专利名称：致癌基因或病毒受控表达系统的利记博彩app
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本发明涉及表达效应基因的核酸构建体，该核酸构建体包含控制转录因子基因(组分b)(也包含在该核酸构建体中)表达的启动子Ⅰ(组分a)，并且包含转录因子基因的基因产物特异地与之结合并可控制效应基因(组分d)(也包含在该核酸构建体中)表达的启动子Ⅱ(组分c)，其中转录因子基因的基因产物活性取决于一种或多种细胞调节蛋白，这些蛋白质与该基因产物特异地结合并影响其活性。Ⅰ．引言在很大程度上尚未得到适宜解决的、基因治疗中的问题是以细胞特异性方式控制效应基因的表达的问题，尤其是在病变的细胞中或以其它方式改变的细胞中。本发明包含实现这种控制的新方法。它基于以下的发现(Werness等，科学，248,76(1990))在退化细胞中，调节蛋白出现某种方式的改变或变小，以致于它们不再能与它们的附属相伴分子结合并相互作用，或者与它们的附属相伴分子或其他的相伴分子一起获得新的结合特性。
新方法还基于以下的发现成视网膜细胞瘤蛋白质，例如能够结合到E2F转录因子的活化区上，并因此抑制它的活性(Flemington等，PNASUSA 90,69 14(1993))。
这一性质的调节蛋白基因已用于寻求该调节蛋白的抑制剂或者刺激物的表达系统(例如WO95/19367,WO95/14777,WO97/04092)。
另外，具有第一载体(表达肿瘤抑制蛋白)和第二载体(表达与肿瘤抑制蛋白结合并抑制其活性的蛋白质)的载体系统已经公开(WO95/16771)。将两个载体引入同一细胞。通过使两个载体结合，在细胞增殖没有受到肿瘤抑制蛋白抑制的细胞中能够产生编码肿瘤抑制蛋白的载体。
此外，在WO97/12970中公开了表达系统，其中的第一种基因的表达由第一启动子控制，其功能在非肿瘤细胞中受抑制，而第二个基因的表达(其表达产物抑制第一种基因在非肿瘤细胞中的表达)由在非肿瘤细胞中正调节的第二启动子控制。
本发明现涉及一种新颖、简单的表达系统，其仅在调节蛋白以变小或改变形式出现的细胞中就可以活化。由此激活表达系统所编码的效应基因转录。效应基因的表达产物本身或与另一种药物活性化合物相结合具有预防或治疗作用。Ⅱ．本发明的一般描述按照本发明的表达系统是一种核酸构建体，该核酸构建体的表达由致癌基因或病毒通过改变或者影响调节蛋白来控制，并且在最简单情况下，该核酸构建体含有下列组分a)至少一种活化序列(启动子单位Ⅰ)b)至少一种转录因子基因，其转录由组分a)控制c)至少一种另外的活化序列(启动子单位Ⅱ)，其通过与转录因子(由组分b)编码)结合来控制组分d)的表达d)至少一种效应基因。
个体组分的排列通过图1中的例子描述。
按照本发明，上述核酸构建体的两种具体实施方案将得到区别1)实施方案A)这一实施方案以具有下列性质的组分为特征组分a)-至少一种活化序列(Ⅰ号启动子)组分b)-至少一种转录因子基因，其包含具有以下组分的融合蛋白质·组分b1)转录因子的至少一个活化区·组分b2)调节蛋白的结合蛋白的至少一种结合序列·组分b3)转录因子的至少一个DNA结合区组分c)-至少一种活化序列(Ⅱ号启动子)，其通过与转录因子(由组分b)所编码)结合而得到活化组分d)-至少一种效应基因。
个体组分的排列通过图2中的例子描述。按照本发明，表达系统的功能的先决条件是组分b2)恰好在组分b1)和b3)之间或之上，这样调节蛋白与组分b2的结合就抑制了活化区(组分b1)和/或DNA结合区(组分b3)的功能。在正常的细胞中，即当调节蛋白有正常功能时，这一抑制作用导致效应基因表达受抑制。在退化或受感染细胞(其中的调节蛋白被改变或复合以致它不再能够与附属结合蛋白相互作用，或者不再存在或者仅以最小程度存在)中，这一抑制作用缺少，以致转录因子(组分b)能够以不受阻碍方式激活活化序列(组分c)并因此开始效应基因的转录。
效应基因的转录由活化序列[组分a)]的激活开始，结果产生转录因子[组分b)]基因的表达。转录因子[组分b)]反过来结合在活化序列[组分c)]上，这一结合引起了效应基因[组分d)]的表达。
在本发明的具体实施方案中，组分a)与组分c)相同。在这一具体实施方案中，活化序列[启动子Ⅰ，组分a)]的轻度激活引起转录因子[组分b)]的表达，这一表达激活了两个活化序列[启动子Ⅰ，组分a)]和[启动子Ⅱ，组分c)]，并由此引起效应基因[组分d)]的表达和增加转录因子[组分b)]的表达，因而再一次增加了效应基因[组分d)]的表达。2)实施方案B)这一实施方案以具有下列性质的组分为特征组分a′)-至少一种活化序列(启动子Ⅰ)，其包含·组分a1)调节蛋白的至少一种DNA结合序列·组分a2)至少一种基础启动子，该启动子具有调节蛋白与组分a1)(激活组分a2))的结合组分b′)-至少一种转录因子的基因，该转录因子充当阻抑物，其表达由组分a′)诱导组分c′)-至少一种活化序列(启动子Ⅱ)，其包含·组分c1)至少一种用于诱导组分d)转录的活化序列，以及·组分c2)至少一种用于结合阻抑物(组分b′)的DNA序列，其中该结合抑制了下游效应基因(组分d)的转录的活化。
组分d)-一种效应基因。
实施方案B)中组分的排列如图3所描述。
按照实施方案B)的表达系统按照本发明起作用的前提是在正常细胞中，细胞调节蛋白与启动子单位Ⅰ的组分a′)的结合诱导阻抑物基因(组分b′)的转录，以及所表达的阻抑物结合到启动子单位Ⅱ的组分c2)上，并由此由启动子单位Ⅱ抑制结构基因(组分d)的转录的活化。
在退化或受感染细胞(其中的调节蛋白被改变或复合以致它不再能够结合到启动子单位Ⅰ中的DNA结合序列(组分a1)上，或者不再存在或者仅以轻微程度存在)中，没有用作阻抑物的基因的表达，因而也没有新的核酸构建体的表达的抑制。
在新核酸构建体的实施方案B)中，这些退化或受感染细胞中的效应基因(组分d)的转录由激活启动子单位Ⅱ的活化序列(组分c1)开始。
这一表达系统可以伸展在实施方案A)和B)中-通过将效应基因[组分d)、d′)、d″)]的几个完全相同或不同的序列连接在一起，这些效应基因在每一情况下都是通过完全相同或不同的IRES序列或活化序列[组分c′)和组分c″)]来相互连接。
在实施方案A)中-通过将转录因子[组分b)]的几个完全相同或不同的序列连接在一起，这些转录因子在每一情况下都是通过完全相同或不同的IRES序列或活化序列[组分a)和组分c)]来相互连接。
当不同的转录因子基因连接在一起时，就要选择含有能与转录因子[组分b)]结合的核酸序列的活化序列。
取决于活化序列[组分a)或c1]的选择，新的核酸构建体可用于非特异性地、细胞特异性地或病毒特异性地、或者在具体的代谢条件下或者细胞周期特异性地表达效应基因[组分d)]。就其本身来说，效应基因是一种编码药理活性化合物或者酶(可将药物的无活性前体切割成活性药物)的基因。例如，可以选择效应基因，以便使上述活性化合物或酶与配体一起作为融合蛋白质表达，并且这一配体结合到细胞(例如内皮细胞、肿瘤细胞或者白细胞)的表面上。
新的核酸构建体优选由DNA组成。术语″核酸构建体″意指由核酸组成的并可在靶细胞中转录的人工结构。它们优选插入到载体中，特别优选是插入到质粒载体或者病毒载体中。
适当地插入到载体中的核酸构建体可施用于患者以便预防或治疗疾病。用药方法是通过口服、局部或者通过注射或输注来实现。
本发明也涉及含有新核酸构建体的哺乳动物细胞。在特别优选的实施方案中，将核酸构建体引入细胞系中，该细胞系在转染之后能够作为新表达系统的载体用于表达效应基因。这种细胞可用于为患者制备药物。另外，细胞或者细胞系(例如新核酸构建体已引入其中的肿瘤细胞、免疫细胞或者内皮细胞)可以通过局部或非肠道途径(例如静脉注射、动脉注射、注入体腔或器官)施用于患者，或者可以皮下注射。
因此上述新核酸构建体的优选用途在于对疾病的预防或者治疗，本发明包括核酸构建体向靶细胞中的体外插入，靶细胞中的药物的非特异性、病毒特异性、靶细胞特异性、代谢特异性和/或细胞周期特异性表达，以及靶细胞向患者的局部或肠胃外施用，或者上述核酸构建体向患者(上述核酸构建体体内插入到靶细胞中)的其他局部或肠胃外施用。
新核酸构建体不会天然地以这种形式出现，即活性化合物或酶或者配体活性化合物或配体酶融合蛋白质的效应基因并非天然地与核酸序列(包含于新核酸构建体中)结合。
优选的效应基因(按照本发明掺入表达系统中)编码一种药理活性化合物。该活性化合物由蛋白质和糖蛋白构成，该蛋白质和糖蛋白选自以下物质组成的组细胞因子，生长因子，细胞因子或生长因子的受体，抗体或者抗体片段，具有抗增殖或抑制细胞作用的蛋白质，具有细胞编程性死亡或抗细胞编程性死亡作用的蛋白质，肿瘤抗原，血管生成抑制剂，诱导血栓症的蛋白质，凝固抑制剂，具有纤维蛋白分解作用的蛋白质，血浆蛋白质，活化补体的蛋白质，病毒和细菌的包膜物质，激素，对循环有影响的肽，神经肽，酶，传递介质，天然生成的、未改变的调节蛋白和核糖酶，或对基因表达有抑制效应的(反义)核糖核苷酸。
转基因优选是一种编码一种使mRNA失活的核糖酶的效应基因，所说的mRNA编码一种蛋白质，该蛋白质选自由细胞周期控制蛋白质(尤其是细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、E2F1-5、cdc2、cdc25C或DP1)、或者病毒蛋白或者细胞因子或生长因子或它们的受体组成的组中。
在另一实施方案中，效应基因可编码配体活性化合物融合蛋白质，其中上述配体可能是一种抗体、抗体片段、细胞因子、生长因子、粘着分子或者肽激素以及将要成为药理活性化合物(如上所述)的化合物、或者酶。例如，效应基因可以编码配体酶融合蛋白质，其中的酶把药物前体切割成为药物并且上述配体结合到细胞表面上(优选结合到内皮细胞或肿瘤细胞表面上)。Ⅲ．实施方案A)的具体特性的详细描述1)组分b)1.1)调节蛋白[组分b2)]的结合序列调节蛋白的大量细胞结合蛋白已经得到描述[Zwicker和Muller，细胞周期研究进展，1:91(1995)；Boulikas等，Int.J.Oncol.6:271(1995)；Pawson，自然，373:573(1995)；Cotter,Leuk.Lymph.18:231(1995)；Hesketh,Oncogene Facts Book Acad.Press,ISBN0-12-344550-7(1995)；Miller和Sarver,Nature Med.3:389(1997)]。
与本发明意义相符的结合蛋白或它们的结合序列尤其是那些调节蛋白的结合蛋白或他们的结合序列，该调节蛋白在病变细胞中仅得到轻微程度的表达，其与结合序列的结合受到抑制，其不以自由形式存在或者仅以很小程度出现(这是因为结合序列的过量)，或者其功能以其它方式(例如通过突变)减弱或者改变。
这些调节蛋白包括，例如由肿瘤抑制基因表达的蛋白质。
