鲎属抗lps因子的肽的新免疫学活性的利记博彩app

专利名称：鲎属抗lps因子的肽的新免疫学活性的利记博彩app
尽管对革兰氏阴性脓毒病引起的脓毒性休克(septic shock)的控制有所进展，但该疾病继续导致外科和医疗患者死亡。这种患者的死亡通常是由于心血管萎缩和/或者多器官系统衰退。被认为在引起脓毒性休克中起重要作用的一种革兰氏阴性细菌的主要组分是一种外壁成分，内毒素(LPS)。
内毒素是高分子复合物，其与革兰氏阴性细菌外膜有关，静脉内施用后产生发热反应。当细菌死亡和分解时，内毒素从活细菌上脱落，并且也释放到环境中。细菌内毒素是一种由脂，糖和蛋白质组成的复合物，以总体上带负电荷，热稳定和高分子量为特征。高纯度的内毒素不含有蛋白质，并且是一种脂多糖(LPS)。
人们熟知，细菌内毒素在动物和人类中具有及其重要的生物学作用，并且它存在时导致严重的医学问题，其症状包括引起高烧，补体和细胞因子级联的活化以及低血压。在任何与体液接触的药物产物或医学装置中避免内毒素污染是关键性的。在血清中由于细菌疾病引起的高内毒素水平(败血症)不容易治疗。对该感染的抗生性治疗仅仅是杀死细菌，从而使内毒素从它们的细胞壁游离出来造成发热。
LPS在脓毒性休克的病理中是一个重要的调节物，并且在美国是增强护理单位中死亡的主要原因之一。已经观察到在单核细胞和巨噬细胞中在脓毒病期间LPS暴露将刺激免疫应答，这将导致在有毒级联中TNF-α和其它促炎细胞因子的产生。Morrison和Ulevitch，美国病理学杂志93:527(1978)。脓毒病内皮破坏可能导致持久的和重复的炎症结果。Bane，国际医学年报115:457(1991)。
已经研究出一些蛋白质具有结合与中和LPS的能力，并且在脓毒性休克治疗中的潜在利用。最广泛研究的LPS-结合蛋白之一是杀细菌的/提高透性的蛋白质(BPI)，其是在多形白细胞的嗜天青颗粒中所发现的碱性蛋白质。来自人PMN5的BPI蛋白质具有一种对广谱革兰氏阴性细菌的有效杀菌活性。这种抗细菌活性看来似乎与分离的人类BPI蛋白质的氨基端末端区域(氨基酸残基1-199)有关。近来有人指出BPI(rBPI25)的N端片段中和内毒素活性，Helene等，免疫与感染62:1185(1994)。除它的杀菌作用之外，BPI显示出中和它结合LPS的有毒和细胞因子诱导作用。Xoma公司正开发一种基于BPI蛋白质的治疗产品。该公司的主要BPI-衍生的产物(Neuprex)用在四种适应症的临床功效试验中[1]脑膜炎球菌血症，[2]出血创伤，[3]部分肝切除，[4]严重内腹感染。XOMA公司1996年7月30日。
脂多糖结合蛋白(LBP)是一种在肝中合成的60kD的糖蛋白，它与BPI显示重要的结构同源性。Shumann等公开了氨基酸序列以及人和兔的编码cDNA。如同BPI一样，LBP具有脂A结合位点，并且结合到来自粗糙和光滑形式的细菌的LPS上。不同于BPI,LBP不具有明显的杀菌活性，并且它提高(而非阻止)LPS-诱导的TNF的产生。Schumann等，科学，249:1429(1990)。
一种用于清除细菌的正常宿主影响机制包括结合以及通过中性白细胞和单核细胞的随后吞噬。作为这种处理的一部分，将细菌暴露于杀菌和抑菌因子，包括氧自由基，溶酶体酶，乳铁结合蛋白和各种阳离子蛋白质。LBP调理含LPS的微粒以及完整的革兰氏阴性细菌，介导调解这些LPB-包被的微粒对巨噬细胞的附着。Wright等，实验医学杂志170:1231(1989)。该附着看来似乎通过单核细胞的CD14受体结合LPS和LBP的复合体。Wright等，科学249:1431(1990)。在LBP存在下，LPS与CD14(在多形核白细胞以及单核细胞表面存在)的相互作用已经显示出增加中性白细胞的粘附活性。Wright等，实验医学杂志173:1281(1991),Worthen等，临床诊断杂志90:2526(1992)。这样，尽管BPI显示出对细菌的细胞毒性，并且抑制由细菌刺激产生促炎细胞因子，但是LBP通过CD14-依赖机制促进单核细胞的细菌结合以及活化。新的生物活性脂多糖结合蛋白(LBP)衍生物包括LBP衍生的杂合蛋白，其特征是具有结合以及中和LPS的能力并且缺乏全LBP的CD14-介导的免疫刺激性质。Gazzano-Santoro,WO 95/00641。此外，将与LBP蛋白质的残基91-108对应的肽确定为高亲和性地特异性结合脂。肽抑制LBP与LPS的结合，抑制显色鲎属(Limulus)阿米巴状细胞裂解物反应，并且在体内和体外阻止TNF在LPS攻击后的释放，Taylor24等，生物化学杂志270:17934,。
另一个能够结合和中和内毒素的LPS-结合蛋白已经从鲎(如Limuluspolyphemus)分离出以及从Tachypleus tridentafus分离出Tachypleus解脂多糖因子(TALF),Klaczewiak29等，传染疾病杂志170:490-7(1994)。来自它们的血淋巴(阿米巴细胞)的细胞经历一系列复杂的生化反应，导致血块形成，类以于哺乳动物血液凝聚。这一现象已经用来开发了对很低内毒素水平敏感的生物分析。
