专利名称：聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸酯作为制备温热治疗肿瘤增敏药的用途及其制法的利记博彩app
技术领域：
本发明揭示一种有增强温热治疗肿瘤作用的增敏药——聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸酯(即吐温80)的用途及其制法，涉及药品的制备方法。
温热疗法具有选择性抗肿瘤作用，其作用的独特性以及与其它疗法如化学疗法、放射疗法间的互补性和协同性，使之成为现代肿瘤治疗的重要手段之一。临床上，温热常与化疗药物合并治疗多种肿瘤，包括浅表、深部、原发或继发性肿瘤，取得良好疗效，逐步形成了温热化学疗法这一新领域。但是，温热治疗肿瘤达到疗效所需的临界温度范围较高(42.5～43℃)，合并化疗所用抗癌药物毒性反应通常较大，这些不足之处不同程度地影响了温热化学疗法的应用及其推广。因此，寻找理想的温热协同药物，降低温热临界温度，提高疗效，减少副作用，是促进该疗法推广应用的关键。国际上公认的理想的温热协同药物应是常温下无明显细胞毒性，而在39～42℃范围内能明显选择性杀伤肿瘤细胞的药物。
已有技术中聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸脂(即吐温80)，在美国药典法定名为“polysorbas”，是山梨醇的一次和二次脱水产物，结构式为
由于分子中有亲水性聚氧乙烯基H(G2H4O)nO-大大增加了亲水性，因而是非离子型水溶性表面活性剂。被列为无公害或低公害附加剂。近年来广泛应用在医学、日化和食品工业，医药中作为注射剂及其他剂型中的增溶、乳化剂、分散剂，也可以作为药用辅料。(中华人民共和国药典，一九九五年版二部，P1039-1040，化学工业出版社和药剂学，一九六五年二月第一版，P78-81，人民卫生出版社)。这类表面活性剂口服相对无毒性，每天口服6克连续24天、有的服用达4年之久都没有任何不良反应。其半数致死量口服可达25g/kg、静脉给药为5800mg/kg。注射后的溶血作用小于其他助溶剂，0.1％的浓度无论在体内或体外试验均不引起溶血。文献报道上海大众制药厂的产品在浓度为0.2％时也不产生溶血，肌肉注射产生溶血作用的最大剂量比静脉注射量大10倍，因而是一种安全、常用的药物。
本发明目的在于提出一类新型理想温热协同增敏药物，增强温热抗肿瘤效应，降低温热治疗肿瘤的临界温度，能在39℃～41℃温热时即产生明显的协同抗肿瘤效应及其制备方法。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的在常温下吐温80几乎无毒性，可从静脉给药，使吐温80具有增强温热杀伤肿瘤细胞的效应，降低温热作用的临界温度，抑制肿瘤热耐受性产生，与温热协同在39℃～41℃即能显著抑制肿瘤生长与转移，对正常细胞无明显影响，这与已知吐温80的助溶剂作用不同，和已知的抗癌药物与温热协同作用也不同，从而可以用来制备作为局部和全身温热治疗肿瘤增敏药物，用于肿瘤的治疗。
吐温80作为温热治疗肿瘤增敏药的制备方法，其技术特征在于a．将吐温80溶解于0.8～0.9％NaCl溶液中，配制成5～10％(重量/体积)浓度；b．再加CaCl2(1.0～1.5mM)、KCl(5.0～5.5mM)、MgSO4(0.5～0.8mM)及葡萄糖(1～5％)，用Na2HPO4/KH2PO4调节pH至7.2～7.4；c．经0.45μm微孔滤膜过滤，8磅10分钟高压灭菌，待冷却并使其完全溶解。
