抗血栓形成的材料和方法

专利名称：抗血栓形成的材料和方法
背景技术：
本发明一般涉及治疗组合物和治疗方法，该方法利用杀菌的/渗透性增加的蛋白质(BPI)的蛋白质产物来治疗血栓形成病症。
凝结或者血液凝固过程既涉及正常止血(其中血凝块使破裂血管的血液流失停止)，也涉及反常的血栓形成(其中血凝块阻止血液在血管中的流通)。在正常的止血期间，血小板群粘着在受伤害的血管上并凝聚以形成初期的止血栓。然后，血小板群刺激血浆凝固因子的局部活化，导致加强血小板凝聚的血纤蛋白凝块的产生。而后，当伤口愈合时，血小板凝聚体和血纤蛋白凝块由特异地活化的蛋白酶所降解。在血栓形成的病理过程期间，由同一机制形成堵塞血管的血小板/血纤蛋白凝块。动脉血栓形成能使由动脉供养的组织产生局部缺血坏死，例如由于冠状动脉的血栓形成而引起的心肌梗塞，或者由于脑部动脉的血栓形成而引起的中风。静脉的血栓形成可以使得由静脉引流的组织发生水肿和发炎，并且深静脉的血栓形成可以导致肺部栓塞。
与下列病症相伴随的血栓形成有一种增加的趋势外科手术、创伤、许多炎性病症、恶性肿瘤、妊娠、肥胖症、血管病症以及长期固定。遗传的血栓形成趋势(相当稀少)正日益得到人们的认识，并且该趋势包括蛋白质C-蛋白S系统的缺陷、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的缺陷、血纤蛋白原异常症以及血纤蛋白溶解系统的其它病症。凝固性过高的危险的评估包括检查血栓栓塞的家族史和检查其它的系统的素因性疾病或者状况(其有利于局部的血管郁滞，如长期固定、妊娠或者恶性肿瘤)，以及评估可能出现的实验反常(如血小板增多、提高的血液或者血浆粘度以及凝固因子或者血纤蛋白降解产物的提高的血浆水平)。虽然因这类反常而致的凝固性过高是不常见的(与如郁滞或者局部伤害的因子相比)，但是也可以测量ATⅢ、蛋白质C或者蛋白质S的水平。
在弥漫性血管内凝血(DIC)中发现凝血过程的严重紊乱，DIC是一种具有以下特点的综合症状微循环中的血纤蛋白的缓慢形成以及相伴随的血纤蛋白溶解的发展。这些过程的最终结果是血小板和凝血因子在血栓形成过程中的消耗，以及血纤蛋白溶解过程中的几个凝血因子的蛋白水解消化，从而导致患者血液的凝固性减少。DIC从不作为初期病症发生；它通常在另一种病症之后发生。这些初期病症分成三种一般种类(1)促凝血物质向血液中的释放，该释放可以发生在羊膜液栓塞、胎盘早期脱离、某些蛇咬伤以及各种恶性肿瘤中，(2)血液与受伤害的或者反常的表面的接触，该接触可以发生在大面积烧伤、感染、中暑、器官移植中以及在体外循环期间，以及(3)在血液之内的促凝血活性物质的产生，如果红或白血细胞或血小板膜受到破坏并释放促凝血物质，那么该产生过程可以发生，例如在白血病治疗期间，溶血性输血反应和微血管溶血性贫血。在格兰氏阴性细菌上的、与其相联系的或从其中释放的细菌内毒素也有与组织促凝血酶原激酶相类似的性质，该性质使凝血过程开始。
血管内凝血最经常与以下病症一起发生休克、脓毒症、癌症、产科并发症、烧伤以及肝病。对于DIC没有任何独一无二的具体症状或征候。然而，出血比血栓形成明显得多。凝血因子活化和消耗的速率和程度、天然存在的抑制剂的浓度以及血纤蛋白溶解活性的水平决定了出血趋势的严重程度。在一些患者中没有任何出血或血栓形成的临床迹象，并且仅仅由于异常血液凝固检验的结果而使上述综合征变得明显。许多患者只发展了一些瘀点与瘀斑区域，并且出血比通常从静脉穿刺点的出血稍少一些。由于严重的胃肠出血或者泌尿生殖器官出血，更显著的弥漫血管内凝血形式可以变得明显。在一些实例中，出血可以导致死亡。由DIC综合征所造成的出血尤其可以对生命产生威胁，该生命威胁与产科并发症有关或者与外科手术相联系。