当前，这种类型的生物测定是监测药物制造的方法，并且称之为鲎属阿米巴细胞裂解物(LAL)。
Wainwright等，WO 92/20715涉及关于内毒素结合/中和蛋白质的药物效用的发明，并且公开了用于内毒素测定的内毒素结合/中和蛋白质的用途。该发明的另一个目的是提供在体内能够结合和中和内毒素的药物组合物，其中包含有至少与一部分从鲎分离的内毒素结合/中和蛋白质的内毒素结合和中和结构域对应的一种内毒素结合/中和蛋白质。
人们已经研究出鲎属抗LPS因子(LALF)用于脓毒病。Warren等，感染免疫学60:2506-2513(1992)和Garcia25等，Grit.Care.Med.22:1211。这种蛋白质几乎肯定给出对于人治疗的其它外源蛋白相关的劣势，它是免疫原性并且在循环中仅仅有一个短的半衰期，这些因子将减少它的临床潜力。没有一种这些物质已经证实对于在人类中治疗与革兰氏阴性感染相关的严重疾病来说是有效的。
对于上述技术问题的解决方法是通过提供与紧密结合LPS的肽相关的物质完成的，因此，在革兰氏阴性和其它脓毒性疾病的诊断和治疗中是有效的。Battafaraono等从这些蛋白质预测的LPS-结合基元的BPI,LALF,LBP(每种长为27个氨基酸)合成了三个肽。所有从BPI,LALF和LBP衍生的小肽保持明显的体外对不同革兰氏阴性细菌的内毒素中和的和杀菌的活性，Battafaraono26等，外科118:318-24。不久以前，Fletcher等设计一种新的肽-IgG缀合物，CAP-18(106-138)-IgG，它结合和中和内毒素，并且杀死革兰氏阴性细菌，Fletche27等，传染疾病杂志175:621-32。
Hoess等，WO 95/05393涉及一种物质，该物质高亲和性地结合内毒素(脂多糖[LPS])，并且它对于预防或治疗例如革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌脓毒病来说是有用的，对于治疗细菌和真菌感染是有用的，以及对于中和与肝素有关的作用是有用的。该物质是包含一个LPS-结合结构域的LPS-结合肽。已公开包含来自鲎属抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽。
LALF的晶体结构揭示了一种简单的三重折叠，它具有一种引人注目的形状和两亲性。通过正电荷和两亲性并且具有一些暴露的疏水和芳香族残基，LALF结构中的表面伸展环(LALF或LALF-环)与多粘菌素B具有类似的特性。此外，通过正电荷和疏水和芳香族残基的轮流系列来区别LALF的环，并且借助伸展的β-构象，其指向相反方向，单一对阳性电荷由于β-转角构象，指向相同方向并且保持两亲性。所说的环不包含任何负电荷氨基酸。Hoess已经描述对于具有线型10-聚体肽的内毒素和脂质A的rLALF来说最小限度的要求。然而，环肽大概通过模仿所暴露环的三维特征以高亲和性结合脂质A和内毒素，Ried28等，生物化学杂志271:28120-7。在小鼠中进行内毒素免疫性实验后，环肽LALF36-47能够阻止TNF诱导。前不久已经描述了鲎属抗脂多糖因子(LALF)中和细菌内毒素，并且保护小鼠使之免受LPS的杀伤，即使在连续内毒素血症开始发作后施用LALF时也是如此，Roth31RI.Su DH.Child AH.Wainwright NR和Levin J.传染病杂志177(2):388-394,1998。
一个类似的两亲性环存在于三个其它结合LPS的蛋白质中兔和人脂多糖结合蛋白(LBP)和人类杀菌/提高通透性蛋白(BPI)。对LBP和BPI序列的检查揭示出交替残基的一种类似模式，它能够产生一种两亲性环。
然而，这些发明没有表明任何关于单核细胞的抗病毒作用和/或活化，以及没有表明来自鲎的内毒素结合/中和蛋白或者包含来自该蛋白质的31-52位氨基酸的肽。在脓毒病和传染病中其用途或治疗效能是与LPS-结合相关的。此外，没有参考文献公开来自鲎属抗LPS因子的肽31-52对于抗病毒治疗或者提高免疫应答的用途。
人们熟知，病毒是在它的基因组(RNA或DNA)中仅仅含有一种类型的核酸(一般称为跖分子)的较小的感染病原体。病毒仅仅在活细胞和人中复制，它们可以产生不同的疾病。
A．全身疾病，其中该病毒在整个身体中散布，如天花，黄热病，登革热等等。
B．如脊髓灰质炎，由肠道病毒(小儿麻痹症，柯萨奇病毒)造成的无菌脑膜炎，狂犬病，由节肢动物传输的脑炎等等的神经系统疾病。
C．皮肤或粘液的疾病疱疹单显性组合，类型Ⅰ(通常是口)和类型Ⅱ(通常通过生殖)。
D．眼病由于腺病毒的结膜炎，由于纽卡斯尔病毒的结膜炎，流行性出血结膜炎。
E．肝病类型A肝炎(传染性肝炎)，类型B肝炎(通过血清的肝炎)等等。
假设病毒是必需在胞内的寄生物，抗病毒剂不用破坏宿主就应该能够有选择地抑制病毒的功能。有一些以一种特异的方式抑制病毒而不影响细胞代谢过程的化合物，例如金刚胺，一种抑制流感病毒的合成胺；metisazone，一种许多痘病毒的抑制剂，三氟胸苷已经用于成功地治疗由于单纯疱疹病毒引起的角膜病斑。许多这种充当抗代谢物的药剂具有缺陷，它们对人类有毒。
