250,000)图2空前体脂质体加L-门冬酰胺酶溶液形成脂质体的粒经分布图3空前体脂质体加L-门冬酰胺酶溶液形成脂质体粒经分布(2个月)图4 空前体脂质体加L-门冬酰胺酶溶液形成脂质体粒经分布(3个月)图5 P815细胞对照组图6 P815细胞实验A组图7 P815细胞实验C组图8 P815细胞实验B组图9 HL-60细胞对照组图10HL-60细胞实验A组图11L1210细胞对照组图12L1210细胞实验A组图13K652细胞对照组图14K652细胞实验A组图15P815细胞对照组图16P815细胞实验A组图17P815细胞实验C组图18HL-60细胞对照组图19HL-60细胞实验A组图20L1210细胞对照组图21L1210细胞实验A组图22细胞增殖指数图实施例1.本发明通过空白前体脂质体500mg，分别加入L-门冬酰胺酶液(2mg/ml)10ml进行水合包封，形成L-门冬酰胺酶脂质体混悬液，所制备包封的L-门冬酰胺酶的脂质体用SephadexG 200凝胶柱测定包封率，见表1本发明制备的前体脂质体对L-门冬酰胺酶的包封率在46.2±0.99(％)～52.2±1.25(％)之间.三个批号的变异系数(RSD％)均小于3％。
实施例2、L-门冬酰胺酶脂质体在人血清中活力保持率考察空前体脂质体经L-门冬酶胺酶溶液形成L-门冬酰胺酶混悬液，由SephadexG 200分离得到含L-门冬酰胺酶脂质体洗脱液，与人血清混合，37℃贮存.在0、6、12、18、24、30、36、42、48小时测定酶活力，计算酶活力保持率。见表2经48小时，在人血清中(37℃)L-门冬酰胺酶活力保持率良好为90.3％实施例3、L-门冬酰胺酶脂质体的粒经分布将空前体脂质体加L-门冬酰胺酶溶液，水合得到脂质体混悬液，用透射电镜照相(图1)库尔特计数器计数(图2)，表明脂质体粒经分布在0.662±0.0792um范围，变异系数为12％。(66141个粒子统计95％可信限0.661～0.662um)L-门冬酰胺酶脂质体混悬液，在4℃储存2个月后，粒经分布在0.684±0.1um范围，变异系数为14.6％(42508个粒子统计95％可信限0.683～表1 空前体脂质体形成L-门冬酰胺酶脂质体的包封率批 号包 封 率 平均包封率 变异系数(RSD)N＝6％ ％±SD ％50.849.553.296072701 51.0±1.212.3750.650.951.049.248.447.296072702 48.2±0.992.0648.249.346.452.353.553.296072903 52.2±1.252.3950.252.951.4表2 L-门冬酰胺酶脂质体在人血清中活力保持率(37℃)时间(h)0 6 12 18 24 30 36 42 48活力664.2 653.1 644.3 637.0 634.5 629.6 618.5 612.3 600.1(单位)活力保持率10098.3 97.0 95.995.594.893.1 92.1 90.3(％)0.685um)图3。L-门冬酰胺酶脂质体经4℃储存3个月后，粒经分布在0.745±0.179um范围内，(统计粒子数目55277个，95％可信限0.744～0.747um)图4，变异系数24.1％实施例4.L-门冬酰胺酶前体脂质体对移植性小鼠淋巴细胞白血病L1210生命延长作用取DBA/2小鼠18～22g，雌雄各半，80只，按移植性肿瘤研究法接种L1210腹水瘤，按种后随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分别按以下三个剂量给药L-门冬酰胺酶前体脂质体(按L-门冬酰胺酶计7400，3700，1850KU/kg)，L-门冬酰胺酶注射液(7400，3700，1850KU/kg)；另设生理盐水空白对照组(0.9NaCl，0.4ml/20g)及阿霉素注射剂(2mg/kg)组，于接种后24h腹腔注射，每天一次，共给药10天，给药后观察荷瘤DBA/2小鼠存活天数(存活60天以上小鼠按60天计)，所得实验结果进行统计学(t检验)处理.试验重复三次，实验结果见表3.