这一性质的调节蛋白的选择(并不限制本发明)和它们的附属结合蛋白以及后者的结合序列列在下列例子中调节蛋白组分b2)(具有调节蛋白的结合序列的细胞结合蛋白质)p53 MDM-2pRb ·转录因子E2F,-1,-2,-3·细胞周期蛋白-D1,D2,-D3，或-C·细胞周期蛋白-A,-E·转录因子PU.1·转录因子Elf-1p130·转录因子E2F-5·细胞周期蛋白A,-EMax ·MycMAD ·MycVHL ·延长蛋白(Elongin)C,-Bcdk4p14,p15,p16,p18,p27,p57,p21MTS-1(p16) ·cdk4WT-1·p53SMAD2(MADR2)·DPC4DPC-4 ·SMAD2β-连环蛋白 ·LEF-1LEF-1 ·β-连环蛋白在本发明的一个具体实施方案中，组分b2)是调节蛋白的非细胞特异性结合蛋白质的一种结合序列。这种非细胞特异性结合序列可以来源于，例如病毒性、细菌性或者寄生性源。
利用这种非细胞特异性结合序列使组分b)的功能在正常细胞中受到抑制(通过附属调节蛋白结合到组分b2)上)成为可能。然而，在受感染细胞中，附属调节蛋白在很大程度上是结合态的，这是由于各自的感染试剂胞内产生包含结合蛋白的结合序列所致。因此组分b)在这些细胞中呈自由态并具功能性。
在本发明另一具体实施方案中，组分b2)是一种具有调节蛋白的结合序列(VH和VL)的抗体或其部分。
非细胞特异性结合序列的选择(并不限制本发明)列在下列例子中调节蛋白组分b2)(具有调节蛋白的结合序列的病毒结合蛋白)p53 ·CMV的IE 84(Speir等，科学，265,391(1994)·AV的E1B(55Kd)(Sarnow等，细胞，28,387(1982)；Liu等，ColdSpring Harbor Symp.On Quantitative Biol.LⅨ,215(1995))·EBV的EBNA-5(Szekely等，PNAS USA 90,5455(1993))·EBV的BHFR1(Theodorakis等，致癌基因，12,1707(1996))·HPV-16或-18的E6(Dyson等，科学，243,934(1989)；Howes等，Genes Dev.8,1300(1994))·HBV的HBX蛋白质(Wang等，PNAS USA 91,2230(1994))·SV40的T抗原(Lane等，自然，278,261(1979)；Linzer等，细胞，17,43(1979))pRb ·AV的E1A(Nevins Science 258,424(1992))·EBV的EBNA-2·EBV的EBNA-1或-5·HPV的E7·SV40的T抗原p130 ·AV的E1A(Li等，Genes Dev.7,2366(1993))CBF-1(RBP-JK) ·EBV的EBNA-2(Zimber-Strobl等，EMBO J.13,4973(1994))NF-Kappa B·HIV的Tax(Suzuki等，致癌基因，9,3099(1994))Lyn-酪氨酸激酶·EBV的LMP-1·EBV的LMP-2A或LMP-2Bbak ·AV的E1B(16Kd)(Farrow等，自然，374,731(1995))bar ·Av的E1B(19kD)(Han等，Genes Dev.10,461(1996))调节蛋白 具有调节蛋白的结合序列(VH,VL)的抗体或抗体片段p53 特异于非突变结合区的单克隆抗体(Legros等，致癌基因，9,2071(1994)；9,3689(1994)；Hupp等，细胞，71,875(1992)；Abarzna等，癌研究，55,3490(1995)；Bonsing等，血细胞计数，28,11(1997)；Thomas等，J.
Clin.Path.50,143(1997)；Jannot等，BBRC230,242(1997))pRb ·特异于活性(非磷酸化的)pRb的单克隆抗体
(Hu等，分子细胞生物学，11,5792(1991))选择抗体时，抗体的表位结合部分FVL FVH优选作为组分b2)使用，其中如果组分b2)是鼠源的，那么它们呈人源化形式。人源化以Winter等(自然，349,293(1991))和Hoogenbooms等(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993))所描述的方式实现。按照现有技术水平制备抗体片段，例如以Winter等(自然，349,293(1991))、Hoogenbooms等(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993)；Girol.Mol.Immunol.28,1379(1991))或者Huston等(Int.Rev.Immunol.10,195(1993))所描述的方式制备。抗体、抗体片段以及重组抗体片段的制备在DE196 49645.4专利申请中有详尽的描述。
重组抗体片段直接从现有的杂交瘤制备，或者利用″噬菌体显示″技术从鼠或人抗体片段文库中分离(Winter等，Annu.Rev.Immunol.12,433(1994))。随后这些抗体片段在遗传水平上直接用于与组分b1)和b3)偶联。
为了从杂交瘤制备重组抗体片段，编码抗体的抗原结合区(VH,VL)的遗传信息通过分离mRNA、反转录RNA成为cDNA、其后借助于聚合酶链反应扩增低聚核苷酸(分别互补于可变片段的5′-和3′末端)。然后将得到的DNA片段(编码VH与VL片段)克隆进入细菌表达载体中，因此使例如Fv片段、单链Fv片段(seFv)或者Fab片段的表达成为可能。
新的抗体片段可利用″噬菌体显示″技术直接从鼠源或人源抗体文库(免疫文库，天然文库)中分离。在抗体片段的噬菌体显示中，抗原结合区基因被克隆(由于基因与丝状噬菌体的g3P外被蛋白的基因融合)进入噬菌体基因组或者以scFv片段基因形式或作为Fab片段基因进入噬粒载体。抗原结合噬菌体在装载抗原的塑料容器(淘选)上、在结合抗原的顺磁″小珠″上或者通过结合到细胞表面上进行选择。
通过由PCR扩增来源于免疫动物或者患者的B淋巴细胞的可变抗体片段的基因，可制备免疫文库。为此，利用低聚核苷酸(特异于鼠或人的免疫球蛋白或者人的免疫球蛋白基因家族)的组合。
通过利用非免疫供体作为免疫球蛋白基因的来源可制备天然文库。此外，免疫球蛋白种系基因可用来制备半合成抗体的所有组成成分，其中通过利用简并引物的PCR扩增可变片段的互补决定区3。与免疫文库相比较，这些所谓的单罐文库具有可从单一文库中分离出抗许多抗原的抗体片段的优点。
借助于噬菌体显示技术可进一步增加抗体片段的亲和性，其中新文库由现有的抗体片段制备，该制备方法借助于随机的、基于密码子的或位点定向诱变，通过用那些来源于原初所有组成成分的片段改组个体区的链，或者通过利用细菌增变菌株，并且具有改善性质的抗体片段在严格条件下由再选择分离得到。此外，鼠抗体片段可由可变区(具有人所有组成成分)之一的逐步置换以及随后的利用原始抗原的选择(“指导选择”)人源化。此外，通过人抗体(具有与原始鼠抗体的对应区)的高变区的定向置换使鼠抗体人源化。1.2)活化区[组分b1)]和DNA结合区[组分b3)]在本发明的意义范围内，转录因子的活化区和DNA结合区的所有有效基因都可用于组分b)中。例子(其描述并非有意限制本发明)是-活化区[组分b1)]至少一种序列·属于HSV1-VP16的酸性反式活化区(TAD)(氨基酸406-488；Trjezenberg等，Genes Developm.2:718(1988)；Triezenberg,Curr.Opin.Gen.Developm.5:190(1995)或者氨基酸，413-490；Regier等，美国国家科学院院报，90,883(1993))的cDNA或者·属于Oct 2的活化区(氨基酸438-479；Tanaka等，分子细胞生物学，14:6046(1994)或者氨基酸3-154；Das等，自然，374:657(1995))或者·属于SP1的活化区(氨基酸340-485；Courey和Tijan，细胞55,887(1988))或者·属于NFY的活化区(氨基酸1-233；Li等，生物化学杂志267,8984(1992)；Van Hujisduijnen等，EMBO J.9,3119(1990)；Sinha等，生物化学杂志，92,1624(1995)；Coustry等，生物化学杂志，270,468(1995))或者·属于ITF2的活化区(氨基酸2-452；Seipel等，EMBO J.13,4961,1992)或者·属于C-Myc的活化区(氨基酸1-262；Filers等)或者·属于CTF的活化区(氨基酸399-499；Mermod等，细胞58,741(1989)；Das和Herr，自然374,657(1995))-DNA结合区[组分b3)]至少一种序列·属于Gal4蛋白质的DNA结合区(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10:2916(1990))的cDNA或者·属于LexA蛋白质(氨基酸1-81,Kim等，科学255:203(1992))或者整个LexA蛋白质(氨基酸1-202；Brent等，细胞43:729(1985))或者·属于lac阻抑(lacⅠ)蛋白质(Brown等，细胞49:603(1987)；Fuerst等，PNAS USA 86:2549(1989))或者·属于四环素阻抑(tet R)蛋白质(Gossen等，PNAS USA 89；5547(1992)；Dingermann等，EMBO J.11:1487(1992))或者·属于ZFHD1蛋白质(Pomerantz等，科学267:93(1995))。
在本发明的意义范围内，增加核定位信号(NLS)至DNA结合区的3′末端是有利的。2)可由组分b)活化的活化序列启动子单位Ⅱ[组分c)]这一活化序列的选择取决于转录因子[组分b)]的基因中的DNA结合区[组分b3)]的选择。