在动物和人中，由于它们的抗病毒容量和免疫系统刺激的能力，因此也检验了诸如左旋咪唑和Isoprinosine之类的化合物，这些药剂不是抗代谢物，但是细胞免疫性刺激物。
由动物和人以及培养细胞产生能够抑制病毒复制的干扰素(在1957年所发现的一种蛋白质)，它作为病毒感染的应答或者其它一些诱导体。干扰素在相同物种的细胞中作为抗病毒物质是更有效的。相反，干扰素活性对特定病毒不具特异性。作为病毒或其它诱导体的应答所产生的干扰素有效地抑制各种病毒的复制。在感染发生之前将干扰素添加到细胞中时，将显著地抑制病毒的复制，而细胞功能仍然保持正常。
在重要的外科手术(如胃肠道手术)过程中，或者在手术部位有高危感染(如心血管手术)患者中，人类病毒感染可能导致并发症。
在无菌外科手术(如腹腔或心血管外科)中，所谓的后手术急性阶段反应的特征是吞噬细胞功能的破坏，对多克隆激活物的淋巴细胞应答的减弱，以及B细胞功能的改变的功能(D.Berger，内毒素研究杂志，4卷，第1期(1997))。这一阶段的特征是患者的免疫功能异常。由巨细胞病毒(CMV)产生的肺炎在有免疫缺损的人中更重要，如利用免疫抑制剂作为器官移植或者恶性过程治疗的患者，以及天然免疫缺陷的人，如低丙种球蛋白质血症和削弱慢性过程的患者，由于这些原因由CMV产生的肺炎可能是在任何具有降低的免疫能力的患者中的并发症。病毒起源的肺炎对抗微生物治疗没有反应。由流感病毒产生的肺炎一般影响老年人，这些老年人由于经受非感染性疾病，例如肺，心血管或肾疾病，因此其是免疫受阻抑的。在所有这些情况之下，十分有用的是依靠具有抗病毒性质和/或免疫系统刺激性质的制剂。
本发明的重要性涉及到医学领域。在这里所公开的肽的效能涉及抗病毒和抗细菌作用，此外涉及激活免疫系统并且保护宿主使之免受细菌或病毒传染。因此，来自鲎属抗LPS因子的肽31-52能够用于治疗和/或预防病毒和细菌的传染病中，以及由于危急外科手术，损伤，疾病，或有害地影响免疫系统的其它疾病所致高感染风险的患者。这种肽在治疗免疫抑制的患者中也是有用的。总之，本发明的肽可以认为是具有广谱治疗传染病能力的新的免疫系统免疫调节剂。
本发明涉及包含来自鲎属抗LPS因子蛋白质的31-52位氨基酸的肽，该蛋白质是从鲎(如Limulus polyphemus)分离的，该肽提高宿主对感染的免疫的防卫机制，但是不引起炎症反应。
这种肽显示出具有抗病毒作用，它能够在体外测定中保护细胞使之免受病毒的感染。此外，来自与肽一起培养的人类单核细胞的上清液含有特定的可溶性调节物(如IFN-γ)，它能够赋予细胞Hep-2保护性使之免受到将来病毒的感染。另一方面，这种肽在体内阻止直接感染。这些有利的性质使本发明的肽在预防和治疗感染中是有用的，因为它们仅仅有选择地激活那些对感染的初始应答起作用的免疫系统组分，而不刺激特定生化调节物的释放，这些调节物可以导致不利的副作用。该肽也没有许多免疫调节物的共有毒性。
利用固相方法可以合成本发明的肽。在水中用30％乙酸溶液提取粗的肽，冻干然后用RP-HPLC纯化。利用装有FAB注射针的JEOL JMS-HX11OHF两部分质谱仪检验纯化肽的分子量。形成的制剂是非抗原性的，非致热性的并且对于动物和人类的施用药学上是可接受的。
可以将本发明的包含来自鲎属抗LPS因子蛋白质的31-52位氨基酸的肽用作安全，有效的治疗和/或预防剂，它在人类和动物中单独地或者作为佐剂提高免疫应答。包含本文所公开的氨基酸序列的肽仅仅有选择地激活那些组分，该组分对由细菌或病毒引起的感染的初始应答起作用，而不刺激或引导免疫系统释放特定的生化介质(例如TNF，IL-1)，该介质可能导致负作用。因此，在营养不良的患者中，在经受外科和骨髓移植的患者、经受化疗或放疗的患者、中性白细胞减少症的患者、HIV-感染的患者、创伤患者、烧伤患者、具有慢性或抵抗性感染的患者中，可以将本肽用于预防或治疗由细菌或者病毒引起的传染病，所有患者可能已经削弱了其免疫系统。一般地，无免疫应答患者定义为表现出对感染病原体攻击产生正常细胞和/或体液防御上减弱的或降低的能力的人，所说的感染病原体如病毒，细菌，真菌以及原生动物。一般地，蛋白质营养不良的患者定义为血清白蛋白水平低于约每分升3.2克(g/dl)和/或非故意的重量减轻高于正常体重的10％的人。
更具体地说，本发明的方法可以用于治疗性地或预防性地治疗动物或者人，由于危急的外科，损伤，疾病，辐射或化疗，或者其它严重影响免疫系统的疾病，这些患者正处于感染的高危期。该方法对于治疗具有引起正常代谢免疫应答降低或受抑制之疾病或紊乱(如HIV感染(AIDS))的患者是有用的。例如，所说的方法可以在患者中用于预启动代谢免疫应答，该患者正在经受化疗或放疗，或者由于引起降低动员身体对感染的正常代谢反应能力之疾病，紊乱或者治疗，该患者正处于出现次级感染或手术后并发症的高危期。用所说肽的治疗已经显示出，在动员宿主正常免疫防御，从而保护所治疗的宿主免受感染上特别有效。它可以用于由非感染性疾病(如心血管和慢性疾病)丧失免疫力的老年人。人们熟知，这些人对病毒性肺炎(如流感病毒)是敏感的。它在治疗由巨细胞病毒(DMV)引起的肺炎上也是有效的，每天在免疫缺损患者(如由于器官移植用免疫抑制剂治疗的患者)中，它更重要。用这种肽的治疗在增强有创伤的患者是特别有吸引力的，或者其可以在所谓的手术后急相期进行施用，在该期间一般与引起严重后果的病毒感染有关，在该期间患者经抗微生物治疗没有好转。如在急性手术后期间，有创伤的患者的免疫应答退化，主要由于巨噬细胞活性降低和在感染期间它们丧失足够反应的能力(Berger等，临床医学学报，1995,239:121-130)。因此，在病毒或细菌源传染病中，刺激巨噬细胞功能的药剂作为免疫应答的主要调节物将是很有治疗和预防价值的。