凝血过程的终点是一种强有力的丝氨酸蛋白酶的产生，该凝血酶切割可溶性血浆蛋白质血纤蛋白原以便血纤蛋白链的不溶性网状组织发展，从而滞留红细胞和血小板以形成稳定的血凝块。这一凝血过程可以通过对血管的伤害来触发，并且其包括20多个不同的凝固因子和其它蛋白质之间的迅速的、可高度控制的相互作用，该相互作用使一些分子的初始活化增强至可形成适当大小的、充分发展的血凝块。大多数凝固蛋白质是显示高度同源性的丝氨酸蛋白酶(因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)；其它凝固蛋白质是没有酶活性的辅因子(因子Ⅴ和Ⅷ)。这些蛋白质作为无活性的酶原(其量远大于血液凝固所需的数量)来参与循环。受伤害的血管壁和血小板聚集体提供了定位和催化凝固反应的特化表面。
凝固级联可以经由两条不同的活化途径开始包括与受伤害的组织或者其它表面接触在内的内在途径，以及包括组织因子在受伤害或者发炎组织上表达的外在途径。当因子Ⅹ在血小板表面上得到活化时，这两条途径汇聚成一条共同途径。[参见，例如Cecil的医药基本原则，第3版，WB Saunders公司，宾夕法尼亚(1983)；Goodman和Gilman，治疗的药理学基础，第9版，McGraw-Hill，纽约(1996)]。当Ⅻ因子通过与改变的或者受伤害的血管表面接触或者与另一个携带负电荷的表面(如玻璃管)接触而使其活化为Ⅻa时，则内在途径开始。Ⅻ因子活化的辅因子或者启动子包括前激肽释放酶、高分子量激肽原和Ⅺ因子。这些蛋白质形成表面定位的复合物，该复合物优选激活因子Ⅻ。然后活化的Ⅻa因子把结合复合物的因子Ⅺ转化成为其活性形式Ⅺa，并且也把前激肽释放酶转化成为其活性形式激肽释放酶，该激肽释放酶然后切割高分子量激肽原而形成缓激肽。反过来，因子Ⅺa需要钙离子(Ca2+)来使因子Ⅸ激活为因子Ⅸa。因子Ⅺa也可以激活因子Ⅶ(在外在途径中)。活化的因子Ⅺa也切割纤溶酶原而形成纤溶酶，该纤溶酶是与血纤蛋白溶解机制(抑制血液凝固)有关的主要蛋白酶。当Ca2+和磷脂存在时，因子Ⅸa将因子Ⅹ激活为因子Xa，这是共同途径的第一步。因子Ⅹ的活化不仅通常发生在受刺激的血小板群的质膜上，而且也可以发生在血管内皮细胞层上。
在外在途径中，得自受伤害组织的组织因子的释放直接将因子Ⅶ激活为因子Ⅶa。组织因子存在于活化的内皮细胞层和单核细胞中，也存在于人脑、血管外膜、皮肤以及粘膜中。然后因子Ⅶa在Ca2+存在时将因子Ⅹ激活为因子Xa。此外，组织因子、因子Ⅶ以及Ca2+形成可以激活因子Ⅸ(在内在途径中)的复合物。
然后，上述活化因子Xa(在共同途径中的第一步)激活凝血酶原(因子Ⅱ)以产生蛋白酶凝血酶。在因子Ⅴ(另一个辅因子)存在时，在血小板(活化的)表面上的血浆凝血酶原酶复合物的装配提高了凝血酶原在血小板表面上活化为凝血酶的效率。凝血酶切割血纤蛋白原，该血纤蛋白原是大的、不对称的、具有大约340kd分子量的可溶性蛋白质(由三对多肽链Aα、Bβ和γ组成)。凝血酶首先从血纤蛋白原的Aα链上除去小肽以形成血纤蛋白Ⅰ，该血纤蛋白Ⅰ以首尾相连方式聚合；Bβ链的小肽的凝血酶切割也导致了血纤蛋白Ⅱ分子的形成，该血纤蛋白Ⅱ分子以左右相连方式聚合，然后经由γ亚基通过血浆谷氨酰胺酶(因子Ⅷ)交联形成不溶性的血纤蛋白血凝块。
除将血纤蛋白原切割为血纤蛋白外，凝血酶在凝固期间还有多种关键作用。它激活血小板群而使它们显示出促凝血活性(如凝血酶原酶复合物的结合部位)，并且引起血小板聚集物质(如凝血烷、Ca2+、ADP、vonWillebrand因子、纤连蛋白以及血小板反应蛋白)的释放。凝血酶切割因子Ⅷ和Va，由此加强了凝固级联，并且也切割血浆谷氨酰胺酶，该酶与血纤蛋白交联并使血纤蛋白血凝块稳定。凝血酶通过与表面蛋白质凝血调节蛋白结合来作用于内皮细胞层，从而激活蛋白质C，该蛋白质C是因子Ⅴa和Ⅷa的强力灭活剂并且也刺激血纤蛋白溶解作用。凝血酶也引起内皮细胞收缩。相反地，内皮细胞层可以结合和灭活凝血酶，并且在某些情况下可以产生血管扩张物质前列腺环素以响应凝血酶。因此，凝血酶的活化有助于限制和开始凝血。