反过来，下列可能性是存在的，例如对于在1.2中列出的DNA结合区的例子2.1)可能性A)-活化序列包含Gal4蛋白质的至少一种结合序列[核苷酸序列5′-CGGACAACTGTT GACCG-3′](SEQ ID NO.:1)(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10,2916(1990))并(在其3′末端上)增加·SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed),DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或者·C-fos的启动子(Das等，自然，374,657(1995))或者·U2 sn RNA启动子或者·HSV TK的启动子(Papavassiliou等，生物化学杂志，265,9402(1990)；Park等，Molec.Endocrinol.7,319(1993))。2.2)可能性B)-活化序列·包含LexA蛋白质的至少一种结合序列[核苷酸序列5′-TACTGTATGTACA TACAGTA-3′](SEQ ID NO.:2)(Lex A操纵子；Brent等，自然，612,312(1984)]并(在其3′末端上)增加·SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed),DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或者另一种启动子(参见可能性A)。2.3)可能性C)-活化序列·包含lacⅠ阻抑蛋白质的至少一种Lac操纵子结合序列(核苷酸序列5′-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3′)(SEQ ID NO.:3)(Fuerst等，PNAS USA 86,2549(1989)；Simons等，PNAS USA81,1624(1984))并(在其3′末端上)增加·SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed)DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或者增加另一种启动子(参见可能性A)。2.4)可能性D)-活化序列·包含四环素阻抑(tet R)蛋白质的至少一种四环素操纵子(tet O)结合序列(核苷酸序列5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3′)(SEQ ID NO.:4)并(在其3′末端上)增加
·SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed),DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)或者另一种启动子(参见可能性A)。2.5)可能性E)-活化序列·包含ZFHD-1蛋白质的至少一种结合序列[核苷酸序列5 ′-TAATGATGGCG-3′](SEQ ID NO.:5)(Pomerantz等，科学267,93(1995))并(在其3′末端上)增加·SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed),DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)或者另一种启动子(参见可能性A)。Ⅳ)实施方案B)的具体特性的详细描述1)启动子单位Ⅰ的活化序列[组分a′)]1.1)调节蛋白[组分a1)]的DNA结合序列这些序列包括转录因子的DNA结合序列，其结合DNA的能力受到突变的抑制或者其在细胞中出现数量上的增加或者减少。转录因子及其变体己由有关人士报道，例如Nichols等，血液80,2953(1992)；Crepieux等，Crit.Rev.Oncogen.5,615(1994)；LaThangue,TIBS19,108(1994)；Lipton,Nature Med.3,20(1997)。
这些DNA结合序列包括例如至少一种DNA结合序列，其-属于p53蛋白质[ATAATTGGGCAAGTCTAGG-3；(SEQ ID NO.:6)Kern等，科学252,1708(1991),Cho等，科学265,346(1994)或者-(G/A)-(G/A)-(G/A)-C-(A/T)-(T/A)-G；Cho等，科学265,346(1994)]-属于Wt-1蛋白质(Wang等，致癌基因10,415(1995)；Borel等，生物化学35/37,12070(1996))-属于NF kappa B蛋白质(核苷酸序列5′-GGGACTTTCC-3′(SEQ IDNO.:7)；Urban等，基因和发展4,1975(1990)；Roug等，病毒学189,750(1992))或者HIV-LTR(Gimble等，病毒学杂志，62,4104(1988))-属于E2F/DP-1复合体(至少一种核苷酸序列5′-TTTTCCCGCCAAAA(SEQ ID No.:8)；或者5′-TTTTCCCGCCTTTTTT(SEQ ID NO.:9)或者5′-TTTTCCCGCGC TTTTTT)(SEQ ID NO.:10)(Ouellete等，致癌基因7,1075(1992))-属于Myc/Max蛋白质(至少一种5′-CACGTG-3′核苷酸序列)(Walhout等，核酸研究，25,1493(1997)；Nozaki等，生物化学杂志121,550(1997))或者5′-CATGTG-3′核苷酸序列(Fisher等，EMBO J.12,5075(1993))1.2)基础启动子[组分a2)]这些基础启动子的例子是-SV40的基础启动子(核苷酸48-5191；Tooze(ed),DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室))或者-c-fos的启动子(Das等，自然，374,657(1995))或者-U2 sn RNA启动子或者-HSV TK的启动子(Papavassiliou等，生物化学杂志，265,9402(1990)；Park等，Mol.Endocrin.7,319(1993))2)阻抑物[组分b′)]这些阻抑物的例子是-lac阻抑物(Brown等，细胞49,603(1987)；Furst等，PNAS USA86,2549(1989))或者-四环素阻抑物(Gossen等，PNAS USA 89,5549(1992)；Dingermann等，EMBO J.11,1487(1992))3)受组分b′)影响的活化序列[组分c1)]这些活化序列包括例如随后在部分Ⅴ)中列出的所有活化序列。4)阻抑物的DNA结合序列[组分c2)]这些DNA结合序列的例子是-LacⅠ阻抑蛋白质的至少一种LacⅠ操纵子结合序列(核苷酸序列5′-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3′)(SEQ ID NO.:3)(Furst等，PNAS USA 86,2549(1989)；Simons等，PNAS USA 81,1624(1984))或者-四环素阻抑(tet R)蛋白质的至少一种四环素操纵子(tetO)结合序列(核苷酸序列5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3′)(SEQ ID NO.:4)。Ⅴ)活化序列Ⅰ[实施方案A中的组分a)和实施方案B中的组分c1)]在本发明的意义范围内，在结合转录因子之后激活基因(相邻地定位在3′末端)的转录的核苷酸序列将用作为活化序列。活化序列的选择取决于将要治疗的疾病和将要转导的靶细胞。因此，就有可能以一种不受限制的方式，靶细胞特异性地，在特定的代谢条件下，细胞周期特异性地或者病毒特异性地激活上述活性序列[组分a)]。这些启动子序列已经在专利申请EP95930524.4,EP95931 933.6,EP95931204.2,EP95931205.9,EP97101507.8,EP97102547.3,DE19639103.2和DE19651443.6中详尽地描述了。下列是要选择的启动子序列的例子1)可以一种不受限制的方式激活的活化序列和启动子，例如-RNA聚合酶Ⅲ的启动子-RNA聚合酶Ⅱ的启动子-CMV启动子和CMV增强子-SV40启动子2)病毒启动子和活化序列，例如-HBV-HCV-HSV-HPV-EBV-HTLV-HIV当利用HIV启动子时，整个LTR序列，包括TAR序列[位置-453至-80,Rosen等，细胞41,813(1985)]都将用作为病毒特异性启动子。3)可代谢地激活的启动子和增强子序列，例如可由缺氧诱导的增强子。4)可细胞周期特异性地激活的启动子这些启动子的例子是cdc25C基因的、细胞周期蛋白A基因的、cdc2基因的、B-myb基因的、DHFR基因的、E2F-1基因的或者cdc25B基因的启动子，或者转录因子(在细胞增殖期间出现或得到活化)的其它结合序列。这些结合序列包括例如c-myc蛋白质的结合序列。这些结合序列也包括定名为Myc E盒的核苷酸序列的单体或多体[5′-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3′(SEQ ID NO.:11)；Blackwood和Eisenmann，科学251:1211(1991)]。5)四环素可激活的启动子例如与相应的阻抑物结合的四环素操纵基因。6)嵌合的启动子嵌合的启动子是上游活化序列和下游启动子组件的结合体，其中上游活化序列可细胞特异性地、代谢或病毒特异性地激活，下游启动子组件含有核苷酸序列CDE-CHR或者E2FBS-CHR，在该启动子中结合有抑制蛋白质，因此其能够抑制细胞周期的G0和G1阶段中的上游活化序列的活化(PCT/GB94/17366；Lucibello等，EMBO J.14,12(1994))。7)可细胞特异性地激活的启动子这些启动子优选包括一些来源于一些基因的启动子或者增强子的启动子和活化序列，这些基因编码优先在所选择的细胞中形成的蛋白质。
例如，在本发明意义范围内，下列蛋白质的启动子优选使用在下列细胞中7.1．在内皮细胞中激活的启动子和活化序列-脑特异性的、内皮葡萄糖-1转运蛋白-延长蛋白-VEGF受体1(flt-1)-VEGF受体2(flk-1,KDR)-tie-1或tie-2-B61受体(Eck受体)-B61-内皮肽，特别是内皮肽B或内皮肽1-内皮肽受体，尤其是内皮肽B受体-甘露糖6-磷酸受体-von Willebrand因子-IL-1α,IL-1β-IL-1受体-血管细胞粘着分子(VCAM-1)-合成活化序列作为天然内皮细胞特异性启动子的替换物，也可利用合成活化序列，该活化序列包含转录因子的低聚结合位点，该转录因子在内皮细胞中优先或有选择地呈现活性。一个例子是转录因子GATA-2，该转录因子在内皮肽1基因中的结合位点是5′-TTATCT-3′[Lee等，生物化学266,16188(1991),Dormann等，生物化学杂志，267,1279(1992)和Wilson等，分子细胞生物学，10,4854(1990)]。7.2．在已活化内皮细胞附近的细胞中活化的启动子或活化序列-VEGFVEGF基因的基因调节序列是5′侧翼区、3′侧翼区、c-Src基因或V-Src基因-类固醇激素受体和它们的启动子元件(Truss和Beato,Endocr.Rev.14,459(1993))，尤其是鼠类乳房肿瘤病毒启动子。7.3．在肌肉细胞中(特别在平滑肌细胞中)活化的启动子或活化序列-原肌球蛋白-α-肌动蛋白-α-肌球蛋白-PDGF受体-FGF受体-MRF-4-果糖磷酸激酶A-磷酸甘油酸变位酶-肌钙蛋白C-肌细胞生成素-内皮肽A的受体-结蛋白-VEGFVEGF基因的基因调节序列已在“在已活化内皮细胞附近的细胞中活化的启动子”部分中列出(见上)-″人工″启动子螺旋-环-螺旋(HLH)族的因子(MyoD,Myf-5，肌细胞生成素，MRF4)已经报道为肌肉特异性转录因子。锌指蛋白质GATA-4也是肌肉特异性转录因子。