实验结果表明 与生理盐水空白对照表组相比L-门冬酰胺酶前体脂质体(L-ASNaseliposomes)及L-门冬酰胺酶(L-ASNase))及阿霉素(DR)皆能显著延长移植性小鼠淋巴细胞白血病的存活天数(P＜0.01)，对L1210的生命延长作用DR作用最强，其生命延长率为265.9％；其次为L-门冬酰胺酶脂质体，其生命延长率最高达184.7％。L-ASNase作用最弱，其生命延长率最高为132.9％.L-门冬酰胺酶前体脂质体与相同剂量的L-门冬酰胺酶相比，其高、中剂量组(7400，3700KU/kg)皆有显著延长L1210小鼠的存活天数作用(P＜0.05)，试验重复三次，结果相近，生命延长率计算如下式生命延长率＝(T-C)/C×100％式中C为对照组平均生存天数；T为给药给平均生存天数.结果见表3实施例5 L-门冬酰胺酶前体脂质体对移植性小鼠淋巴细胞白血病P388的生命延长作用取DBA/2小鼠18～22g，雌雄各半，80只，按移植性肿瘤研究法接种P388腹水瘤，接种后，随机分为8组，每组10只，雌雄各半，分别按以下剂量给药L-门冬酰胺酶前体脂质体(按L-ASNase计7400，3700，1850KU/kg)；L-门冬酰胺酶注射剂(7400，3700，1850KU/kg)；另设生理盐水空白对照组(0.9％NaCl，0.4ml/20g)及阿霉素注射剂(20mg/kg)组，于接种后24小时腹腔注射，每天一次，连续10天，给药后记录荷瘤DBA/2小鼠平均生存时间(存活60天以上小鼠按60天计)，计算给药组生命延长率，并分别进行统计学(t检验)处理.试验重复三次，结果见表4实验结果表明与生理盐水空白对照组相比，L-门冬酰胺酶脂质体、L-门冬酰胺酶及阿霉素皆均能显著地延长移植小鼠淋巴细胞白血病P388的存活天数(P＜0.01).对P388的生命延长作用阿霉素作用最强，生命延长率为253.4％，其次为L-门冬酰胺酶前体脂质体其生命延长率最高达183.3％，L-门冬酰胺酶作用最弱，其生命延长率最高为132.1％.与相同剂量的L-门冬酰胺酶注射剂相比，L-门冬酰胺酶前体脂质体高、中剂量组(7400、3700KU/kg)皆有显著延长P388小鼠的存活天数(P＜0.05).试验重复三次，结果相近.结果见表4.实施例6 L-门冬酰胺酶前体脂质体对正常小鼠体重、外周血中白细胞总数及血小板数的影响表3L-门冬酰胺酶前体脂质体对移植性小鼠淋巴细胞白血病L1210的平均生存时间影响(i.p.)(×±SD，n＝10)实验cnt 制剂 动物剂量平均生存 延长率批号 种类 数目KU/kg 时间(天) (％)对照组 10 8.5±1.57L-门冬酰胺酶 10 7400 24.2±4.16△△***184.7脂质体 10 3799 18.7±3.68△△***120.010 1850 12.5±3.81***47.096072701L-门冬酰胺酶10 7400 19.8±4.73***132.9注射液10 3700 15.1±3.84***77.610 1850 11.8±3.26***38.8阿霉素10 2mg 31.1±7.87***265.9对照组 10 8.6±1.4310 7400 24.3±4.24△△***182.6L-门冬酰胺酶10 3700 18.6±3.43△△***116.3脂质体10 1850 12.3±3.65***43.096072702L-门冬酰胺酶 10 7400 19.5±4.43***126.7注射液 10 3700 15.2±3.49***76.710 1850 11.5±2.80***33.7阿霉素 10 2mg29.6±6.01***244.2对照组 10 8.6±1.5210 7400 23.9±4.12△△***177.9L-门冬酰胺酶10 3700 18.9±3.63△△***119.8脂质体10 1850 10.6±3.14 