具有抗微生物活性的药物组合物的利记博彩app

专利名称：具有抗微生物活性的药物组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及含有透明质酸缔合物(配合物)的抗微生物药物组合物及其制备方法。
本发明还涉及这些透明质酸缔合物(配合物)用于制备具有抗微生物活性的药物组合物的用途和用于治疗微生物诱发的临床适应症的方法。
现已发现透明质酸缔合物(配合物)，即透明质酸锌和透明质酸钴显示了抗微生物活性，它们尤其对需氧微生物和厌氧微生物具有有益的抗细菌和杀真菌活性。
在匈牙利的第203372号专利说明书中讨论了脱质子的透明质酸与元素周期表的第4周期的3d金属离子的缔合物，如透明质酸锌和透明质酸钴尤其对脚溃疡或褥疮等具有治疗作用。
通常以其钠盐形式出现的大分子透明质酸已有近50年的历史。它首次由Meyer等记述[生物化学杂志(J.Biol.Chem.),107,629(1934)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.),114,689(1939)]。Meyer在酸性条件下分离了透明质酸。然而，其羧基在生理pH值下是解离的；如果环境阳离子是钠，则该多糖的名称为透明质酸钠。Weissman等进行了结构确定[美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),76,1753(1954)]。环境阳离子的确定不总是那么容易，因此，按照Balazs的建议(The Biology of Hyaluronan 1989,JohnWiley and Sons,Ciba Foundation Symposium,p.1 43)，该多糖(透明质酸和透明质酸钠)的通用名称为hyaluronan。
透明质酸是一种包含交替β1-4葡糖胺结构的高粘度天然葡糖胺聚糖(glucosaminoglycan)；其分子量介于50000-数百万之间。透明质酸发现于所有哺乳动物的结缔组织中；它在皮肤、眼玻璃体、滑液、脐带以及软骨组织中具有较高浓度。透明质酸的回收是一项古老的工作，超纯透明质酸的分离和使用记载于例如美国专利说明书4141973、4303676和欧洲专利说明书0144019中。
在文献中发现有许多涉及透明质酸与伤口愈合关系的参考文献。按照Toole和Gross的记载[B.P.Toole es Gross:“再生新肢的胞外基质分化前透明质酸的合成和去除”，生物学进展(Dev.Biol.),25,55-57(1971)],作为胞外基质主要成分的透明质酸影响到各种类型细胞的移动。上面的作者通过实验观察描述到在伤口愈合期间，透明质酸局部浓度增加，从而组织再生所需的细胞反应受到激发。此外，其他试验结果还证实了透明质酸通过对所有负责组织再生的细胞提供最佳移动和增殖条件调节伤口愈合生理细胞的事实。
直到近年来，透明质酸才以钠盐的形式用于治疗-主要用于眼科、皮肤科、外科、关节治疗，以及化妆品学。透明质酸与碱金属、碱土金属形成的盐、其镁盐、铝盐、铵盐和取代的铵盐可用作促进药物吸收的载体(参见比利时专利说明书904547)。透明质酸的重金属盐，其中有银盐被用作杀真菌剂，而金盐被用于治疗关节炎(参见专利说明书WO 87/05517)。但是，据知其银和金化合物具有数种负作用，即它们对免疫系统、造血器官和神经系统的副作用[M.Shinogi,S,Maeizumi:“金属硫蛋白的前诱导对银的组织分布及肝脏脂质过氧化的作用”，生物药学通报(Biol.PharmBull.)(日本),16,372-374(1993)；C,Masson等Rev.Med.Interne(法国),13,225-232(1992)]。
我们意外地发现透明质酸缔合物，即透明质酸锌和透明质酸钴可用于加速上皮缺乏的体表的上皮形成，用于脚溃疡的愈合以及褥疮溃疡的愈合，具有明显的抗微生物作用，更具体地说是抗细菌和杀真菌作用；此外，在抗细菌活性中，它们还具有抗幽门螺杆菌的活性，该菌近年来被认为与胃和十二指肠溃疡的发展有主要关系。
透明质酸缔合物的抗细菌作用被认为是出人意料的，因为直至现在认为已知的透明质酸的伤口愈合性上皮形成的促进作用是基于上述讨论的透明质酸在伤口愈合期间的机体友好行为，但由此并不能得出透明质酸缔合物的抗微生物作用。