HLH蛋白质以及GATA-4显示不仅用肌肉特异性基因的启动子而且也用异源方式(例如用人工启动子)进行肌肉特异性转录。这种人工启动子的例子是肌肉特异性HLH蛋白质的(DNA)结合位点的多拷贝，例如E盒(Myo D)(如4x AGCAGGTGTTGGGAGGC)或α-肌球蛋白重链基因的GATA-4的DNA结合位点的多拷贝(例如5′-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3′)(SEQ ID NO.:12)。7.4．在胶质细胞中活化的启动子和活化序列这些启动子和活化序列包括，尤其是基因调节序列或者来源于编码例如下列蛋白质的基因的元件-Schwann细胞特异性蛋白质Periaxin-谷氨酰胺合成酶-胶质细胞特异性蛋白质(胶质丝状酸性蛋白=GFAP)-胶质细胞蛋白质S100b-IL-6(CNTF)-5-HT受体-TNFα-IL-10-胰岛素样生长因子受体Ⅰ和Ⅱ-VEGFVEGF基因的基因调节序列已在上面列出。7.5．在造血细胞中活化的启动子和活化序列具有这一性质的基因调节序列包括细胞因子或其受体(二者都在造血细胞或其邻近细胞，例如基质中得到表达)的基因的启动子序列。
这些启动子序列包括例如下列细胞因子和其受体的启动子序列-干细胞因子受体-干细胞因子-IL-1α-IL-1受体-IL-3-IL-3受体(α-亚单位)-IL-3受体(β-亚单位)-IL-6-IL-6受体-GM-CSF-GM-CSF受体(α-链)-干扰素调节因子1(IRF-1)IRF-1的启动子可同样地由IL-6和由IFNγ或者IFNβ激活-红细胞生成素-红细胞生成素受体7.6．在淋巴细胞和/或巨噬细胞中活化的启动子和活化序列这些启动子和活化序列包括，例如细胞因子、细胞因子受体以及抗体的Fc片段的粘着分子和受体的基因的启动子和活化序列。
例子是-IL-1受体-IL-1α-IL-1β-IL-2-IL-2受体-IL-3-IL-3受体(α-亚单位)-IL-3受体(β-亚单位)-IL-4-IL-4受体-IL-5-IL-6-IL-6受体-干扰素调节因子1(IRF-1)(IRF-1的启动子同样地由IL-6和由IFNγ或者IFNβ激活)-IFNγ响应启动子-IL-7-IL-8-IL-10-IL-11-IFNγ-GM-CSF-GM-CSF受体(α-链)-IL-13-LIF-巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体-Ⅰ和Ⅱ型巨噬细胞清除受体-MAC-1(白细胞功能抗原)-LFA-1α(白细胞功能抗原)-p150,95(白细胞功能抗原)7.7．在滑液细胞中活化的启动子和活化序列这些启动子和活化序列包括基质金属蛋白酶(MMP)的启动子序列，该MMP例如-MMP-1(间质胶原酶)-MMP-3(溶基质素/transin)它们还包括金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)的启动子序列，该TIMP例如-TIMP-1-TIMP-2-TIMP-37.8．在白血病细胞中活化的启动子和活化序列这些启动子和活化序列的例子是下列物质的启动子-c-myc-HSP-70-bcl-1/细胞周期蛋白D-1-bcl-2-IL-6-IL-10-TNFα,TNFβ-HOX-11-BCR-Abl-E2A-PBX-1-PML-RARA(前髓细胞白血病-视黄酸受体)-c-myc-与核苷酸序列的多体结合并且激活该多体的c-myc蛋白质，上述核苷酸序列定名为Myc E盒(5′-GGAAGCAGACCAGCTGGTCT GCTTCC-3′)(SEQ ID NO.:11)7.9．在肿瘤细胞中活化的启动子或者活化序列与转录因子(在肿瘤细胞中形成或者有活性)相互作用的基因调节核苷酸序列被视为启动子或者活化序列。
在本发明意义范围内，优选的启动子或活化序列包括基因调节序列或来源于基因的元件，该基因编码尤其是在癌细胞或者肉瘤细胞中形成的蛋白质。因此，在小细胞支气管癌情况下优选利用N-CAM蛋白的启动子，在卵巢癌情况下优选利用肝炎生长因子受体的启动子或L-网质蛋白的启动子，在胰癌情况下优选利用L-网质蛋白或多形上皮细胞粘蛋白(PEM)的启动子。Ⅵ．效应基因[组分d)]在本发明意义范围内，效应基因[组分d)]编码用于预防和/或治疗疾病的活性化合物。按照疾病治疗的性质并考虑将要转导的靶细胞来选择效应基因和启动子序列。
例如，在下列疾病情况下将选择启动子序列和效应基因的下列结合(详细的描述已经在专利申请EP95930524.4,EP95931933.6,EP95931204.2,EP95931205.9,EP97101507.8,DE19617851.7,DE19639103.2和DE19651443.6中给出，这些专利申请并入本文作为参考)。1)肿瘤的治疗1.1)靶细胞-增殖内皮细胞或者-邻近于内皮细胞的基质细胞和肌肉细胞，或者-肿瘤细胞或者白血病细胞1.2)启动子-内皮细胞特异性的和细胞周期特异性的或者-细胞非特异性的或肌肉细胞特异性的和细胞周期特异性的或者-肿瘤细胞特异性的(实体瘤，白血病)和细胞周期特异性的1.3)细胞增殖的抑制剂的效应基因，例如下列物质的效应基因-成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb=p110)或者相关的p107和p130蛋白质成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb/p110)和相关的p107和p130蛋白质通过磷酸化作用来灭活。优选的是利用上述细胞周期抑制剂的那些基因，该细胞周期抑制剂显示所表达蛋白质的失活位点的突变，而所表达蛋白质的功能没有由此受到削弱。这些突变的例子已在p110中描述了。
p107蛋白质或者p130蛋白质的DNA序列以类似方式发生突变。-p53蛋白质通过结合到特定的蛋白质(如MDM2)上或者通过解磷酰化的C末端丝氨酸使p53进行低聚，使p53蛋白质在细胞中灭活。因而，优选的是利用C末端由丝氨酸392截短的p53蛋白质的DNA序列。-p21(WAF-1)-p16蛋白质-其它cdk抑制剂-GADD45蛋白质-bak蛋白质-调节蛋白的结合蛋白(参见Ⅱ.1．)1.4)凝固诱导因子和血管生成抑制剂的效应基因，例如-纤溶酶原活化抑制剂1(PAⅠ-1)-PAⅠ-2-PAⅠ-3-制管张素-干扰素(IFNα,IFNβ或IFNγ)-血小板因子4-TIMP-1-TIMP-2-白血病抑制因子(LIF)-组织因子(TF)及其凝固活性片段1.5)抑制细胞和细胞毒性蛋白质的效应基因，例如下列物质的效应基因-穿孔素-粒酶-IL-2-IL-4-IL-12-干扰素，如IFNα、IFNβ或IFNγ-TNF，如INFα或INFβ-制癌蛋白M-鞘磷脂酶-爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物1.6)抑制细胞或者细胞毒性抗体的效应基因，以及在抗原结合抗体片段和抑制细胞、细胞毒性或炎性蛋白或者酶之间的融合蛋白质的效应基因。-抑制细胞或者细胞毒性抗体包括那些针对内皮细胞的膜结构的抗体，这类抗体已经由有关人士所描述，例如Burrows等(Pharmac.Ther.64,155(1994))、Hughes等(癌症研究49,6214(1989))和Maruyama等(PNAS USA 87,5744(1990))。它们尤其包括抗VEGF受体的抗体。-它们也包括针对肿瘤细胞上的膜结构的抑制细胞或者细胞毒性抗体。具有这一性质的抗体已经由有关人士所评论，例如Sedlacek等(Contrib.toOncol 32,Karger Verlag,Munich(1988)以及Contrib.to Oncol 43,Karger Verlag,Munich(1992))。其它例子是抗Sialyl Lewis的抗体，抗T细胞所识别的肿瘤上的肽的抗体，抗致癌基因所表达的蛋白质的抗体；抗神经节苷脂(如GD3、GD2、GM2、9-O-乙酰基GD3以及岩藻糖基GM1)的抗体，抗血型抗原及其前体的抗体，抗多形上皮细胞粘蛋白上的抗原的抗体，以及抗热激蛋白质上的抗原的抗体。-它们还包括针对白血病细胞的膜结构的抗体。大量具有这一性质的单克隆抗体的诊断和治疗方法已经被描述(综述于Kristensen，丹麦的医学公报41,52(1994)；Schranz,Therapia Hungarica 38,3(1990)；Drexler等，白血病研究，10,279(1986)；Naeim,Dis.Markers 7,1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol.4,847(1992)；Drexler等，Blut 57,327(1988)；Freedman等，癌症调查9,69(1991))。取决于白血病的类型，针对下列膜抗原的单克隆抗体或者其抗原结合的抗体片段是合适的，例如，适合用作为配体细胞细胞膜抗原AML CD13CD15CD33CAMALsialosyl-LeB-CLL CD5CDlcCD23膜免疫球蛋白的独特型和同种型T-CLL CD33M38IL-2受体T细胞受体ALL CALLACD19非Hodgkin′s淋巴瘤-按照本领域技术人员所知的技术可实现鼠抗体的人源化以及Fab和rec.Fv片段的基因的制备和优化。按照本领域技术人员所知的技术水平同样可实现rec.Fv片段与抑制细胞、细胞毒性或炎性蛋白或者酶的基因的融合。1.7)包含靶细胞结合配体以及抑制细胞和细胞毒性蛋白质的融合蛋白质的效应基因。上述配体包括与内皮细胞上的膜结构或膜受体结合的所有物质。例子是-例如IL-1的细胞因子或者生长因子或其片段或者其部分序列，它们与由内皮细胞表达的受体结合，例如PDGF、bFGF、VEGF和TGF。-它们也包括结合到活化的和/或增殖的内皮细胞上的粘着分子。这些物质的例子是SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4或玻连蛋白。-它们还包括结合到肿瘤或者白血病细胞膜结构或膜受体上的物质。例子是激素或者生长因子或者他们的片段或其部分序列，它们都与由白血病细胞或者肿瘤细胞表达的受体结合。