利用所说肽治疗已经显示，它在动员宿主的正常免疫防御，增加宿主对感染的保护作用上特别有效。
在其它实施方案中，可以将本发明的肽施用给正经历免疫麻痹的患者(Randow等，实验医学杂志，1995,181:1887-1892)，免疫麻痹定义为单核细胞MHCⅡ类减少，单核细胞呈递抗原活性削弱和它们产生炎症细胞因子的能力降低。这种现象称为补偿性抗炎症反应综合症。在脓毒病晚期，单核细胞刺激是有用的，因为它使免疫麻痹患者恢复了单核细胞缺损的表型与功能。
一般地，将本发明的肽以足以产生免疫系统增强的量施用给动物或人。该肽的施用方式可以是口头，肠道，肠胃外，静脉内，皮下，腹膜内，肌内。施用组合物的方式(例如药片，胶囊，溶液，乳剂)将取决于施用的途径。施用组合物的量将决定于各自的主要成分，并且至少考虑患者感染或伤害的严重程度，患者状况或者整个健康状况，患者体重以及手术，化疗或其它高危治疗之前可利用的时间。一般来说，单剂优选地含有大约每千克体重5-10mg肽。一般来说，在有必要刺激个体免疫应答时，将本发明的组合物周期性地施用给个体。
在施用组合物期间，医学领域的技术人员将能够确定时间的长短和剂量，这将取决于患者的生理条件和所治疗的疾病或紊乱。如上所述，该组合物也可以用作预防性治疗以预启动身体动员对抗感染的正常代谢防御。
所说的肽可以用于预防和治疗由广谱细菌，真菌，病毒和原生动物病原体引起的感染。在手术前，手术期间和/或手术后，给经受手术的人预防性地施用肽都将在正常和高危患者中减少手术后感染的发生率和严重性。例如，在将经受污染或潜在污染的外科过程的患者中(例如肠胃外科，子宫切除，切开术，尿道前列腺手术)和在手术部位存在高危的患者中(例如人假器官形成，心血管外科)，用适当抗细菌剂和本发明的肽制剂的并行初始治疗都将减少感染并发症的发生率和严重性。
在不仅由疾病(例如癌，爱滋病)，而且由化疗和/或放疗引起免疫抑制的患者中，肽制剂的预防性施用将减少由广谱机会病原体(包括许多不寻常的细菌，真菌和病毒)造成感染的发生率。
在高危患者(例如，超过65岁、糖尿病、癌患者、营养不良、肾病、气肿、脱水、运动受阻等等)中，住院治疗经常与严重医院感染的高发生率相关。在确定利用呼吸器，导液管，增强护理单位，延长住院治疗等等之前，经验性地开始用这种肽制剂进行治疗来帮助阻止一般与这些过程相联系的感染。现已表明，可以用抗微生物剂和肽制剂并行治疗慢性、严重、难控制、复杂和困难的疾病，以治疗感染。
除肽之外，本发明方法所施用的组合物可以包含也可以不包含其它组分。主要通过施用该组合物的方式确定特定组合物可以包含的其它组分。例如，除肽之外，以药片形式口头施用的组合物可以包含填充物(例如乳糖)、粘合剂(例如羧甲基纤维素，胶愈合创木脂，明胶)、佐剂、调味剂、着色剂以及涂布材料(例如蜡或塑化剂)。以液态形式施用的组合物包含肽、可以包含也可以不包含乳化剂、调味剂和/或着色剂。可以将肠胃外施用的组合物混合，溶解或者乳化在水、无菌盐水、PBS、葡萄糖或其它生物学上可接受的载体中。局部施用的组合物可以配制成凝胶、软膏、洗剂、奶油以及组合物可以涂布到所治疗的面(例如创伤位置)上的其它形式。
可以局部施用包含肽制剂的组合物到创伤部位，以刺激和增强创伤的治愈和修复。其中，由于溃疡、痤疮、病毒感染、真菌感染或牙病引起的创伤可以用根据本发明的方法治疗，以便加速治愈过程。另外，可以将肽制剂注射给创伤或患病区域。除创伤修复之外，可以将该组合物用来治疗与此或病原体(引起创伤)相联系的感染(导致创伤)。局部施用的组合物可以配制成凝胶、软膏、洗剂、奶油以及组合物可以涂布到所治疗的位置(例如创伤部位)上的其它形式。用于创伤的典型剂量将从约5mg到约10mg。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含所论及的肽序列的杂合多肽，其中所说的优选的肽序列以某种方式组成更大多肽链的N-末端或C-末端，所说的方式保持其提高免疫应答的能力，并且赋予杂合多肽这种能力。一种优选的杂合多肽包括任何优选的肽和IgG重链区的融合体。
本发明也涉及以某种方式适当地暴露所论及的肽序列的支架蛋白，所说的方式保持其提高免疫应答的能力，并且赋予杂合多肽这种能力。
本文所使用的术语“支架蛋白”意指杂合多肽，该多肽在它们的多肽链之内以某种方式包含一条或多条所选择的LALF序列，所说的方式是使所插入的区段在融合蛋白质或多肽的结构中形成一个暴露的环。