本发明的技术方案，通过实验研究结果如下一．细胞学研究1．细胞培养肿瘤细胞人胃癌细胞系(BGC-823)；正常细胞选用人胚肺成纤维细胞、人包皮成纤维细胞或正常人红细胞。2．实验分组随机分成以下各组吐温80合并温热组(合并组)接种细胞培养后24小时加吐温80，最终剂量为0.1％(重量/体积)。吐温80作用24小时，于作用结束前，分别在高精度水浴箱中进行39℃、41℃、43℃(±0.1℃)，作用20、60、100分钟的温热处理。换新培养液继续培养。
加温组加等容量的平衡液(Hanks)，加温条件同合并组。
吐温组加吐温80条件同合并组，37℃中培养。
平衡液(Hanks)组加等容量的平衡液，37℃常温培养。
丝裂霉索C(MMC)组方法和条件与上述各组一致，丝裂霉素C最终浓度为0.05μg/ml。
正常细胞组方法和条件与上述各组一致。3．观察指标A．克隆形成率在24孔培养板接种细胞，每孔100/ml，加热温度除上述外，另增加45℃组，作用时间增加40分及80分组。共培养10天后Giemsa染色，观测克隆数、计算克隆形成率。根据曲线测定平均致死处理时间to及致死率k值(k=1/to)，绘制Arrhenius曲线，计算活化能的改变。
B．生长曲线每小瓶内种入1×105/ml的细胞2ml，每日每组取3瓶(每瓶计数4次)计每毫升细胞数，取均值。连续观察5天，绘制曲线。
C．细胞电泳率(EPM)用微量细胞电泳装置及测定方法，测定温度25℃±0.5℃,pH=7.2，电压40V、毛细管长4.5cm、细胞泳动距离165μm、每组三瓶每瓶测三次取均值。
D．细胞膜流动度用DPH(sigma公司产品)标记细胞，日立851型荧光分光光度计测定，激发光波长362nm，发射光波长432nm，狭缝均为5nm，测定温度37℃，加温各组按相应温度测定。测出IVV、IHH、IVH和IHV荧光强度，求出荧光偏振度P和膜脂区微粘度η。
E．琥珀酸脱氢酶(SDH)的组化观察将培养于盖玻片上之细胞经Nitro-BT法染色，显微镜观察，并用MPV-Ⅲ显微分光光度计扫描法作定量分析。λ为530nm、扫描半径1.2μm、每组随机取30个细胞，细胞的消光值为SDH相对活性。
结果1．克隆形成率温热合并吐温80作用后，克隆形成率随温度、处理时间增加呈指数下降，Arrhenius曲线在39℃～45℃间无明显折点，活化能下降为112kcal/mol，而加温组的Arrhenius曲线上，在42℃左右有一折点，在此折点上、下的活化能分别为182kcal/mol和309kcal/mol，致死率k与温度之间呈反应速度论关系。41℃时，加温组∶合并吐温组∶合并MMC组的致死率比值为1∶5.2∶3.7，可见吐温80使温热的致死率提高约5倍左右。在常温下，MMC作用的克隆形成率与吐温80相似(P＞0.05)。2．生长曲线肿瘤细胞在常温下种入后24小时进入指数增生期并持续增长，随温度升高、作用时间延长，细胞的增长受到渐进性抑制，至43℃100分细胞受到严重抑制，作用后72小时细胞数仍不能恢复到种入水平。
吐温80在37℃就显示有轻度的抑制肿瘤细胞作用，与温热合并后，抑制癌细胞生长作用明显强于相应加温组，合并作用41℃100分效应超过加温43℃100分效应，提高温热作用效应2℃左右，在同一温度中也可明显缩短作用时间。丝裂霉素C(MMC)在37℃时也有一定抑制癌细胞作用，与温热的协同效应明显低于吐温80，达43℃才有所显示。吐温80合并温热对人胚肺成纤维细胞抑制效应较弱。3．细胞电泳率(EPM)常温下肿瘤细胞EPM明显高于正常人包皮成纤维细胞，温热和吐温80对肿瘤细胞的EPM影响均明显大于正常细胞。加温组随温度、时间增加，肿瘤细胞EPM明显下降，43℃、60分以上各组下降更为显著，且难恢复。