具有这一性质的生长因子已经得到描述(综述于Cross等，细胞64,271(1991),Aulitzky等，药物48,667(1994),Moore,Clin.CancerRes.1,3(1995),Van Kooten等，Leuk.Lymph.12,27(1993))。-按照现有技术水平利用本领域技术人员所知的方法，可使这些配体(与靶细胞结合)的基因与抑制细胞、细胞毒性或者炎性蛋白或酶融合。1.8.)发炎诱导物的效应基因，例如下列物质的效应基因-IL-1-IL-2-RANTES(MCP-2)-单核细胞趋化和活化因子(MCAF)-IL-8-巨噬细胞炎性蛋白质-1(MIP-1α,-β)-嗜中性活化蛋白质-2(NAP-2)-IL-3-IL-5-人白血病抑制因子(LIF)-IL-7-IL-11-IL-13-GM-CSF-G-CSF-M-CSF-眼睛蛇毒因子(CVF)或CVF的部分序列，其在功能上相当于人互补因子C3b，即其能够与补体因子B结合并且在由因子D切割之后构成C3转化酶-人补体因子C3或它的部分序列C3b-人补体因子C3的切割产物，该产物在功能和结构上类似于CVF-可激活补体或者引起炎症的细菌蛋白质，例如鼠伤寒沙门氏杆菌孔蛋白、金黄色葡萄球菌凝集因子、modulins(尤其是革兰氏阴性细菌modulins)、军团菌属或流感嗜血杆菌类型B或克雷伯氏菌属主要外膜蛋白质、或者G类链球菌的M分子。1.9)用于激活细胞抑制剂前体的酶的效应基因，例如该酶切割无活性前体(药物前体)成为活性细胞抑制剂(药物)。
具有这一性质的物质，以及在每一情况下都相互关联的前体药物和药物都已经由Deonarain等(Br.J.Cancer 70,786(1994)),Mullen,Pharmac.Ther.63,199(1994))和Harris等(Gene Ther.1,170(1994))报道过。
例如，可利用下列酶之一的DNA序列-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶-水痘带状疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶-细菌硝酸还原酶-细菌β-葡糖醛酸酶-黑麦的植物β-葡糖醛酸酶-人β-葡糖醛酸酶-人羧肽酶(CB)，例如肥大细胞CB-A，胰腺CB-B或细菌羧肽酶-细菌β-内酰胺酶-细菌胞嘧啶脱氨基酶-人过氧化氢酶或过氧化物酶-磷酸酶，尤其是人碱性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶或类型5酸性磷酸酶-氧化酶，尤其是人赖氨酰氧化酶或人酸性D-氨基氧化酶-过氧化物酶，尤其是人谷胱甘肽过氧化物酶，人嗜酸性粒细胞过氧化物酶或者人甲状腺过氧化物酶-半乳糖苷酶2)自身免疫疾病和炎症的治疗2.1)靶细胞-增殖内皮细胞或者-巨噬细胞和/或者淋巴细胞或者-滑液细胞2.2)启动子-内皮细胞特异性的和细胞周期特异性的或者-巨噬细胞和/或淋巴细胞特异性的和/或细胞周期特异性的或者-滑液细胞特异性的和/或细胞周期特异性的2.3)用于治疗变应性变态反应的效应基因，例如下列物质的效应基因-IFNβ-IFNγ-IL-10-抗IL-4的抗体或者抗体片段-可溶性IL-4受体-IL-12-TGFβ2.4)用于抑制移植器官的排斥作用的效应基因，例如下列物质的效应基因-IL-10-TGFβ-可溶性IL-1受体-可溶性IL-2受体-IL-1受体拮抗剂-可溶性IL-6受体-免疫抑制抗体或其包含VH和VL的片段或其VH和VL片段(通过接头连接)。免疫抑制抗体的例子是特异于上述T细胞受体或其CD3复合物的抗体，或者针对CD4或CD8的抗体，此外还有抗IL-2受体、IL-1受体、IL-4受体的抗体，或者抗粘着分子CD2、LFA-1、CD28或CD40的抗体。2.5)用于治疗抗体介导的自身免疫疾病的效应基因，例如下列物质的效应基因-TGFβ-IFNα-IFNβ-IFNγ-IL-12-可溶性IL-4受体-可溶性IL-6受体-免疫抑制抗体或其包含VH和VL的片段2.6)用于治疗细胞介导的自身免疫疾病的效应基因，例如下列物质的效应基因-IL-6-IL-9-IL-10-IL-13-TNFα或者TNFβ-免疫抑制抗体或其包含VH和VL的片段2.7)细胞增殖抑制剂、抑制细胞或细胞毒性蛋白质以及激活细胞抑制剂的前体的酶的效应基因编码具有这一性质的蛋白质的基因的例子已经在″用于治疗肿瘤的效应基因″部分列出。
以与在那部分中所描述相同的形式，在本发明意义范围内利用编码融合蛋白的效应基因，该融合蛋白由抗体或这些抗体的Fab或rec.Fv片段，或者其它配体(特异于靶细胞)，以及上述的细胞因子、生长因子、受体、抑制细胞或细胞毒性蛋白质和酶组成。2.8)用于治疗关节炎的效应基因在本发明意义范围内，选择所表达的蛋白质(例如在关节中)直接或者间接抑制发炎的、和/或在关节中促进胞外基质(软骨、结缔组织)的重组的效应基因。
例子是-IL-1受体拮抗剂(IL-1 RA)；IL-1 RA抑制IL-1α,β的结合-可溶性IL-1受体；可溶性IL-1受体结合并灭活IL-1-IL-6IL-6增加TIMP和超氧化物的分泌，并且使滑液细胞和软骨细胞分泌IL-1和TNFα减少-可溶性TNF受体可溶性TNF受体结合并灭活TNF。-IL-4IL-4抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌-IL-10IL-10抑制IL-1、TNF∝和MMP的形成和分泌并增加TIMP的分泌-胰岛素样生长因子(IGF-1)IGF-1刺激胞外基质的合成。-TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2TGFβ刺激胞外基质的合成。-超氧化物歧化酶-TIMP、尤其是TIMP-1、TIMP-2或TIMP-33)血细胞生成缺乏的治疗3.1)靶细胞-造血系统的增殖的、未成熟的细胞或者-邻近于造血细胞的基质细胞3.2)启动子-特异于造血细胞的和/或细胞周期特异性的-细胞非特异性的和细胞周期特异性的3.3)用于治疗贫血的效应基因，例如下列物质的效应基因-促红细胞生成素3.4)用于治疗白血球减少症的效应基因，例如下列物质的效应基因-G-CSF-GM-CSF-M-CSF3.5)用于治疗血小板减少症的效应基因，例如下列物质的效应基因-IL-3-白血病抑制性因子(LIF)-IL-11-血小板生成素4)神经系统损伤的治疗4.1)靶细胞-神经胶质细胞或者-增殖内皮细胞4.2)启动子-神经胶质细胞特异性的和细胞周期特异性的或者-内皮细胞特异性的和细胞周期特异性的或者-非特异性的和细胞周期特异性的4.3)神经元生长因子的效应基因，例如-FGF-神经生长因子(NGF)-脑衍生的神经营养因子(BDNF)-神经营养素3(NT-3)-神经营养素4(NT-4)-睫状神经营养因子(CNTF)4.4)酶的效应基因，例如下列酶的-酪氨酸羟化酶-多巴脱羧酶4.5)细胞因子及其抑制剂的效应基因，该抑制剂抑制或者中和TNFα的神经毒害作用，例如下列物质的效应基因-TGFβ-可溶性TNF受体TNF受体中和TNFα-IL-10IL-10抑制)FNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成-可溶性IL-1受体-IL-1受体Ⅰ-IL-1受体Ⅱ可溶性IL-1受体中和IL-1的活性-IL-1受体拮抗剂-可溶性IL-6受体5)血液凝固与血液循环系统失调的治疗5.1)靶细胞-内皮细胞或者-增殖内皮细胞或者-内皮细胞和平滑肌细胞附近的体细胞或者-巨噬细胞5.2)启动子-细胞非特异性的和细胞周期特异性的或者-特异于内皮细胞、平滑肌细胞或巨噬细胞的和细胞周期特异性的5.3)抑制凝固的或者促进纤溶的结构基因，例如下列物质的结构基因-组织纤溶酶原活化剂(tPA)-尿激酶型纤溶酶原(uPA)-tPA和uPA的杂合体-蛋白质C-水蛭素-丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，如C-1S抑制剂、α1-抗胰蛋白酶或者抗凝血酶Ⅲ-组织因子路径抑制剂(TFPI)5.4)促进凝固作用的效应基因，例如下列物质的效应基因-FⅧ-FⅨ-von Willebrand因子-FⅩⅢ-PAⅠ-1-PAⅠ-2-组织因子及其片段5.5)血管生成因子的效应基因，例如下列物质的效应基因-VEGF-FGF5.6)降低血压的效应基因，例如下列物质的效应基因-激肽释放酶-内皮细胞氮氧化物合酶5.7)伤害内皮层之后抑制平滑肌细胞的增殖的效应基因，例如下列物质的效应基因-抗增殖的、抑制细胞或细胞毒性蛋白质或者-用于将细胞抑制剂前体切割成为细胞抑制剂的酶，如上所列(在肿瘤情况下)，或者，-这些活性化合物之一与配体的融合蛋白质，例如肌肉细胞特异性的抗体或者抗体片段。5.8)其它血浆蛋白质的效应基因，例如下列物质的效应基因-白蛋白-C1灭活剂-血清胆碱酯酶-转铁蛋白-1-antritrypsin6)接种6.1)靶细胞-肌肉细胞或者-巨噬细胞和/或淋巴细胞-内皮细胞6.2)启动子-非特异性的和细胞周期特异性的或者-靶细胞特异性的和细胞周期特异性的6.3)用于预防传染病的效应基因按照常规方法制备有效疫苗的可能性是有限的。
因此开发了DNA疫苗技术。然而，这些DNA疫苗出现关于效能的问题。
能够期望按照本发明制备的DNA疫苗更有效。
所要选择的活性物质是蛋白质的DNA，该蛋白质由感染剂形成并通过诱导免疫反应(即通过形成抗体和/或通过细胞毒性T淋巴细胞)引起病原体的中和和/或破坏。具有这一性质的所谓中和抗原已用作为接种抗原(参见Ellis评论，Adv.Exp.Med.Biol.327,263(1992))。
在本发明意义范围内，优选的是编码下列病原体的中和抗原的DNA-流感A病毒-HIV-狂犬病病毒-HSV(单纯疱疹病毒)-RSV(呼吸合胞体病毒)-副流感病毒-轮状病毒-VZV(水痘带状疱疹病毒)-CMV(巨细胞病毒)-麻疹病毒-HPV(人乳头瘤病毒)-HBV(乙型肝炎病毒)-HCV(丙型肝炎病毒)-HDV(丁型肝炎病毒)-HEV(戊型肝炎病毒)-HAV(甲型肝炎病毒)-弧菌霍乱抗原-布氏疏螺旋体-幽门螺杆菌-疟疾抗原-然而，在本发明意义范围内，具有这一性质的活性物质也包括抗独特型抗体或其抗原结合片段的DNA，该抗原结合片段的抗原结合结构(互补决定区)构成感染剂的中和抗原的蛋白质或碳水化合物结构的拷贝。
具有这一性质的抗独特型抗体尤其可以在有细菌感染剂的情况下替换碳水化合物抗原。
具有这一性质的抗独特型抗体及其切割产物已由Hawkins等(J.Immunother.14,273(1993))以及Westerink和Apicella(SpringerSeminars in Immunopathol.15,227(1993))报道过。6.4)″肿瘤疫苗″的效应基因-这些“肿瘤疫苗”包括肿瘤细胞上的抗原。具有这一性质的抗原已经为有关人士所报道，例如，Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32,KargerVerlag,Munich(1988)以及Contrib.to Oncol 43,Karger Verlag,Munich(1992)。
其它例子是下列蛋白质抗原的基因或者抗独特型抗体的可变区(VL,VH)的基因，该抗独特型抗体相应于下列非蛋白质抗原-神经节苷脂-sialyl Lewis-由T细胞识别的肿瘤上的肽-由致癌基因表达的蛋白质-血型抗原及其前体-在与肿瘤有关的粘蛋白上的抗原-在热激蛋白上的抗原7)慢性传染病的治疗7.1)靶细胞-肝细胞-淋巴细胞和/或巨噬细胞-上皮细胞-内皮细胞7.2)启动子-病毒特异性的或细胞特异性的和细胞周期特异性的7.3)效应基因，例如下列物质的效应基因-显示抑制细胞、细胞编程性死亡或者细胞毒性作用的蛋白质。-将抗病毒或细胞毒性物质的前体切割成为活性物质的酶。7.4)抗病毒蛋白质的效应基因-具有抗病毒作用的细胞因子和生长因子。它们包括，例如IFNα、IFNβ、IFN-γ、TNFβ、TNFα、IL-1或TGFβ-具有特异性的抗体，该特异性灭活各自的病毒或其包含VL和VH的片段、或其VL和VH片段(通过接头连接起来，并按照已描述的方法制备)。