23.396072703L-门冬酰胺酶 10 7400 19.3±4.14***124.4注射液 10 3700 14.7±3.93***70.910 1850 9.7±3.0512.8阿霉素 10 2mg 30.4±8.10***253.5*** p＜0.01，与对照组相比△△ p＜0.05，与同剂量的L-门冬酰胺酶注射液相比表4 L-门冬酰胺酶前体脂质体对移植性小鼠淋巴细胞白血病P388的平均生存时间影响(i.p)(×±SD，n＝10)实验 制剂 动物剂量 平均生存延长率批号 种类 数目KU/kg 时间(天)(％)对照组 10 8.9±1.1010 7400 24.5±4.97△△***175.3L-门冬酰胺酶10 3700 18.8±3.55△△***111.2脂质体10 1850 12.7±3.5942.796072701L-门冬酰胺酶10 7400 19.9±4.75***123.6注射液 10 3700 15.3±3.83***71.910 1850 11.9±3.01***33.7阿霉素 10 2mg 30.9±7.53***247.1对照组 10 8.4±1.3510 7400 23.8±3.60△△***183.3L-门冬酰胺酶10 3700 18.5±3.44△△***120.2脂质体 10 1850 12.2±2.94***45.29607270210 7400 19.5±4.50***132.1L-门冬酰胺酶10 3700 15.3±3.37***82.1注射液10 1850 11.7±2.95***39.3阿霉素 10 2mg 29.6±6.26***252.4对照组 10 8.6±1.43L-门冬酰胺酶10 7400 23.4±3.94△△***172.1脂质体 10 3700 18.4±3.51△△***114.010 1850 10.8±3.01 25.696072903L-门冬酰胺酶10 7400 19.5±4.09***126.7注射液10 3700 15.0±3.64***74.410 1850 10.4±2.87 20.9阿霍素 10 2mg 30.4±7.96***253.4*** p＜0.01，与对照组相比△△ p＜0.05，与同剂量的L-门冬酰胺酶注射液相比表5 L-门冬酰胺酶脂质体对小鼠外周血细胞总数及血小板数的影响 (i.v.) (×±SD，n＝10)剂量 小鼠平均体重(克) 红细胞血小板数目制剂(ku/kg)给药前 给药后 数目/mm3109/升对照组 19.3±1.3 25.8±2.4 7696±2130274±7410000 19.2±1.3 24.6±1.8 5781±2016256±57L-门冬酰胺酶500019.5±1.4 25.9±2.0 7436±2083267±68脂质体250019.0±1.1 26.3±2.4 7854±2169279±8110000 19.3±1.3 23.8±1.9 5196±0.23**218±61**L-门冬酰胺酶500018.9±1.1 25.6±2.1 6924±2007269±71注射液250019.0±1.2 26.0±2.2 7564±2148270±63**P＜0.05，与对照组相比取昆明种小鼠18～22g，70只，随机分为7组，每组10只，雌雄各半，设生理盐水空白对照组，实验按以下剂量L-门冬酰胺酶前体脂质体(按L-ASNase计10000、5000、2500KU/kg)L-门冬酰胺酶注射剂(10000、5000、2500KU/kg)；腹腔注射给药体积为0.4/20Gg每天一次，连续10天，于停药后第一天称重，并由眼眶静脉取血，所得数据进行统计学(t检验)处理，实验结果见表5。