有两种常用于测量血液凝固性的检验活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT或者PTT)和凝血酶原时间(PT)。当放置在玻璃管中，血液在体外一般在四至八分钟内凝结。如果加入如乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸的螯合剂从而使之与Ca2+结合，那么凝血受到抑制。再加钙的血浆(即其中Ca2+已得到补充的血浆)在两至四分钟内凝结。通过加入带负电的磷脂和如高岭土(硅酸铝)的颗粒状物质，可将再加钙之后的凝血时间缩短为26-33秒；这一再加钙后的凝血时间是APTT。另外，再加钙的血浆在加入＂组织促凝血酶原激酶＂之后将在12-14秒内凝结，该＂组织促凝血酶原激酶＂是人脑的盐水抽提物(包含组织因子和磷脂)；该再加钙后的凝血时间是PT。
一般认为一个具有延迟的APTT和正常的PT的个体在内源性凝血途径中有缺陷，这是因为APTT检验的所有组分(除高岭土外)对血浆而言都是内在的。具有延迟的PT和正常的APTT的患者在外在凝血途径中有缺陷，这是由于组织促凝血酶原激酶对血浆而言是外在的。APTT和PT在共同途径中都表现有缺陷。
鉴于凝血途径包含丝氨酸蛋白酶酶原的一系列酶促活化，因而血液凝固的负调节受到各种天然抗凝剂机制的影响，这些机制包括抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、蛋白质C-蛋白质S系统以及血纤蛋白溶解作用。正常的血管内皮细胞层通过用作为增加ATⅢ活化的肝素类似物质的来源、凝血调节蛋白的来源、蛋白质C活化的辅因子以及组织纤溶酶原激活物(启动血纤蛋白溶解)的来源来促进这些抗凝剂机制的活化。
抗凝剂ATⅢ是特异于纤溶酶(溶解血凝块的酶)的血浆蛋白酶抑制剂。ATⅢ也结合所有丝氨酸蛋白酶促凝血蛋白质(因子Xa以及凝血酶)。由肝和网状内皮系统迅速清除ATⅢ和蛋白酶的复合物。ATⅢ的活性由肝素或者肝素类似物质提高。在限制凝固过程中起作用的其它酶包括非特异性的血浆蛋白酶抑制剂α1-抗胰蛋白酶、α2-纤溶酶抑制剂以及α2-巨球蛋白，它们都可迅速灭活包括凝血酶和纤溶酶的任何循环丝氨酸蛋白酶。
凝固过程的最后阶段是血纤蛋白溶解或者血凝块溶解。血纤蛋白溶解系统的终点是纤溶酶的产生，该纤溶酶通过消化血纤蛋白来溶解血管内的血凝块。在凝血酶的作用下使血纤蛋白溶解作用在凝血期间开始。当在内皮细胞层中与凝血调节蛋白络合时，凝血酶激活蛋白质C，这引发了血管壁中的组织纤溶酶原激活物(tPA)的释放。蛋白质C与其辅因子蛋白质S一道也灭活因子Ⅴa和Ⅷa，由此抑制凝固级联。然后，上述tPA切割循环酶原(即纤溶酶原)以便形成活化的蛋白酶(消化血纤蛋白的纤溶酶)。纤溶酶是相对非特异性的蛋白酶；它不仅消化血纤蛋白血凝块而且也消化包含几个凝固因子的其它血浆蛋白质。
以一定方式调节血纤蛋白溶解系统以便除去不需要的血纤蛋白血栓，而在伤口处的血纤蛋白则保留下来以便维持止血。上述tPA响应各种信号(包括由血管闭塞产生的郁滞)而自内皮细胞中释放。如此释放的tPA对循环纤溶酶原几乎不产生作用，这是因为循环抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1以及纤溶酶原激活物抑制剂-2迅速地清除掉血液中的tPA或者使之受到抑制。纤溶酶原及其激活物tPA都结合到血纤蛋白中。tPA的活性实际上为这种与血纤蛋白的结合所提高，以致纤溶酶的产生定位在血凝块的附近。此外，血纤蛋白结合的纤溶酶受到保护而免受抑制作用。