下列是抗病毒抗原的抗体的例子-抗HBV-抗HCV-抗HSV-抗HPV-抗HIV-抗EBV-抗HTLV-抗柯萨奇病毒-抗汉坦病毒-Rev结合蛋白。这些蛋白质结合到Rev RNA上，并在逆转录病毒基因表达中抑制依赖Rev的转录后步骤。Rev结合蛋白的例子有RBP9-27RBP1-8URBP1-8DRBP1-8的假基因-消化细胞周期控制蛋白质的基因的mRNA或病毒的mRNA的核糖酶。催化HIV的核糖酶已经由有关人士所报道过，例如Christoffersen等，J.Med.Chem.38,2033(1995)。5)抗细菌蛋白质的效应基因抗细菌蛋白质包括，例如中和细菌毒素或者调理细菌的抗体。例子是抗以下物质的抗体脑膜炎双球菌C或B大肠杆菌包柔氏螺旋体假单胞菌幽门螺杆菌金黄色葡萄球菌Ⅶ.相同或者不同的效应基因的结合本发明还涉及一种自增强(在适当的药理可控条件下)的表达系统，其中两种相同或不同的效应基因的DNA序列[组分c)和c′)]结合在一起。对于要表达的两种DNA序列，将另一种启动子序列(或优选的是″内部核糖体进入位点″(IRES)的cDNA)作为调节元件嵌入到两个效应基因之间。
IRES使表达两种彼此连接(经由IRES)的DNA序列成为可能。
具有这一性质的IRES已经由关人士描述过，例如Montford和Smith(TIG 11,179(1995))、Kaufman等(核酸研究，19,4485(1991))、Morgan等(核酸研究，20,1293(1992))、Dirks等(基因128,247(1993))、Pelletier和Sonenberg(自然334,320(1988))以及Sugitomo等(生物技术12,694(1994))。
因此，可利用例如脊髓灰质炎病毒的IRES序列的cDNA(位置≤5′UTR的140至≥5′UTR的630)。
在本发明意义范围内，显示加性效应的效应基因优选通过附加的启动子序列或者IRES序列连接起来。
在本发明意义范围内，下列是效应基因的优选组合的例子1)用于肿瘤的治疗-相同的或不同的抑制细胞、细胞编程性死亡、细胞毒性或者炎性蛋白或者-切割细胞抑制剂前体的相同或者不同的酶2)用于自身免疫疾病的治疗-对细胞和/或体液免疫反应的抑制有协同作用的不同细胞因子或者受体-不同的或相同的TIMPs3)用于血细胞生成缺乏的治疗-不同的序位上连续的细胞因子，如IL-1、IL-3、IL-6或者GM-CSF和促红细胞生成素、G-CSF或者血小板生成素。4)用于神经细胞损坏的治疗-神经元生长因子和细胞因子或细胞因子的抑制剂5)用于血液凝固与血液循环系统失调的治疗-抗血栓形成剂和纤维蛋白分解剂(例如tPA或者uPA)或者-抑制细胞、细胞编程性死亡或细胞毒性蛋白质和抗血栓形成剂或纤维蛋白分解剂几种不同的血液凝固因子协同起作用，例如FⅧ和vWF或者FⅧ和FⅨ6)用于接种-抗原和免疫刺激细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3或IL-4受体-一种感染剂或不同感染剂的不同抗原或者-一种肿瘤类型或不同肿瘤类型的不同抗原7)用于病毒性传染病的治疗-抗病毒蛋白和抑制细胞、细胞编程性死亡或者细胞毒性蛋白质-抗一种病毒或者几种病毒的不同表面抗原的抗体8)用于细菌性传染病的治疗-抗生物体的不同表面抗原和/或毒素的抗体Ⅷ)信号序列和跨膜结构域的插入1)增强翻译为了增强翻译，可将核苷酸序列GCCACC或者GCCGCC(Kozak,细胞生物学杂志，108,299(1989))插入在启动子序列的3′末端，或者直接插入在信号或者跨膜序列的起始信号(ATG)的5′末端。2)促进分泌为了促进效应基因表达产物的分泌，可以用促进胞外释放的异源信号序列替换同源信号序列(存在于效应基因的DNA序列中)。
因此，能够例如插入免疫球蛋白信号序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等，自然，332,323(1988))或CEA信号序列(DNA位置≤33至≥134；Schrewe等，分子细胞生物学，10,2738(1990)；Berling等，癌症研究50,6534(1990))或人呼吸合胞体病毒糖蛋白信号序列(氨基酸cDNA≤38至≥50或48至65；Lichtenstein等，基因病毒学杂志，77,109(1996))。3)锚定活性化合物3.1)作为替换物或除信号序列之外，可以将跨膜结构域的序列插入，其目的是在形成活性化合物的转导细胞的细胞膜中锚定该活性化合物。
因此，可以例如在启动子序列和效应基因的序列之间插入人巨噬细胞集落刺激因子的跨膜序列(DNA位置≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt.83,15(1988))或者人呼吸合胞体病毒(RSV)糖蛋白G的信号和跨膜区(氨基酸1-63或其部分序列，氨基酸38-63；Vijaya等，分子细胞生物学，8,1709(1988)；Lichtenstein等，基因病毒学杂志，77,109(1996))的DNA序列或者流感病毒神经氨酸酶的信号和跨膜区(氨基酸7-35或其部分序列，氨基酸7-27；Brown等，病毒学杂志，62,3824(1988))的DNA序列。3.2)然而，也可插入糖磷脂锚的核苷酸序列，其目的是在形成活性化合物的转导细胞的细胞膜中锚定该活性化合物。
糖磷脂锚插入在效应基因的核苷酸序列的3′末端，其中除发生信号序列插入之外这一插入也可能发生。
糖磷脂锚已被描述，例如对于CEA、N-CAM和如Thy-1的其它膜蛋白(参见Ferguson等评论，Ann.Rev.Biochem.57,285(1988))。3.3)配体活性化合物融合蛋白质的DNA序列的利用提供了锚定活性化合物到细胞膜中(按照本发明)方法的另一种选择。具有这一融合蛋白质的配体的特异性体现在所选择的靶细胞的细胞膜的膜结构上。
结合到细胞表面上的配体包括，例如针对例如下列物质的表面上的结构的抗体或者抗体片段-内皮细胞。这些抗体包括，尤其是抗VEGF受体或抗激肽受体的抗体-或者肌细胞，例如抗肌动蛋白的抗体或抗血管紧张肽Ⅱ受体的抗体、或抗生长因子的受体(如抗EGF受体或抗PDGF受体或FGF受体)的抗体、或抗内皮肽A受体的抗体。-上述配体也包括抗体或其片段，该抗体或其片段针对肿瘤细胞膜上的肿瘤特异性或与肿瘤有关的抗原。具有这一性质的抗体已经得到描述。
鼠的单克隆抗体优选以人源化形式使用。如上所述，利用本领域技术人员所熟知的技术，制备Fab和rec.Fv片段及其融合产物。
上述配体还包括所有活性化合物，例如细胞因子或粘着分子、生长因子或其片段或其部分序列、结合到膜结构或者膜受体(所选择的具体细胞上)上的介体或者肽激素。这些配体的例子是-内皮细胞配体，如IL-1、PDGF、bFGF、VEGF、TGGβ或激肽以及激肽的衍生物或类似物。-此外，上述配体也包括粘着分子。具有这一性质的粘着分子(如SLex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、VLA-4或者玻连蛋白以及玻连蛋白的衍生物或类似物)已被描述(内皮细胞的粘着分子)(参见Augustin-Voss等，细胞生物学杂志，119,483(1992)；Pauli等，Cancer Metast.Rev.9,175(1990)；Honn等，Cancer Metast.Rev.11,353(1992)；Varner等，Cell Adh.Commun.3,367(1995))。
下列例子将更详细地描述本发明。Ⅸ．更详细地描述本发明主题的例子1)致癌基因受控表达系统的制备。
按照本发明的致癌基因受控表达系统由下列的不同核苷酸序列组成，这些序列相互紧随地沿下游方向排列-组分a)·cdc25C基因的启动子(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14,4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23,3822(1995))。-组分b)·SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID No.13)；Dingwall等，TIBS16,478(1991))·HSV-1 VP16的酸性反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展，2,718(1988)；Triezenberg,Curr.Opin.Gene Developm.5,190(1995))·E2F-1蛋白的RB结合序列(氨基酸409-426(LDYHFGLEEGEGIRDLFD)(SEQ ID NO.:14)；FIemington等，PNAS USA 90,6914(1993)；Helin等，细胞70,337(1992))·Gal4蛋白质的DNA结合区(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10,2916(1990))的cDNA-组分c)·10x具有核苷酸序列5′-CGGACAATGTTGACCG-3′的Gal4 DNA结合序列的结合序列(SEQ ID NO.:1)(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10,2916(1990)·SV40的基础启动子(核酸48-5191；Toose(ed)DNA肿瘤病毒；纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室)-组分d)·序列GCCACC(Kodak，细胞生物学杂志，108,229(1989))·免疫球蛋白信号肽的cDNA(核苷酸序列63-107；Riechmann等，自然，332,323(1988))·β-葡糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93-1982；Oshima等，PNASUSA 84,685(1987)通过合适的限制位点连接构建体的个体组分，该位点通过PCR扩增在不同的元件末端引入。利用特异于限制位点的酶以及本领域技术人员所知的DNA连接酶实现连接。这些酶可从商业途径获得。
将这样制备的核苷酸构建体克隆进入pXP2质粒载体(Nordeen，生物技术454,(1988))中，该质粒载体直接或者在胶态分散系统中用于体内用途。