吐温80降低肿瘤细胞EPM作用明显且持久。温热合并吐温80对肿瘤细胞有明显的协同效应，合并41℃、100分即时组已接近加温组43℃60分效应(P＞0.05)，且恢复较慢。合并43℃各组96小时后仍恢复困难。正常细胞经合并作用后各组也稍低于相应各加温组，但改变明显小于肿瘤细胞，而且96小时后恢复也较明显。4．细胞膜流动性吐温80合并温热时各组膜流动性均较加温组明显增强，合并41℃60分组膜流动性已达43℃100分加温水平，各温热组均显示加温时间效应，冷却后各组有不同程度恢复，但合并41℃100分以上恢复较慢。吐温80与温热合并对正常细胞作用较肿瘤细胞弱，且易恢复。5．琥珀酸脱氢酶(SDH)形态学和SDH相对活性测定显示，合并组作用后各组细胞内SDH颗粒均较相应加温组明显减少，协同效应明显，合并41℃20分作用已超过加温组43℃100分效果，显示有提高温热作用2℃效应。作用后48小时各组仍保持一定的协同效果，但协同效果以即时最为明显。二．动物学研究1．实验动物雄性BALB/C小鼠(清洁级)，由上海中科院动物中心提供，用于建立荷瘤鼠模型。2．细胞培养B16小鼠黑色素瘤细胞(上海中科院细胞所提供)常规培养于含10％新生小牛血清、0.25mM Hepes、100μ/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中。指数生长期细胞经胰酶、EDTA消化，收集于1640培养基，所有实验中，细胞存活力均在95％以上。3．肿瘤生长曲线于小鼠后足掌皮下接种5×105 B16细胞，10天后，足部肿瘤可达到平均0.5×0.5cm2大小。荷瘤鼠被随机分为4组温热组(41℃、60分钟水浴)；吐温组；合并组；对照组。处理后隔日用游标卡尺测量足部肿瘤三径的变化，计算肿瘤体积大小，根据肿瘤体积的变化绘制肿瘤生长曲线。4．荷瘤鼠的死亡率建立小鼠腹腔B16肿瘤模型，接种后10天，如上所述，小鼠被随机分为4组。处理后，小鼠在标准条件下继续喂养10周，观察小鼠的生存和死亡情况。5．肺部转移瘤灶B16细胞预先分别经吐温80,41℃温热及吐温80与温热合并作用处理，然后由尾静脉接种4×105肿瘤细胞至每只小鼠，三周后，小鼠被引颈处死，解剖镜下计算两肺所形成的B16黑色素瘤灶数(＞0.1mm3)。
结果1．生长曲线小鼠足部肿瘤的生长曲线见
图1，吐温80与温热合并作用，肿瘤虽然也因加热水肿一度增大，但随着水肿在一周后消退，肿瘤的体积继续减小，至作用后第三周，肿瘤体积仅为作用初期肿瘤大小的60％。大多数小鼠存活，其中8只小鼠肿瘤消失，仅在接种局部留有少许色素沉着。2．荷瘤鼠死亡率经吐温80和温热合并作用后，小鼠死亡率明显低于其它组(P＜0.05)。小鼠的平均存活时间比其它各组大大增加(见图2)，其中9只(1/3)小鼠存活时间超过120天，被认为获得治愈。3．肺部转移瘤灶吐温80合并温热能显著地减少荷瘤鼠肺部的转移瘤灶(由192.11±92下降为16.78±16；P＜0.01)。
本发明的明显特点是1．吐温80可引起细胞质膜系统结构和生物特性的改变，是一种细胞质膜作用药物。
2．吐温80合并温热(39～41℃)能显著抑制肿瘤细胞和小鼠黑色素瘤生，一些肿瘤甚至消失；延长荷瘤鼠的生存时间和降低死亡率，对肿瘤转移有十分明显的抑制效应，41℃达最佳协同效应。
3．吐温80与温热在体内外均有明显的协同抗肿瘤效应，可使温热治疗肿瘤所需临界温度下降了关键的2℃(由43℃降为41℃)。为临床进行自身可控发热治疗肿瘤提供了依据。
4．吐温80与41℃温热的协同可抑制热休克蛋白70的表达，从而阻碍热耐受性产生；协同诱导细胞的程序性死亡和促进免疫系统的激活。