利用杂合和支架多肽以及包含优选的肽序列的蛋白质可以改善体内高生命期和其它药理学参数。
同时，可以将编码肽或编码包含所说肽序列的杂合或支架蛋白的DNA序列插入适当的待体内表达的载体中，与合适的载体、稀释液、佐剂以及稳定溶液和化学品一起用于治疗目的。
本文公开的来自鲎属抗LPS因子肽的新的免疫学活性提高了哺乳动物单核细胞的非特异性防御力，并且很好地增加了它们对感染刺激作用反应的能力。另一方面，不同于许多报道的那些防御的非特异刺激物，它不会导致体温升高(例如发热)。肽制剂的这种关键性优点可以出现在调节白血细胞反应的自然轮廓方面。已经显示出，本发明的作用有选择地激活免疫应答，但是不直接刺激或者启动细胞因子(例如TNF)从单核细胞中释放，因此它与其它免疫刺激物明显不同。
下面用特定实施例阐述本发明，其目的在于描述，而不限制本发明的范围。实施例1．肽在细胞系HEP-2上的抗病毒作用借助在细胞系Hep-2上由病毒产生的抑制细胞致病作用，估价其抗病毒活性，这是确定干扰素抗病毒活性的普通方法(Famillietti等，1981，酶学方法．78:387-396)。为了这个目的，使用96孔塑料培养皿(Nunc，丹麦)。并且在MEM培养基(补充了10％的胎牛血清)中将1×105细胞培养成单层群系(24H)。第二天，将100μl样品的系列稀释液与细胞一起培养24小时，该稀释液包含数量为14和28μg/ml的来自LPS-结合蛋白的不同肽鲎属抗LPS因子31-52(LALF)，脂多糖结合蛋白86-99(LBP),18kDa的阳离子抗微生物蛋白106-128(CAP-18)和杀菌通透性增加蛋白质86-99(BPI)。然后，将细胞用盐溶液洗涤，并且用10-7pfu的Mengo病毒感染，该病毒由苏黎世大学的分子生物学研究所提供，该病毒在细胞系L929鼠成纤维细胞中增殖。在18小时后，通过固定和染色(一般用结晶紫)测量细胞破坏的程度，利用光度超微分析系统(SUMA)读出细胞致病作用。开发微型机系统的Pascal UCSD语言编程的计算机程序，用于所有的计算和校正(Ferrero等，1994，生物工程应用，第1卷)。在这种情况下，将70000 IU/ml的人类γ-IFN(MRI，冻干的人重组γ-干扰素)的梯度稀释液用作标准来确定其抗病毒活性单位。由于这个原因，由肽所显示的抗病毒保护作用与γ-IFN的国际单位(IU/ml)相关联。将来自结合内毒素的蛋白质的不同的肽用作阴性对照。将10ng/ml的LPS用作阳性对照，因为人们熟知，它诱导IFN的产生(Manthey等，1994，免疫学杂志，153:2653-2663)。将抗病毒活性的一个单位定义为能够产生50％病毒复制抑制作用的IFN的量。
结果在表1中显示。
表1．由不同来自LPS-结合蛋白的肽显示的对细胞系Hep-2的抗病毒作用
表1显示，以γ-IFN的国际单位/ml定义时，仅有肽LALF能够在细胞Hep-2中诱导抗病毒状态，其它来源于LPS结合蛋白的肽没有作用。实施例2太在细胞系MDBK上的抗病毒作用本质上如实施例1所描述的，借助于在细胞系MDBK上由病毒产生的抑制细胞致病作用测定其抗病毒活性。这种方法所利用的细胞是MDBK，一种肾正常牛细胞系[ATCC NO.6071]，它用10-7pfu的牛肠道病毒感染。使用增加量的LALF肽以在细胞中获得诱导的保护性10μM、20μM和40μM。在这种情况下，将人α-IFN 70 000IU(MRI，冻干的参考人重组α干扰素)的连续稀释液用作标准来确定其抗病毒活性单位。将一单位的抗病毒活性定义为能够产生50％病毒复制抑制作用的IFN的量。图5显示了LALF肽在细胞系MDBK中能够以剂量依赖性方式诱导其保护作用。实施例3．来自用肽鲎属抗LPS因子31-52(LALF)刺激的人单核细胞的上清液诱导HEP-2细胞系的抗病毒作用从健康志愿者中获得静脉血液，并且进行Ficoll-Hypaque离心，分级分离单核细胞。洗涤单核细胞，并且在无内毒素RPMI1640培养基(补充了10％胎牛血清)中重悬浮。将2×106个细胞等分在24孔滴定板(Nunc，丹麦)中。然后，在37℃,5％CO2中将这些细胞与14或28μl/ml不同的肽一起培养18小时鲎属抗LPS因子31-52(LALF)，脂多糖结合蛋白86-99(LBP)和18kDa阳离子抗微生物蛋白106-128(CAP-18)。在3000rpm下将这些细胞离心5min，然后利用实施例2所描述的方法分析上清液系列稀释液和其抗病毒活性。
表2总结了结果。仅仅用作人外周血单核细胞刺激物的LALF肽诱导它们释放某些能够赋予Hep-2细胞抗病毒感染的保护作用的调节物。
表2．来自用肽鲎属抗LPS因子31-52(LALF)刺激的人单核细胞上清液能够诱导HEP-2细胞系的抗病毒作用
实施例4来自与肽一起培养的人单核细胞的TNFα的体外刺激作用的缺乏从健康志愿者中获得静脉血液，并且进行Ficoll-Hypaque离心，分级分离单核细胞。洗涤单核细胞，并且在无内毒素RPMI1640培养基(补充了10％胎牛血清)中重悬浮。将30×106个细胞等分在滴定板p-60(Nunc，丹麦)中。在37℃,5％CO2中将这些细胞与14或28μl/ml LALF一起培养18小时，然后在3000rpm离心5min。在上清液中由特异性酶连结免疫吸附剂测定(ELISA)确定TNFα的合成，ELISA由Dr.W.Buurman(Maastrich医科大学，荷兰)友好提供。