根据我们的研究证明透明质酸锌和透明质酸钴缔合物对需氧和厌氧菌如金黄色葡萄球菌、链球菌sp.、绿脓杆菌、沙门氏菌sp.、大肠杆菌和幽门螺杆菌十分有效。
由于金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌是两类与眼感染有关的细菌，透明质酸配合物可有效地对抗这两种微生物是十分重要的，看来将透明质酸缔合物运用于眼科是十分有前景的。
在眼科中眼内使用透明质酸钠是公知的。从1980年开始，它就被广泛地运用于白内障手术、人工晶状体移植、角膜移植术中。当施用于前室(anterior chamber)时，它抑制在手术期间前室的塌陷并保护敏感组织和细胞。术后，将透明质酸钠从眼内洗掉以避免在有些时候出现的眼压的增加。
透明质酸钠还用于治疗“干眼”症[F.M.Polack等“使用透明质酸钠治疗干眼症”，角膜(Corea),133-136(1982)]。
眼感染的局部抗菌治疗是利用本发明的缔合物的另一个重要领域。
由于它们的抗菌作用，透明质酸锌和透明质酸钴缔合物似乎在眼科治疗中尤其有用；主要是透明质酸锌在该领域中特别有前景。除了其润滑作用外，透明质酸锌可有益地用作眼科局部抗菌剂；但它也可作为自1980年来广泛用于眼内的透明质酸钠的竞争物质用于眼手术，这是由于它的抗菌作用可克服所发生的轻微炎症反应[K.L.Goa等“透明质酸，药理学和应用综述”，药物(Drugs),47,536-566(1994)]和降低了手术期间的感染危险性。锌作为眼中必需的微量元素的作用很早就为人们认识到了[D.A.Newsome,R.J.Rothman“体外人视网膜色素上皮对锌的摄取”，眼科学研究(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.),28,795-799(1987)]。使用透明质酸锌特别有益，它可避免在眼科手术中可能发生的锌的减少。即作为聚阴离子的透明质酸可通过术后洗涤带走阳离子。不能排除通过配位键与透明质酸结合的锌，在眼中的量可能减少。使用透明质酸锌就可消除该现象。
大家都知道，眼的细菌污染是一个严重健康问题。最常见的是葡萄球菌污染。对眼十分有害的绿脓杆菌污染不太常见。眼部这些细菌的感染可在24-48小时导致完全失明。眼部感染常由于污染的眼科溶液(滴眼液或隐性眼镜储存液等)而产生。这类污染的眼科溶液常见于诊察室、临床并十分普遍地被患者或顾客自用。污染的微生物最常见的是葡萄球菌类；绿脓杆菌虽不太常见，但十分危险，它能在眼科溶液中快速生长(雷明顿眼用防腐剂(Remington’s Ophthalmic Preservatives),86章，1588)。因此，由于它们具有十分强的对抗这两种微生物的活性，透明质酸锌和透明质酸钴缔合物在眼科的使用显得十分重要。
微生物学研究证实了所述化合物的抗微生物作用。对根据匈牙利专利说明书203372的透明质酸锌和透明质酸钴溶液进行这些测试，使用透明质酸钠溶液作为对照溶液。
下面实施例1显示了0.5％透明质酸锌溶液的制备。除非另有说明，下文的百分数均是指重量/体积值，hr表示小时。
通过用实施例中所述质量的蒸馏水稀释0.5％透明质酸锌分别获得0.1和0.2％浓度的溶液。实施例1100ml 0.5％透明质酸锌溶液的制备用于制备该溶液的透明质酸钠的特性如下分子量1000000道尔顿蛋白含量0.045％UV吸收A1％257nm:0.085A1％280nm:0.050粘度ηC→025℃=17.25dl/g透明质酸含量99.3％在无菌条件下进行如下操作。
在100ml烧瓶中称重0.50g透明质酸钠后，加入12.50ml用双蒸水(注射用水，不含热源，无菌)制备的0.10mol/升浓度的氯化锌溶液，然后补加双蒸水至50ml体积。使其溶胀过夜，然后通过振摇使其溶解，最后补加双蒸水。使该溶液滤过0.45μm孔径的滤膜，得到含0.50％透明质酸锌的溶液。实施例2100ml 0.5％透明质酸钠溶液的制备如前所述，将实施例1使用的透明质酸钠0.50g溶于100ml双蒸水(注射用水，不含热源，无菌)中，获得0.5％透明质酸钠溶液。通过用上述质量的蒸馏水稀释该0.5％溶液分别制备0.1％或0.2％的溶液。第一系列实验用相同细菌数量的各种试验微生物人工感染0.2％的透明质酸锌和透明质酸钠溶液(按照实施例1和2，通过稀释0.5％的溶液制备)，并观察细菌数量随时间的变化。用平皿培养法在指定时间测定细菌的数量。肉眼观察霉菌并使用自动菌落计数器计数细菌和真菌以进行评价。