实验结果表明与空白对照组相比，L-门冬酰胺醇高剂量组(1000KU/kg)有显著降低小鼠外周血中白细胞总数及血小板数的作用(P＜0.05)，而L-门冬酰胺酶脂质体对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响。L-门冬酰胺酶脂质体组及L-门冬酰胺酶组对小鼠体重增长无明显影响。实施例7 L-门冬酰胺酶前体脂质体的急性毒性实验—最大耐受量的测定取18～22g昆明种小白鼠20只，雌雄各半，尾静脉注射给药(与临床用药一致)，给药剂量为给以最大药物浓度(4000KU/ml)，最大静脉注射体积(0.5ml/20g)给药一次，给药后每天观察记录小鼠活动、死亡情况，共观察14天，于给药后的第15天称小鼠体重，并计算体重增长率。
给药后观察14天，小鼠未出现死亡和任何毒副作用，体重皆有所增加，雄性小鼠体重增长率为44.39％。雌性小鼠体重增长率为31.28％，见表6。
表6. L-门冬酰胺酶脂质体对小鼠体重的影响(i.v.)(×±sD，n＝10)
表明小鼠静脉注射L-门冬酰胺酶前体脂质体的最大耐受量为10.0×105KU/kg，最大耐受量相当于每日人临床拟用剂量的5000倍。临床人拟用量为200KU/kg，10.0×105KU/kg÷200KU/kg＝5000(倍)。
L-门冬酰胺酶脂质体(空白前体脂质体临用前加L-门冬酰胺酶溶液配得i.p.(7400，3700KU/kg)能显著地延长移植性小鼠淋巴细胞白血病L1210及P388的存活天数(P 0＜.01)其效果优于L-门冬酰胺酶。对L1210小鼠和P388小鼠生命延长率最高可达184.7％和183.3％。昆明种小白鼠20只，尾静脉注射L-门冬酰胺酶脂质体，给药剂量为以最大药物浓度(40000KU/ml)，最大静脉注射体积(0.5ml/20g)给药一次，观察14天，小鼠未出现死亡和任何毒副作用，雄性小鼠体重增长率为44.39％，雄性小鼠体重增长率为31.1％，L-门冬酰胺酶脂质体的最大耐受量为10.0×105KU/kg。其急性毒性明显小于L-门冬酰胺酶。实施例8 L-门冬酰胺酶前体脂质体对体外肿瘤细胞的抑制作用L-门冬酰胺酶为治疗白血病和恶性淋巴瘤的有效药物。有关L-门冬酰胺酶前体脂质体的研究报道尚少。本文重点研究体外肿瘤细胞药物作用后的情况，进行了光学显微镜、电子显微镜下形态学观察、细胞增殖率及流式细胞仪DNA含量分析。进而研究该药的作用，以便指导临床合理用药。
细胞系HL-60人早幼粒细胞白血病P815小鼠浆细胞瘤，L1210小鼠淋巴白血病；K562人红白血病细胞。
L-门冬酰胺酶脂质体(由前体脂质体形成).
培养液 RPMI 1640美国DIBCO公司，内含10％小牛血清。青霉素100U/ML对照组加培养液；实验A组(L-门冬酰胺酶脂质体)，分别含酶2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml；实验B组加空白脂质体(由前体脂质体形成)；实验C组加L-门冬酰胺酶.实施例8.1.细胞培养将处于对数生长期的细胞，以5×105个细胞/ml悬液按种到25ml细胞培养瓶中，使A、C组含药物30μg/ml.A、B组含脂类1mg/ml。置于37°孵箱培养24小时，在倒置显微镜下观察形态学变化。再将细胞取出、离心3000转/分×8分钟，弃上清，加4％戊二醛固定2hr后。用双蒸水冲洗，梯度酒精脱水、树脂Epon-812包埋，LKB-V型超薄切片机切出薄片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，H-300透射电镜观察。实施例8.2. 四甲基偶氮唑盐(Sigma)MTT比色法将处于对数生长期的细胞，以2×105个细胞/ml浓度加入40孔酶标板内，100μl/孔，再加入新鲜RPMI1640培养液倍比稀释的待测药品，100μl/孔培养上清，加入MTT溶液(其浓度5mg/ml)30μl/孔，于振荡品上振荡1分钟，放置5％CO237℃育4小时，取出吸弃上清，加0.4mol/L盐酸异丙醇100μl/孔，振荡后在酶标仪上570nm读取A值。实施例8.3. 流式细胞仪DNA含量分析将对数生长期细胞，调成5×105个细胞/ml悬液，接种于25ml细胞培养瓶中，加入A、B、C组药物，使A、C组成含药物30μg/ml，A、B组含脂类1mg/ml。置5％CO237℃孵育24小时，取出离心，弃上清，加固定液，后用碘化丙锭进行DNA染色，用流式细胞仪(FCM)，作DNA细胞周期采样分析(每份样品测5000个细胞)。资料均经Cellfit软件收集、贮存和分析。