表3结果了结果。用作刺激物的LALF肽仅在14-28μl/ml剂量下不诱导超过对照缓冲液处理的细胞的增加的TNFα水平。
表3由来自LPS-结合蛋白的各种肽刺激的人单核细胞的TNFα的合成
1该值是三个供体的平均值。实施例5小鼠中对感染的体内保护作用开发小鼠BaIB/c爆发性革兰氏阴性腹膜脓毒病模型，以确定在保护免疫性完整宿主免受严重感染中LALF肽的功效的特征。在进行感染攻击前20小时，给小鼠腹膜内注射LALF肽(14μg/0.1ml)或盐水(0.1ml)(作为对照)。为了引起实验性腹膜炎，使用产生总死亡率约90％的Pseudomona aeruginosa的剂量(2×108个细菌/只小鼠)(Browder等，1987，外科学，102:206-214)。在细菌攻击后，在120小时期间每24小时计数幸存的小鼠。由统计试验Kaplan-Meyer分析生存的数据，利用远程序试验进行显著性分析，表5。在时间0,20,40,60,90,120,180,240 min下在对照组和肽处理的小鼠中从眼窝后的窦收集血液供TNF-α定量测定。利用特异性ELISA(由Dr.W.Buurman(Maastrich医科大学，荷兰)友好提供)测定小鼠血清中TNF-α的浓度。图4。
表5在革兰氏阴性腹膜脓毒病的小鼠模型中LALF肽对存活的预防作用<
当进行预防施用时，该肽保护小鼠使之免受致死细菌攻击。所观察到的保护作用归因于肽对宿主免疫应答的调节活性。这种作用引起图4的促炎细胞因子TNF的减少。在脓毒病作为全身性促炎调节物释放的结果期间，这种能力可以削弱所观察的致死作用。实施例6在体内LALF肽是无毒的并且不影响TNF-α的水平在6-8龄之间小鼠BalB/c中实施这种方法。给这种小鼠静脉注射在0.1ml中的50μg[2.5mg/kg体重]肽或者盐溶液(作为对照)。在24小时期间每4小时观察动物的行为。存活一周。在时间0h,6h,24h和48h在对照组和肽处理的小鼠中从眼窝后的窦收集血液用于TNF-α定量测定。用特异性ELISA(由Dr.W.Buurman(Maastrich医科大学，荷兰)友好提供)测定小鼠血清中TNF-α的浓度。所有的小鼠[每组10只]幸存超过一周。在体内LALF肽是无毒的，并且不刺激TNF-α产生，图3。实施例7在激活的腹膜巨噬细胞中LALF-衍生太对免疫应答的调节作用。
从Balb/c中获得腹膜来源的细胞(CENPALAB,Hauana，古巴)。在腹膜内注射1ml的4％布鲁尔氏thioglicollate肉汤4天后从腹膜沟收集原代小鼠巨噬细胞。在37℃下5％ CO2/96％空气中，将细胞保持在RPMI(补充了10％热非激活胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，200单位/ml青霉素以及200μg/ml链霉素)中。
测定NO2-的分泌(Jin,F29,Nathan,C,Radzioch,D,和Ding,A.细胞，1997,88:417-426)。将细胞平板接种在96-孔平板(有200μl培养基)中，并且在37℃下培养2h，然后，用PBS重复洗涤除去非粘附细胞。将巨噬细胞与5μM的LALF肽一起预培养18小时，随后用RPMI培养基洗涤以除去肽。然后，将巨噬细胞用大肠杆菌0111:B4,Sigma(1μg/ml)的LPS处理72 hr。通过MTT的线粒体依赖性还原成formazan来评估细胞生存力(Szabo30,C,Mitchell,JA,Gross,SS,Thiemermann,C.和Vane,JR，药物实验治疗杂志，1992,265:674-80)。将50μl培养基与等体积的Greiss试剂(1％磺胺，0.1％萘乙烯亚胺二氢氯化物，2.5％H3PO4)混合。在微量培养板读数器(SUMA)中以亚硝酸钠作为标准记录在540nm处的吸光度(Green26,LC,Wagner,DA,Glogowski,J等，生物化学分析1982,126:131-8)。扣除同样培养的无细胞培养基的亚硝酸盐含量。
TNF-α测定将细胞平板接种在96-孔的平板的200μl培养基(2×106个细胞/m))中，并且在37℃下培养2h。用PBS进行重复洗涤除去非粘附细胞。用5μM的LALF肽与巨噬细胞一起预培养18小时，然后用RPMI培养基洗涤以除去肽。然后，用大肠杆菌0111::B4,Sigma(1μg/ml)的LPS处理巨噬细胞。在培养1h、2h、4h、6h以及24h的细胞上清液中利用ELISA试剂盒(由Dr.W.Buurman(Maastrich医科大学，荷兰)友好提供)测定TNF-α。
如图6所显示的，在肽处理的巨噬细胞中，TNF水平是下调的。相反，NO产生是上调的，图7。在测定期间细胞的生存力没有影响。从来没有发现生存力低于98％。
它似乎是LPS-引起的应答的优选而特定的调节作用。