采用的培养基大豆-酪蛋白琼脂(Caso-agar/Merck/.)采用保藏在国立公共卫生研究院的国家菌种保藏中心(NationalStrain Collection of National Institute of PublicHealth(HNCMB))的微生物作为试验微生物。
采用的微生物金黄色葡萄球菌，链球菌sp.,大肠杆菌，沙门氏菌sp.，白色念珠菌，黑曲霉试验微生物的起始数量∑106/ml平行试验的个数3使用的溶液1-0.2％透明质酸锌水溶液2-0.2％透明质酸钠水溶液结果如表1和2所示。
表10.2％透明质酸锌水溶液对抗各种试验微生物的作用(所给出的为每毫升中试验微生物的数量)<
>表20.2％透明质酸钠水溶液对抗各种试验微生物的作用(所给出的为每毫升中试验微生物的数量)<
<p>从表1和2综合的结果可以看出，24小时后的抗微生物作用有很大差别。0.2％透明质酸锌溶液对所研究的大多数试验微生物的数量减少了数个数量级，而在透明质酸钠溶液组的试验微生物的数量没有明显变化。第二系列实验为证明透明质酸锌的抗微生物作用，还进行了除0.2％浓度以外的试验，同时不同程度地延长了试验时间。表3说明了0.1％透明质酸锌和透明质酸钠溶液对三种不同试验微生物的作用。
表3
从透明质酸锌的实验看出，葡萄球菌和沙门氏菌实验微生物的数量在48小时内实际减少到了零；但用透明质酸钠进行的观察结果是试验微生物数量几乎仍保持在相同的数量级上。观察到对绿脓杆菌的作用产生得稍晚，但其数量仍在第二天就明显减少了。第三系列实验由于绿脓杆菌在眼科学中的重要性，研究了与具有相同浓度的透明质酸钠溶液相比的各种浓度的透明质酸锌溶液对绿脓杆菌的作用。结果概述于表4和5中。
表4透明质酸锌对绿脓杆菌的作用
表5透明质酸钠对绿脓杆菌的作用
从上表的结果表现出了有益的走势即透明质酸锌溶液比透明质酸钠溶液明显有效，0.1％透明质酸锌溶液已表现出与0.2％或0.5％透明质酸锌溶液相同的活性。基于该结果，可开发有效的外用组合物。
还对透明质酸钴(Ⅱ)的抗菌作用进行了研究。在实施例3中描述了透明质酸钴溶液的制备。实施例30.1％透明质酸钴溶液的制备在100ml烧瓶中称重0.10g实施例1的透明质酸钠后，加入2.50ml用双蒸水(注射用水，不含热源，无菌)制备的0.10mol/升浓度的氯化钴溶液，然后补加双蒸水至50ml体积。使其溶胀过夜，然后通过振摇使其溶解，最后补加双蒸水。使该溶液滤过0.45μm孔径的滤膜，得到含0.10％透明质酸钴的溶液。第四系列实验除采用大肠杆菌代替沙门氏菌Salmonella sp.外，以前述相同方法进行微生物学研究。结果概述于表6。
表6
从表6的结果可清楚地看出，对研究的两种试验微生物，透明质酸钴溶液表现出与透明质酸锌溶液类似的作用；但在考虑了测量结果偏差的情况下证明作为比较的透明质酸钠仍没有活性。第五系列实验透明质酸锌缔合物的抗菌作用可用下面的与透明质酸钠的相应值比较的最低抑制浓度(MIC)和杀微生物浓度(CID)来表征。
MIC和CID值用0.2％浓度的溶液测定。以已知方式进行测定由待测试物质制备一系列稀释液，将这些稀释液用相应稀释的选定的试验微生物进行人工感染。在适宜的温度培养适宜的时间后，用肉眼评价浓度系列(concentration series)并确定最低抑制微生物生长的浓度(MIC值)或诱发微生物死亡的最低浓度(CID值)。该结果概述于表7。
表7透明质酸锌的MIC和CID值(μg/ml)
0.2％的透明质酸钠溶液对任何一种试验微生物都没有表现出抑制作用，甚至在浓度高达2000μg/ml时也是如此，因此无法测定其MIC值。
由上表7可明显看出，透明质酸锌的MIC值表明了该化合物显著的微生物学作用，其作用要比透明质酸钠好若干数量级。第六系列实验透明质酸缔合物的充满前景的眼科学应用可能性要求其具有良好的微生物学稳定性，即它们适于对抗各种微生物引起的感染。为测定透明质酸锌和透明质酸钴溶液与眼科中常用的透明质酸钠溶液相比较的稳定性，进行了广泛的研究。还研究了是否需要使用防腐剂来保存含透明质酸锌的溶液。