利用本领域技术人员所知的方法(Lucibello等，EMBO J.132(1995))，利用上述质粒转染保存在培养物中的3T3成纤维细胞(RB-阳性)和骨肉瘤细胞(SAOS-2,RB-阴性)，并利用4-甲基繖形基-β-葡糖醛酸化物作为底物，测量由成纤维细胞或者由骨肉瘤细胞产生的β-葡糖醛酸酶的数量。
为了检查细胞周期特异性，通过去除甲硫氨酸48小时在G0/G1中同步生成上述骨肉瘤细胞。在用Hoechst 33258(Lucibello等，EMBO J.132(1995))染色后，在荧光活化的细胞分选仪中确定细胞的DNA含量。
获得以下结果与未转染的成纤维细胞比较，在转染的成纤维细胞(RB-阳性)中测定出无β-葡糖醛酸酶的增加。
转染的骨肉瘤细胞(RB-阴性)表达的β-葡糖醛酸酶显著多于未转染骨肉瘤细胞的。
增殖骨肉瘤细胞(DNA＞2S；S=单套染色体)分泌的β-葡糖醛酸酶显著多于在G0/G1中同步生成的骨肉瘤细胞(DNA=2S)的。
因而，上述的表达系统引起结构基因β-葡糖醛酸酶的RB依赖性的表达，该结构基因β-葡糖醛酸酶例如以细胞周期依赖性方式(取决于启动子序列的选择)得到调节。2)病毒受控表达系统的制备按照本发明的病毒受控表达系统由下列的不同核苷酸序列组成，这些核苷酸序列相互紧随地沿下游方向排列-组分a)·cdc25C基因的启动子(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14,4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23,3822(1995))-组分b)·SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID No.13)；Dingwall等，TIBS 16,478(1991))。
·HSV-1 VP16的酸性反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展，2,718(1988)；Triezenberg,Curr.Opin.Gene Developm.5,190(1995))·HPV-18病毒的E6蛋白质(核苷酸序列100-578；Roggenbuck等，病毒学杂志，65,5068(1991))·Gal4蛋白质的DNA结合区(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10,2916(1990))的cDNA-组分c)·10x具有核苷酸序列5′-CGGACAATGTTGACCG-3′的Gal4 DNA结合序列的结合序列(SEQ ID NO.:1)(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10,2916(1990)·SV40的基础启动子(核酸48-5191；Toose(ed)DNA肿瘤病毒；纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室)-组分d)·序列GCCACC(Kodak，细胞生物学杂志，108,229(1989))·免疫球蛋白信号肽的cDNA(核苷酸序列63-107；Riechmann等，自然，332,323(1988))·β-葡糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93-1982；Oshima等，PNASUSA 84,685(1987)通过适合的限制位点连接构建体的个体组分，该限制位点通过PCR扩增在不同的元件末端引入。利用特异于上述限制位点的酶和本领域技术人员所知道的DNA连接酶实现连接。这些酶可从商业途径获得。
将这样制备的核苷酸构建体克隆进入pUC18/19质粒载体中，该质粒载体直接或者在胶态分散系统中用于体内应用。
利用本领域技术人员已知的方法(Lucibello等，EMBO J.132(1995))，利用上述质粒转染保存在培养物中的人成纤维细胞(Wi-38,E6/E7-阴性)和宫颈癌细胞(HeLa,HPV-18-E6/E7-阳性)，并利用4-甲基繖形基-β-葡糖醛酸化物作为底物，测量由这些细胞产生的β-葡糖醛酸酶的数量。
为了检查细胞周期特异性，通过去除甲硫氨酸48小时在G0/G1中同步生成骨肉瘤细胞。在用Hoechst 33258(Lucibello等，EMBO J.132(1995))染色后，用荧光活化的细胞分选仪测定细胞的DNA含量。
获得下列结果与未转染的成纤维细胞比较，测定出在转染的成纤维细胞中无β-葡糖醛酸酶的增加。
转染HeLa细胞表达的β-葡糖醛酸酶显著多于未转染HeLa细胞的。
增殖HeLa细胞(DNA＞2S；S=单套染色体)分泌的β-葡糖醛酸酶显著多于在G0/G1中同步生成的HeLa细胞(DNA=2S)的。
因而，上述表达系统引起结构基因β-葡糖醛酸酶的病毒特异性(HPV18)表达，该结构基因β-葡糖醛酸酶例如以细胞周期依赖性方式(取决于启动子序列的选择)调节。
在局部施用(例如在肿瘤部位)之后、或者在颅内或者蛛网膜下(subarachnoidal)或者全身施用(优选为静脉内或者动脉内施用)之后，按照例1和例2的活性化合物表明如果不是唯一的，那么该活性化合物主要是那些显示突变的致癌基因或者分泌β-葡糖醛酸酶的病毒感染的细胞。该β-葡糖醛酸酶切割新注射的、完全耐受的阿霉素-β-葡糖醛酸化物(Jacquesy等EP 0511 917 A1)成为起细胞抑制作用的阿霉素。后者抑制内皮细胞增殖，并对这些细胞以及也对邻近的肿瘤细胞起细胞抑制作用。其结果是抑制肿瘤的生长。
图1一种新核酸构建体的一般组分的性质和排列。
图2按照本发明的实施方案A的新核酸构建体的一般组分的排列的图表说明。
图3按照本发明的实施方案B的新核酸构建体的一般组分的排列的图表说明。
序列表1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道-(C)城市法兰克福(D)州名-(E)国家德国(F)邮编(ZIP):65926(G)电话069-305-3005(H)传真069-35-7175(i)电传-(ⅱ)发明名称致癌基因或病毒受控表达系统(ⅲ)序列数14(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn版本#1.0，版本#1.30(EPO)2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..17(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CGGACAACTGTTGACCG 172)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..20(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:TACTGTATGT ACATACAGTA20(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..42(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG42(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..11(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TAATGATGGC G 11(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:ATAATTGGGC AAGTCTAGGA21(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子
(B)位置1..10(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GGGACTTTCC 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..14(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TTTTCCCGCC AAAA 14(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度16个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..16(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TTTTCCCGCC TTTTTT16(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..17(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:TTTTCCCGCG CTTTTTT 17(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..26(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅸ)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..41(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAGG41(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..7(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..18(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu Glu Glu Gly Glu Gly Ile Arg Asp Leu Phe1 5 10 15Asp
权利要求
1．一种用于表达效应基因的核酸构建体，该核酸构建体包含控制转录因子基因(组分b)(也包含在核酸构建体中)表达的启动子Ⅰ(组分a)，并且包含转录因子基因的基因产物特异地与其结合以及控制效应基因(组分d)(也包含在该核酸构建体中)表达的启动子Ⅱ(组分c)，其中转录因子基因的基因产物的活性取决于一种或多种细胞调节蛋白(特异地与该基因产物结合并且影响它的活性)。
2．一种如权利要求1所要求的核酸构建体，其中-组分a)是转录组分b)的活化序列；-组分b)是转录因子，其包含b1)活化区b2)细胞调节蛋白的结合序列b3)DNA结合区；-组分c)是活化序列，其通过与组分b)的表达产物结合而得到活化并可激活组分d)的转录；以及-组分d)是效应基因。