总之，在宿主中可能肽介导某些与免疫系统细胞的相互作用，并导致能够提高和/或调节免疫应答的免疫调节作用。实施例8用LALF-衍生肽刺激PBMC，利用核糖核酸酶保护性测定(RPA)分析细胞因子的基因表达核糖核酸酶保护性测定(RPA)用于检测、定量以及鉴定RNA分子是高度敏感和特异性的方法(Gilman32,M.分子生物学的当前方案，J.Wiley和Sons,纽约，P.4.7.1-4.7.8.1988和Dent 33,A.L.,Shaffer,A.L.,Yu X.,Allman,D.,Staudt,L.M.,1997.细胞因子表达和由BcI-2形成生发中心，科学，276:589-592)。利用hck-l探针模板组(Cat.No.45031P)通过PharMingensRiboQuantTM多探针核糖核酸酶保护测定系统分析来自受刺激的和非刺激的人PBMC总RNA样品的不同的mRNA物种，它包括不同细胞因子(如IL-5,IL-4,IL-10,IL-15,IL-9,IL-2,IL-13,IFN-γ)的mRNA物种分析。
简言之，将一种高特异性活性的[32P]-标记反义细胞因子RNA探针组[hck-1,Cat.No.45031P]与样品靶RNA(来自与5μM肽一起培养18小时的PBMC)进行过分杂交。用RNA酶消化游离探针和其它单链RNA分子，而保护退火的探针靶RNA双链体，使其免受RNA酶消化。纯化这些余下的RNA酶保护的探针，根据它们的大小在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并且放射自显影术进行成像。然后，以保护的探针片段区带适当大小所给出的信号强度为基础，可以在原RNA样品中确定每个mRNA物种的特性和数量。在原样品中为了确定和定量RNA分子，渗入非保护的探针组和持家(housekeeping)基因转录物探针。此外，对于其它特性，参见Hot-Lines(PharMingen)，第3卷，第1期，第1页，1997或者PharMingen RiboQuaniTM多探针RNA酶保护测定系统，使用手册，第四版，1997,8。
利用RNA分离的单步方法通过AGPC抽提获得总RNA(Chomczynski34等，1987，分析生物化学，162:156-159)。
为了测定LALF肽制剂中内毒素污染，表6显示LALF肽制剂不含有内毒素污染物。
如图8所显示的，该肽在人PBMC中能够优选地诱导IFN-γ,IL-2和IL-13基因表达。IFN-γ的表达和随后释放可能是负责来自与该肽一起培养的PBMC的上清液观察到的抗病毒性质。此外，这种典型的Th-1应答(其特征在于产生IL-2和IFN-γ)在小鼠中P.aeruginosa感染期间可以校正该肽的保护作用。因为已经报道，在大鼠慢性P.aeruginosa感染中IFN-γ降低了炎症反应(H.K.Johansen 35,H.P.Hougen,J.Rygaard和N.Hoiby.临床实验免疫学，1996,103:212-218)。此外，已经发现，用IFN-γ治疗影响细胞介导反应，并且抗隐球菌病(Joly 36 V,Saint-Julien L,Carbon C,Yeni P,传染病杂志，1994；170:1331-4)、弓形虫微生子(Benedetto37N,AuriaultC,Darcy F等，Eur Cytokine Net,1991；2:107-14)和肺炎克氏杆菌(Hagen36TLM,Vianen von W,Bakker-Woudenberg IAJM.传染病杂志，1995；171:385-92)已体内说明治疗潜能。我们在这里显示，LALF-衍生的肽能够产生免疫系统增强作用，并且也可以用于预防或治疗由广谱病原体引起的传染病。此外，可以用于免疫系统低下的患者。
统计方法。将图和表中所有的值以平均值±SD表示。
通过用Kruskal Wallls试验完成统计分析，通过Dunn试验确定各组间的不同。将低于0.05的P值假定为是显著的，BRIEF


图1显示用于限定本文所公开的活性的肽LALF的序列。
图2显示LALF肽的RP-HPLC层析纯化。峰A:98％纯度的肽的洗脱峰。
图3显示血清TNF水平随时间的变化，从静脉输注盐溶液或者50μg的LALF肽的小鼠取得。
图4在LALF-衍生肽处理的小鼠与对照小鼠中TNF的全身水平的比较。给8周龄小鼠i.p.注射0.1ml盐水(含14μg肽或者仅有盐水)。二十小时后，给小鼠i.p.注射致死剂量的P.aeruginosa。在攻击0、20、40、60、90、120、180和240min后，小鼠从后眼窝窦放血，并且测量TNF的血清浓度。
图5显示LALF肽在细胞系MDBK上的抗病毒性质。在18小时期间用增加量的肽处理细胞。然后，将细胞用牛肠道病毒攻击。将抗病毒活性表示为α-IFN的U/ml。
图6在受刺激的腹膜巨噬细胞中LALF衍生肽对TNF-α产生的调节作用。在18小时期间用5μM的LALF预处理巨噬细胞处理，然后用1μg大肠杆菌LPS将细胞活化。在不同的时间测量细胞培养上清液中的TNF-α。