5．吐温80合并温热对肿瘤组织、细胞有选择性抑制作用。
6．制备方法操作简便，成本低，适合于工业化生产。
下面结合实施例，对本发明作进一步描述实施例1吐温80作为增敏药的制备，取CaCl2150mg先溶于100ml的0.8％生理盐水中；另称取350mg KCl、120mgMgSO4、葡萄糖10g溶解于800ml的0.8％生理盐水中；将CaCl2溶液缓缓倒入后者中，用Na2HPO4/KH2PO4调节pH至7.2，并添加0.8％生理盐水至1000ml，此液作为溶剂。称取吐温80，配成5％(重量/体积)溶液，用0.45μm微孔醋酸纤维滤膜过滤后，8磅10分钟高压灭菌，待冷却并使其完全溶解。
在临床上作为肿瘤全身治疗，抽取5％增敏药200ml静脉滴注，15分钟后进行热疗仪体外加热(或药物诱导病人发热)，体温在40.5℃～41℃，维持1小时，每周治疗一次，4周为一疗程。
实施例2吐温80作为增敏药的制备，取CaCl2150mg先溶于l00ml的0.8％生理盐水中；另称取350mg KCl、120mgMgSO4、葡萄糖10g溶解于800ml的0.8％生理盐水中；将CaCl2溶液缓缓倒入后者中，用Na2HPO4/KH2PO4调节pH至7.2，并添加0.8％生理盐水至1000ml，此液作为溶剂。称取吐温80，配成10％(重量/体积)溶液，用0.45μm微孔醋酸纤维滤膜过滤后，8磅10分钟高压灭菌，待冷却并使其完全溶解。
在临床上作为肿瘤局部治疗，抽取10％增敏药500ml进行膀胱灌流，同时进行热疗仪体外加热，体温在41.5℃，维持1小时，每周治疗二次，4周为一疗程。
权利要求
1．聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸酯作为制备温热治疗肿瘤增敏药的用途，聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸酯商品名为吐温80，美国药典法定名称是“Polysorbas”，它的结构式为
本用途的特征在于吐温80具有增强温热杀伤肿瘤细胞的效应，降低温热作用的临界温度，抑制肿瘤热耐受性产生，与温热协同在39℃～41℃即能显著抑制肿瘤生长与转移，对正常细胞无明显影响，这与已知吐温80的助溶剂作用不同，和已知的抗癌药物与温热协同作用也不同，从而可以用来制备作为局部和全身温热治疗肿瘤增敏药物用于肿瘤的治疗。
2．如权利要求1所述的吐温80作为温热治疗肿瘤增敏药的制备方法，其特征在于a．将吐温80溶解于0.8～0.9％NaCl溶液中，配制成5～10％(重量/体积)浓度；b．再加CaCl2(1.0～1.5mM)、KCl(5.0～5.5mM)、MgSO4(0.5～0.8mM)及葡萄糖(1～5％)，用Na2HPO4/KH2PO4调节pH至7.2～7.4；c．经0.45μm微孔滤膜过滤，8磅10分钟高压灭菌，待冷却并使其完全溶解。
全文摘要
本发明是一种对温热治疗肿瘤有增强作用的药物——聚氧乙烯脱水山梨醇酐单油酸酯的用途及其制法,它具有降低温热治疗肿瘤的临界温度,抑制肿瘤热耐受性产生,提高温热抗肿瘤作用的特点,并且不同于其它温热协同药物,能在39℃～41℃温热时即产生明显的协同抗肿瘤效应,对正常细胞组织无明显毒副作用,其制造工艺亦具有成本低、操作简便,适宜大规模生产等特点。
文档编号A61K31/74GK1207293SQ9811100
公开日1999年2月10日 申请日期1998年8月14日 优先权日1998年8月14日
发明者杨虎川, 杨耀琴, 陶惠红 申请人:上海铁道大学