3．一种如权利要求1所要求的核酸构建体，其中组分a、b和c以组分a′、b′和c′形式起作用-组分a′)用于转录组分b′)的活化序列，其中组分b′)包含a1)细胞调节蛋白的DNA结合序列a2)基础启动子-组分b′)转录因子，其构成阻抑蛋白并抑制组分c′)-组分c′)活化序列，其包含c1)用于转录组分d)的活化序列c2)DNA序列，其与阻抑蛋白[组分b′)]结合并由此抑制组分d)的转录的活化-组分d)效应基因。
4．一种如权利要求2所要求的核酸构建体，其中组分a)与组分c)相同。
5．一种如权利要求2或者3所要求的核酸构建体，其中组分a)或者组分c1)是启动子序列，该序列可得到非特异性、细胞特异性、以代谢特异性方式、病毒特异性和/或细胞周期特异性活化。
6．一种如权利要求5所要求的核酸构建体，其中组分a)或者组分c1)选自下列物质组成的组-启动子，其在内皮细胞，腹膜细胞，胸膜细胞，皮肤、肺脏、胃肠道或肾和尿道的上皮细胞中；在肌肉细胞中；在结缔组织细胞中；在造血细胞中；在巨噬细胞中；在淋巴细胞中；在白血病细胞中；在肿瘤细胞或者胶质细胞中得到活化，或者-来源于病毒，如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV或者HIV的启动子序列-由缺氧活化的启动子或者增强子序列，或者-cdc25C、细胞周期蛋白A、cdc2、E2F-1、B-myb和DHFR的基因的细胞周期特异性活化序列-转录因子的结合序列，其以细胞增殖依赖的方式，如单体或者Myc E盒的多体出现或活化。
7．一种如权利要求2-6之一项或多项所要求的核酸构建体，其中组分b)的活化区[组分b1)]选自包含转录因子Oct-2、Sp1、NFY、ITF-2、VP-16、c-Myc和CTF的活化区的组中。
8．一种如权利要求2-7之一项或多项所要求的核酸构建体，其中用于细胞调节蛋白的上述结合序列[组分b)的组分b2)]是细胞结合蛋白或该结合蛋白的一部分。
9．一种如权利要求8所要求的核酸构建体，其中的细胞结合蛋白或该结合蛋白的一部分结合于细胞调节蛋白上，该细胞调节蛋白选自包含p53、pRb、p130、Max、MAD、VHL、cdk-4、MTS-1(p16)、WT-1、SMAD-2和DPC-4的组中。
10．一种如权利要求9所要求的核酸构建体，其中的组分b′)选自包含E2F-1、-2、-3、-4、-5，细胞周期蛋白D1、D2、D3或C，细胞周期蛋白A、-E,Myc，转录因子PU.1或Elf-1，延长蛋白-B、-C,p14、p15、p16、p18、p21、p27、p53,Myc,cdk-4,DPC-4和SMAD-2的细胞结合蛋白的组中。
11．一种如权利要求7所要求的核酸构建体，其中细胞调节蛋白的结合序列[组分b)的组分b2)]是一种病毒结合蛋白或该结合蛋白的一部分。
12．一种如权利要求11所要求的核酸构建体，其中的病毒结合蛋白或该结合蛋白的一部分结合于细胞调节蛋白上，该细胞调节蛋白选自包含p53、pRb(p110)、NFKB、p130、CBF-1、Lyn酪氨酸激酶、bak和bax的组中。
13．一种如权利要求12所要求的核酸构建体，其中的组分b2)选自包含下列组分的病毒结合蛋白的组中CMV的IE 84,AV的E1B(55Kd),EBV的EBNA-5,EBV的BHFR,HPV-16或者-18的E6,HBV的x蛋白，SV40的T抗原，AV的E1A,EBV的EBNA-2,EBV的EBNA-1,HPV的E7,HIV的Tax,EBV的LMP-1,EBV的LMP-2A或LMP-2B,AV的E1B(16 Kd),AV的E1B(10kD)。
14．一种如权利要求7所要求的核酸构建体，其中细胞调节蛋白的结合序列[组分b)的组分b2)]是一种抗体或该抗体的一部分。
15．一种如上述权利要求之一所要求的核酸构建体，其中组分c)至少包含一个用于结合组分b)的DNA序列，并且作为这一结合的结果激活组分d)的表达。
16．一种如权利要求15所要求的核酸构建体，其中的DNA序列选自由5′-CGGACAACTGTTGACCCG-3′,SEQ ID NO.:1(对于Gal4蛋白)、5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′,SEQ ID NO.:2(对于LexA蛋白)、5′-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3′,SEQ ID NO.:3(对于LacⅠ阻抑蛋白)、 5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAA GTGAAAG-3′,SEQ ID NO.:4(对于四环素阻抑蛋白)以及5′-TAATGATGGGCG-3′,SEQ ID NO.:5(对于ZFHD-1蛋白)的结合序列组成的组中。
17．一种如权利要求11-14之一项或多项所要求的核酸构建体，其中细胞调节蛋白的DNA结合序列[组分a1)]是选自包含p53、W4-1、NFkappa B、E2F/DP或Myc/Max蛋白的组中的一种DNA结合序列。
18．一种如权利要求17所要求的核酸构建体，其中的基础启动子[组分a2)]选自包含SV40、c-fos、U2 sn RNA和HSV-TK的启动子的组中。
19．一种如权利要求18所要求的核酸构建体，其中的阻抑物[组分b′)]选自由lac阻抑基因和四环素阻抑基因组成的组中。
20．一种如权利要求19所要求的核酸构建体，其中上述阻抑物的DNA结合序列[组分c′)]包含至少一个lac操纵基因结合序列或者至少一个四环素操纵基因结合序列。
21．一种如权利要求1-20之一项或多项所要求的核酸构建体，其中的效应基因(组分d)是一种编码活性化合物的基因，该活性化合物选自由以下物质组成的组中细胞因子，趋化因子，生长因子，细胞因子、趋化因子或者生长因子的受体，具有抗增殖或抑制细胞或细胞编程性死亡效应的蛋白质，抗体，抗体片段，血管生成抑制剂，肽激素，凝固因子，凝固抑制剂，纤溶蛋白，对血液循环有作用的肽或蛋白质，血浆蛋白质和感染剂或细胞或肿瘤的抗原，所选的抗原可引起免疫反应。
22．一种如权利要求1-20之一项或多项所要求的核酸构建体，其中的效应基因是一种编码把药物前体切割成药物的酶的基因。
23．一种如权利要求1-20之一项或多项所要求的核酸构建体，其中的效应基因是一种编码配体活性化合物融合蛋白质或配体酶融合蛋白质的基因，该配体选自由细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、肽激素、介体和细胞粘着分子组成的组中。
24．一种如权利要求2所要求的核酸构建体，其中的组分a)、b)、c)和d)具有如下特征-组分a)·cdc25C基因的启动子(核酸-290至+121)-组分b)·SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID NO.:13))·HSV-1 VP16的酸性反式激活区(TAD)(氨基酸406-488)·E2F-1蛋白质的RB结合序列(氨基酸409-426(LDYHFGLEEGEGIRDLFD)(SEQ ID NO.:14))·Gal4蛋白质的DNA结合区(氨基酸1-147)的cDNA-组分c)·10x具有核苷酸序列5′-CGGACAATGTTGACCG-3′(SEQ ID NO.:1)的Gal4 DNA结合序列的结合序列·SV40基础启动子(核酸48-5191)-组分d)·序列GCCACC·免疫球蛋白信号肽的cDNA(核苷酸序列63-107)·β-葡糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93-1982)。
25．一种如权利要求2所要求的核酸构建体，其中的组分a)、b)、c)和d)具有如下特征-组分a)·cdc25C基因(核酸-290至+121)的启动子-组分b)·SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID NO.:13))·HSV-1 VP16的酸性反式激活区(TAD)(氨基酸406-488)·HPV-18病毒的E6蛋白(核苷酸序列100-578)·Gal4蛋白质的DNA结合区(氨基酸1-147)的cDNA-组分c)·10x具有核苷酸序列5′-CGGACAATGTTGACCG-3′(SEQ ID NO.:1)的Gal4 DNA结合序列的结合序列·SV40基础启动子(核酸48-5191)-组分d)·序列GCCACC·免疫球蛋白信号肽的cDNA(核苷酸序列63-107)·β-葡糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93-1982)。
26．一种如上述权利要求之一所要求的核酸构建体，其中的核酸是DNA。
27．一种如前面的权利要求之一所要求的核酸构建体，其中的核酸构建体插入到载体中。
28．一种如权利要求27所要求的核酸构建体，其中的载体是一种质粒载体。
29．一种如权利要求27所要求的核酸构建体，其中的载体是一种病毒载体。
30．一种如权利要求1-29之一项或多项所要求的核酸构建体，其中该核酸构建体通过外敷、口服、膀胱内、鼻部、支气管内或者使之进入胃肠道而得到施用，或者注射进入器官、体腔、肌肉组织、皮下或者血液循环系统中，从而达到预防或治疗疾病的用途。
31．一种分离细胞，该细胞包含一种如权利要求1-29之一所要求的核酸构建体。
32．如权利要求1-29之一项或多项所要求的核酸构建体或者如权利要求31所要求的细胞的用途，该用途为用于制备治疗选自由传染病、肿瘤、白血病、自身免疫性疾病、变应性变态反应、关节炎、炎症、器官排斥、移植物抗宿主反应、凝血病、循环疾病、贫血、激素疾病、CNS损害组成的组中的疾病的药物。
33．一种用于制备如权利要求1-30之一项或多项所要求的核酸构建体的方法，该方法包含逐步地将单个元件结合在一起。
34．如权利要求31所要求的细胞的用途，该用途为用于制备用来预防或治疗如权利要求32所要求的疾病的药物，其中至少一个细胞通过外部、膀胱内、鼻部、支气管内、口服施用或施用进入胃肠道，或者注射进入器官、体腔、肌肉组织、皮下或者血液循环系统。
全文摘要
本发明涉及一种用于表达效应基因的核酸构建体,该核酸构建体包含控制转录因子(组分b)(也包含在该核酸构建体中)基因表达的启动子Ⅰ(组分a),并且包含转录因子基因的基因产物特异地与其结合以及控制效应基因(组分d)(也包含在该核酸构建体中)表达的启动子Ⅱ(组分c),其中转录因子基因的基因产物的活性取决于一种或多种细胞调节蛋白(特异地与该基因产物结合并且影响它的活性),涉及包含上述核酸构建体的分离细胞,涉及利用上述构建体制备治疗疾病的药物的用途,涉及用于相同目的上述细胞的用途以及涉及制备上述核酸构建体的方法。
文档编号A61K48/00GK1221033SQ9812253
公开日1999年6月30日 申请日期1998年11月20日 优先权日1997年11月21日
发明者R·米勒, H－H·塞德拉希克 申请人:德国赫彻斯特马里奥罗塞尔有限公司