图7在受刺激的腹膜巨噬细胞中LALF衍生肽对NO产生的调作用。在18小时期间用5μM的LALF处理该巨噬细胞，然后用1μg大肠杆菌LPS将细胞活化72h。利用Greiss方法，在细胞培养的上清液中测量NO的水平。
图8用hck-1探针模板组(Cat.No.45031P)通过PharMingens RiboQuant多探针核糖核酸酶保护性测定系统，分析用5μM肽刺激18小时的人类PBMC的总RNA样品的不同mRNA物种。这种分析的放射自显影图显示作为未保护的探针组的hck-1(泳道1)。也显示与下列杂交的对应的RNA酶保护的探针从非刺激的PBMC分离总RNA(泳道2)和从在18小时期间用5μM的LALF刺激的PBMC分离的总RNA(泳道3)。参考文献1．Morrison和Ulevitch，美国病理学杂志，93:527(1978)。
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权利要求
1．一种肽或蛋白质的免疫学活性，该肽或蛋白质包含鲎(Limuluspolyphemus)抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸，其特征在于在体内和体外增加人或动物宿主的抗病毒防卫机制。
2．按照权利要求1的包含鲎抗LPS蛋白质因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白质的抗病毒活性，其特征在于在人或动物中阻止或避免病毒感染。
3．一种具有按照权利要求1和2的抗病毒性质或特征的药物制剂，其特征在于包含具有鲎抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白质。
4．一种具有按照权利要求1,2和3的抗病毒性质或特征的药物制剂，其特征在于包含具有在人或动物中利用的鲎抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白质。
5．一种用于预防或治疗病毒感染的方法，其特征在于给人或动物施用按照权利要求3和4的药物制剂。
6．按照权利要求5的方法，其中所说的人或动物由于重要的外科手术而处于病毒感染风险中。
7．按照权利要求5的方法，其中所说的人或动物是免疫抑制的并且处于病毒感染的风险中。
8．一种产生具有按照权利要求1,2和3的抗病毒特征或性质的细胞培养物或衍生物的上清液的方法，其特征在于施用包含具有鲎抗LPS因子(LALF)的31-52位氨基酸的肽或蛋白质或者分离的肽或蛋白质的制剂。
9．按照权利要求8的药物制剂，其特征在于包含具有抗病毒特征或性质的细胞培养物或其衍生物的上清液。
10．一种按照权利要求8和9的在人或动物中用于预防或治疗病毒感染的方法，其特征在于施用包含具有抗病毒特征或性质的细胞培养物或其衍生物的上清液的药物组合物。
11．按照权利要求1,2或3之任一的肽或蛋白质，其中的主链已经由类似主链的有机实体取代。
12．按照权利要求4,5或6之任一的肽或蛋白质，其中的主链已经由类似主链的有机实体取代。
13．按照权利要求7,8或9之任一的肽或蛋白质，其中的主链已经由类似主链的有机实体取代。
14．按照权利要求1,2,3或4之任一的线型多肽。
15．按照权利要求5,6或7之任一的线型多肽。
16．按照权利要求8,9或10之任一的线型多肽。
17．一种具有如权利要求1,2,3或4所描述的活性的重组载体，该载体包含编码肽LALF31-52的DNA序列。
18．一种具有如权利要求5,6或7所描述的活性的重组载体，该载体包含编码肽LALF31-52的DNA序列。
19．一种具有如权利要求8,9或10所描述的活性的重组载体，该载体包含编码肽LALF31-52的DNA序列。
20．按照权利要求1的药物组合物在用于治疗慢性感染、风湿性关节炎和风湿性紊乱的方法中的用途。
21．按照权利要求8或9的药物组合物在用于治疗慢性感染、风湿性关节炎和风湿性紊乱的中的用途。
22．按照权利要求1,2,3或4的药物组合物在病毒疫苗中作为佐剂的用途。
23．按照权利要求5,6或7的药物组合物在病毒疫苗中作为佐剂的用途。
24．按照权利要求8,9或10的药物组合物在病毒疫苗中作为佐剂的用途。
全文摘要
本发明涉及一种来自鲎属(Limulus)抗LPS因子蛋白质之肽的新免疫学作用。该免疫学作用是:(1)在Hep－2和MDBK细胞系中诱导抗病毒状态,(2)借助IFN－γ,来自用肽鲎属抗LPS因子(LALF)刺激的人单核细胞上清液能够诱导Hep－2细胞系的抗病毒作用,(3)LALF肽能够在体外和体内调节免疫应答。本发明可以用于人类与动物的治疗性和/或预防性治疗,以提高它们的免疫应答,而不刺激某些生化调节物(例如TNF－α)的产生,所说的调节物可以导致有害作用,如发热和发炎。
文档编号A61P31/12GK1218057SQ98124538
公开日1999年6月2日 申请日期1998年9月29日 优先权日1997年9月29日
发明者马里韦尔·格雷拉·巴列斯皮, 曼努埃尔·德赫苏斯·阿拉纳·罗塞恩斯 申请人:遗传和生物技术工程中心