按照美国药典USPⅩⅫ版(P.1478)题为“抗菌防腐剂的作用”的条款进行这些测定。该研究的规则如下将待试验物质用各种试验微生物进行人工感染，观察菌落生成单位数的变化，作为时间的函数。采用保藏在国立公共卫生研究院的国家菌种保藏中心(National Strain Collection ofNational Institute of Public Health(HNCMB))的微生物作为试验微生物。在有或没有防腐剂的存在下，用各种浓度的透明质酸锌和透明质酸钠溶液进行研究。
采用平皿培养法测定样品的菌落生成单位数(细菌数)。用自动菌落计数器对细菌和真菌计数，或用肉眼分别观察霉菌进行评价。
结果如下表所示。每个结果表示三个平行样品的平均值，以菌落数/毫升表示。
表8对0.1％透明质酸锌溶液的微生物学稳定性的研究
表9对0.2％透明质酸锌溶液的微生物学稳定性的研究
表10对0.5％透明质酸锌溶液的微生物学稳定性的研究
表11对含山梨酸钾的0.5％透明质酸锌溶液的微生物学稳定性的研究
表12对含山梨酸钾的0.5％透明质酸钠溶液的微生物学稳定性的研究
根据USPⅩⅫ中的描述和通常的要求，如果在14天期间人工感染引入的细菌数减少了99％；如果试验微生物甚至在14天期间也没有繁殖；以及在研究的28天期间，没有观察到任何试验微生物的暂时性生长，则物质适宜被保存。
从研究结果可以看出1．由于在28天里采集到的样品中，5种微生物中的4种(金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌)不仅被杀灭了，而且没有观察到活的细菌，故0.1％透明质酸锌溶液的微生物稳定性符合USP ⅩⅫ的要求。黑曲霉的生长如常，但也减少了两个数量级。
2．0.2％透明质酸锌溶液的微生物学稳定性与0.1％透明质酸锌溶液的类似，因此认为也符合USPⅩⅫ要求。
3．预计0.5％透明质酸锌的稳定性也应符合USPⅩⅫ要求；实际上，结果表明该稳定性由于透明质酸锌浓度的增加得到提高。
4．含0.5％透明质酸锌和0.1％山梨酸钾的溶液稳定性足够高，但该稳定性并没有由于山梨酸钾防腐剂的存在而得到显著提高。
5．在各种微生物试验中，含0.1％山梨酸钾的0.5％透明质酸钠溶液也符合USPⅩⅫ要求。
从这些结果可以得出十分重要的结论，与透明质酸钠相反，透明质酸锌溶液根本不需要防腐剂，而透明质酸钠在防腐剂的存在下显示出的稳定性甚至比透明质酸锌溶液的稳定性还低。透明质酸钠溶液则是无条件地需要防腐剂，否则它容易被感染。
这一认识具有十分重要的意义，因为防腐剂常可引发过敏，因此它们的去除可使透明质酸锌的应用更具希望，尤其是在眼科学中。第七系列实验透明质酸钴的微生物学稳定性特征如表13所示。
表13
0.1％透明质酸钴溶液的微生物学稳定性
从表中可见，1％透明质酸钴溶液的微生物学稳定性对绿脓杆菌的作用与0.1％透明质酸锌溶液的作用一样地好。
可以观察到，几乎在接种后立刻产生作用。在72小时实验终止后，进行无菌检验，结果表明透明质酸钴对测定菌的作用不仅其本身是静态的而且其有杀菌作用。
在下列实施例中描述了眼科组合物和皮科组合物的制备，其分别用于外用。实施例4含透明质酸锌的滴眼液100ml含0.1％透明质酸锌的滴眼液的制备用实施例1描述的透明质酸钠制备滴眼液。
在100ml烧瓶中称重0.10g“纯净粉末”质量的透明质酸钠后，加入1.87ml 0.10mol/升浓度的氯化锌溶液和27.50ml 1.00mol/升浓度的山梨醇溶液。(这些溶液用双蒸水制备)。然后补加双蒸水至50ml体积。使其溶胀过夜，然后通过振摇使其溶解，最后补加双蒸水。最后使该溶液滤过滤膜(0.45μm孔径)。实施例5含透明质酸锌的皮科组合物100g含0.2％透明质酸锌的凝胶的制备用于制备该凝胶的透明质酸钠的特性如下
分子量800000道尔顿蛋白含量0.094％UV吸收A1％257nm:0.320A1％280nm:0.240粘度ηC→O025℃=14.5dl/g透明质酸含量95.2％将0.2g透明质酸钠溶于约30ml蒸馏水后，加入5.0ml 0.1摩尔氯化锌溶液。
将1.0g卡波泊尔(Carbopol)934胶凝剂与40ml蒸馏水混合，并持续搅拌1-1.5小时，使其溶胀10-12小时，然后加入1.0ml 20％氢氧化钠溶液。
将预先制备的透明质酸锌溶液滤过0.45μm孔径的滤膜，在持续搅拌下倾入凝胶中，然后用蒸馏水补加到100g。
表8-12中所示的对真菌和霉菌获得的稳定性研究的良好结果表明透明质酸锌不仅具有抗细菌作用，还具有明显的抗真菌作用。第八系列试验所述化合物对幽门螺杆菌的有效性具有相似的重要性。基于这一作用，所述化合物可用于治疗或预防胃和十二指肠溃疡的发展，主要用于预防愈合后再感染。