实施例9 四种细胞经实验A、B、C三组药物作用24小时，细胞形态学变化见表7、8光学显微镜照片见图5～14。
表7P815细胞形态对照组 实验A组 实验B组 实验C组细胞显上皮形， 细胞生长缓慢， 细胞显上皮形， L-门冬酰胺酶作用园形贴壁生长， 大多数细胞变园，园形贴辟生长， 后，与A组相比较细胞轮廓清楚， 细胞大小不一， 与对照组差别不大。
分细胞变园，生长生长旺盛。
结构松散。
迅速。
表8 HL-60、L1210、K562细胞形态细胞系 对照组 实验A组细胞悬浮生长，轮廓清楚，细胞生长缓慢，形态大小HL-60细胞生长旺盛。
不一，核染色质浓集。L1210细胞悬浮生长，轮廓清楚，细胞形态不规则，结构园而透亮松散，核染色质浓集。。K562细胞悬浮生长，轮廓清楚，细胞轮廓不请，园而透亮。
形态大小不一。实施例10透射电镜观察结果见表9、10，附超薄切片照片见图15～21。
表9 透射电镜观察P815细胞超薄切片对照组 实验A组 实验B组癌细胞形态不规则，常染色 部分癌细胞核缩小，趋向固缩， 癌细胞与对照组比较，质丰富，核仁明显，胞质中 胞质中出现大小的空泡、脂滴 无明显该变。胞质中含少量线粒体和粗面内质网，及髓样小体，有些细胞膜不 粗面内质网略增多。细胞表面有短小微绒毛。完整。
表10 透射电镜观察HL-60、L1210细胞超薄切片细胞系 对照组 实验A组HL-60 癌细胞核仁形态不规则，核仁大癌细胞和缩小，异染色质而明显，有些边集，常染色质 增多，部分核固缩。核仁丰富，胞质少，含大量游离不明显，胞质中出现大量空泡，核糖体。其它细胞系少，细胞 脂滴及髓样小体，部分细胞膜表面有少量短小微绒毛。
断裂。细胞不完整。
L1210癌细胞为圆形及不规则形。核大癌细胞核异染色质增多，有些形状不规则，常染色质丰富。
趋向固缩、碎裂。胞质中出现胞质中含大量游离核糖体、少量空泡、质滴、裂隙，胞膜不完粗面内质网及线粒体，细胞表面无缺整，大量癌细胞坏死、崩解。
隙有少量短小微绒毛。
实施例11 四甲基偶氮唑盐MTT比色法测定结果表明细胞受到L-门冬酰胺酶脂质体作用后，细胞生长明显受到抑制。随着A组L-门冬酰胺酶脂质体浓度增加，增殖率降低。但P815细胞经(空白)脂质体作用与对照组无明显区别。L-门冬酰胺酶对P815细胞(C组)不如加L-门冬酰胺酶脂质体组(A组)明显。见图22。实施例12 细胞经药物作用后，细胞增殖周期时相分析和凋亡比率变化。见表11、12。
表11 细胞增殖周期时相分析细胞系 对照组实验组G0/G1S G2M G0/G1SG2MHL-6029.761.6 8.6 41.249.9 9L121021.067.5 11.5 38.160.0 1.9P815 34.659.9 5.5a.60.613.8 25.6b.16.975.9 7.2c.59.019.6 21.4a. P815实验A组 b. P815实验B组 c. P815实验C组从表11说明，药物A、C组即L-门冬酰胺酶脂质体(经前体脂质体水合而得)A组和L-门冬酰胺酶(C组)与肿瘤细胞作用后，G0/G1期细胞量明显增加，而进入S期的细胞明显减少。