对幽门螺杆菌有效性的研究用1.0％(重量/体积)透明质酸锌溶液对用各种溃疡患者的胃活检样品培养的幽门螺杆菌进行研究。用1％De-Nol(胶态亚柠檬酸铋(bismuthsubcitrate))作为参照物质。用补加10％胎牛血的琼脂培养基(营养培养基)进行研究。用不含试验化合物的平皿作为对照。将接种平皿于37℃在含5％氧气和7-8％二氧化碳的气态环境下培养3-5天。该最低抑制浓度(MIC)值被认为是物质完全抑制对照平皿中细菌良好生长繁殖的最低浓度。分别测得透明质酸锌和De-Nol对试验菌株的MIC值如表14所示。
表14
从该表结果可以明显看出，透明质酸锌的对幽门螺杆菌体外活性可与治疗中使用的De-Nol活性相比。这一事实是有价值的，因为De-Nol是含铋组合物，具有不可忽视的副作用(毒性问题；此外，其摄入也令患者不舒适)，如果使用透明质酸锌，预计不会产生这类副作用。
权利要求
1．具有抗微生物活性的药物组合物，其含有透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)作为活性成分，并混合有制药工业中常用的载体和/或其它添加剂。
2．权利要求1的药物组合物，其含有透明质酸锌缔合物(配合物)作为活性成分。
3．具有抗微生物活性的药物组合物的制备方法，包括将活性成分透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)与制药工业中常用的载体和/或其它添加剂混合，并将该混合物转化为药物组合物。
4．权利要求3的方法，包括使用透明质酸锌缔合物(配合物)作为活性成分。
5．透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)用于制备具有抗微生物活性的药物组合物的用途。
6．透明质酸锌缔合物(配合物)用于制备具有抗微生物活性的药物组合物的用途。
7．透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)用于治疗细菌和真菌感染以及幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡的用途。
8．透明质酸锌缔合物(配合物)用于治疗细菌和真菌感染以及幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡的用途。
9．细菌和真菌感染以及幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡的治疗方法，包括给患者单独或以其药物组合物形式施用治疗有效量的透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)。
10．权利要求9的细菌或真菌感染以及幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡的治疗方法，包括给患者单独或以其药物组合物形式施用一个或多个有效剂量的透明质酸锌缔合物。
11．透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)用于预防幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡愈合后再感染的用途，包括给患者单独或以其药物组合物形式施用一个或多个治疗有效剂量的透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)。
12．透明质酸锌缔合物(配合物)用于预防幽门螺杆菌诱发的胃和十二指肠溃疡的愈合后再感染的用途，包括给患者单独或以其药物组合物形式施用一个或多个有效剂量透明质酸锌缔合物(配合物)。
全文摘要
本发明涉及具有抗微生物作用的药物组合物以及其制备方法。本发明的药物组合物含有透明质酸锌或透明质酸钴缔合物(配合物)作为活性成分,并混合有制药工业中常用的载体和/或其它添加剂。
文档编号A61K31/738GK1230117SQ9719788
公开日1999年9月29日 申请日期1997年9月11日 优先权日1996年9月12日
发明者J·伊雷斯, E·尼斯枚尔伊, B·斯特夫科, K·布尔格 申请人:格德昂·理查德化学工厂股份公司