表12 肿瘤细胞增殖指数和细胞凋亡比例细胞系对照组实验组PI (％) RA (％) PI (％) RA (％)HL-669.6 2.6858.9 18.19L1210 79.0 2.8161.9 11.67P81565.0 1.6a. 39.4 1.17b. 83.1 0.48c. 41.0 2.10a.P815实验A组b.P815实验B组 c.P815实验C组表12所示增殖指数(proliferation index，PI)，表示肿瘤细胞群体的增殖程度，细胞周期中S、G2M期细胞所占百分数，依据公式PI＝(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)可得出增殖指数L-门冬酰胺酶脂质体组和L-门冬酰胺酶组(A、C组)的PI值显著下降。HL-60、L1210细胞凋亡比例显著增多。P815细胞与对照组相比差异不显著。
以上技术方案具有以下优点该产品加药物溶液，即可溶解，空前体脂质体能在体内应用，且以固态形式储藏，提高了脂质体的物理、化学稳定性，室温放置或低温4℃储存2.0年仍有良好外观和稳定性。空前体脂质体不仅能包封蛋白类药物如L-门冬酰胺酶，而且能包封核酸类药物如反义寡核苷酸以及普通小分子药物如阿霉素；是一种能携带多种药物的载体制剂。并且一定程度上解决了大分子药物注射剂半衰期较短的问题。将生物技术产品制成低免疫原性的制剂，进而减少过敏反应，延长体内作用时间、降低剂量减少副作用。同时，使空前体脂质体工业化生产或临床药物应用质量进一步提高成为可能。
权利要求
1.一种空前体脂质体，其特征为一种白色干燥产品，主要由大豆磷脂和胆固醇组成，脂类浓度为0.1-8％，甘露醇浓度为0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮为0.02-6％。
2.根据权利要求书1，其中大豆磷脂和胆固醇的最佳摩尔比为7∶3。
3.根据权利要求书1，其中大豆磷脂还可以是蛋黄卵磷脂或其它脂类。
4.根据权利要求书1，胆固醇还可以是二甲基氨基乙氨基羧基胆固醇，或者是胆固醇的其它修饰物。
5.根据权利要求书1，甘露醇还可以是蔗糖、乳糖、右旋糖苷、海藻糖或其它多糖。
6.根据权利要求书1的空前体脂质体的制备方法，其特征在于(1)类脂溶液的配制将大豆磷脂和胆固醇(摩尔比为7∶3)，在温热条件下溶于磷酸缓冲液(含甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮)，通氮气保护下经过组织捣碎机匀化，再通过高压乳化30～60Mpa压力5～30分钟制成类脂溶，其中脂类浓度0.1-8％，甘露醇浓度0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮0.02-6％。(2)将上述类脂溶液挤压过0.45μm聚碳酸酯微孔滤膜，得脂质溶液，在氮气保护下灌封，100℃30分钟流通蒸气灭菌。(3)灭菌的脂质溶液，在无菌条件下分装于安瓿中，经冷冻干燥，充氮气后熔封。制得白色空前体脂质体。
6.根据权利要求书1的空前体脂质体，其特征在于加入药物溶液进行水合包封形成药物脂质体混悬液。
7.根据权利要求书1的空前体脂质体，其特征在于加入药物溶液进行水合包封形成药物脂质体混悬液，具有维持动物或人体内白细胞在正常水平的能力。
8.根据权利要求书1的空前体脂质体，其特征在于加入L-门冬酰胺酶溶液进行水合包封形成脂质体混悬液。
9.根据权利要求书6所述的L-门冬酰胺酶脂质体混悬液，可以包封蛋白类药物和核酸类药物，并且能静脉注射、口服、肌注等给药途径用于临床。
全文摘要
本发明涉及药物制剂领域,采用药用组成制备不包封药物的空前体脂质体,不仅能包封生物大分子或生物技术产品,如蛋白质、核酸类药物,而且能包封化学药物。这种制剂不仅可适用于静脉注射、口腔、眼部、鼻腔、皮肤给药和口服给药,而且可以广泛用于其它途径给药,同时可以临床应用。
文档编号A61K47/36GK1255331SQ98125058
公开日2000年6月7日 申请日期1998年11月30日 优先权日1998年11月30日
发明者王弘 申请人:王弘