四种主要类型的疗法用于预防或治疗血栓形成抗血小板剂、抗凝剂(肝素)、维生素K拮抗剂(香豆素衍生物)和溶栓剂。在凝固途径中，每种类型的药剂在不同部位干扰凝血[参见，一般地，Goodman & Gilman,治疗的药理学基础，第9版，McGraw-Hill，纽约，(1996)]。双嘧达莫是另一种药剂，其有时用来预防或治疗血栓形成；它是一种血管舒张剂，其与丙酮苄羟香豆素(一种香豆素衍生物)结合起来可抑制修复的心脏瓣膜的栓塞，并且与阿斯匹林结合起来可减少有血栓形成病症的患者的血栓形成。
抗血小板剂包括阿斯匹林和其它非类固醇的抗炎剂(如布洛芬)，它们全都是口服的。通过不可逆地抑制血小板环加氧酶并由此阻断凝血烷A2(一种血小板凝聚作用的诱导物)和强有力的血管收缩剂的产生，阿斯匹林产生作用。一般来说，抗血小板剂用作为预防动脉血栓形成，这是因为血小板群在引发动脉血栓形成方面比在引发静脉血栓形成方面更重要。抗血小板治疗也减少隐静脉旁路移植的闭塞的危险。
抗凝剂包括肝素及其衍生物，它们通过增强抑制凝血酶产生和拮抗凝血酶作用的ATⅢ活性来起作用。对于抗凝作用来说，肝素(如dalteparin和依诺肝素)的低分子量制备物也是有效的。通过用作为催化模板，肝素可使凝血酶-抗凝血酶反应的速率至少增加一千倍。只可以注射施用肝素，并且其有一种立即见效的抗凝作用。它用来预防和治疗动脉和静脉血栓形成症，以及在体外循环期间如用肾部血液透析或者在心肺旁路期间保持血液流畅，并且保持血管进入未闭的导管。对于接受经皮透照冠状血管成形术的患者，肝素治疗也是标准的。
出血是肝素的主要副作用。大部分出血发生在接受各种形式肝素治疗的1％-33％患者之中。紫癜、瘀斑、血肿、胃肠出血、血尿以及腹膜后出血是肝素治疗经常遇到的并发症。在侵染操作部位，经常性出血是最显著的。如果出血严重，可以通过在每100单位的肝素中加入1mg硫酸鱼精蛋白来抵消肝素的副作用。另一个副作用(即血小板减少)也发生在接受肝素治疗的1％-5％患者之中，但是当停止施用肝素时该副作用消失。
虽然维生素K拮抗剂(香豆素衍生物)实际上并不直接抑制凝固级联，但是有时把它们称作口服抗凝剂。这些药剂包括4-羟基香豆素、丙酮苄羟香豆素钠、双香豆素、苯丙羟基香豆素、茚满-1,3-二酮、醋硝香豆素以及茴茚二酮。它们干扰因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白质C和S(全都参与凝固过程)的肝合成，并因此缓慢地开始抗凝作用(持续几天)。它们全是口服的；一旦对单个患者建立剂量，它们就可以提供一个稳定水平的抗凝作用。维生素K拮抗剂用于预防和治疗动脉和静脉血栓形成。
出血是维生素K拮抗剂的主要副作用。尤其是严重发作包括不可逆损伤可以由活体结构(如颅内的、心包的、神经束膜或者脊髓)的压缩或者由不能迅速诊断的大量内部出血(如胃肠的、腹膜内的、腹膜后的)引起的部位。对于长期口服抗凝剂的50岁以上患者而言，大脑内或者硬膜下血肿的危险可以增加十倍。对于连续或严重出血，维生素K1(植物甲萘醌)是一种有效的解毒剂。由于维生素K1的抗凝作用的逆转要求充分羧化凝固蛋白质的合成，因此无论采用何种施用方法在止血作用方面的重要改善在数小时内并不发生，并且需要24小时或者更长时间才能得到最大药效。丙酮苄羟香豆素禁忌用在已怀孕或将怀孕的妇女中，因为药物穿过胎盘屏障并可以在胎儿中造成致命的出血。妊娠期间的丙酮苄羟香豆素治疗也能造成自发流产、死产和先天缺陷。
溶栓剂包括tPA、链激酶、尿激酶、尿激酶原、茴香醚基化的(anisolylated)纤溶酶原链激酶活化复合物(APSAC)以及动物唾腺纤溶酶原激活物，以上所有溶栓剂均通过加速血纤蛋白溶解来起作用。溶栓药物用于溶解新形成的动脉和静脉血栓；它们在溶解已存在数小时以上的血栓的方面是无效的。在深静脉血栓形成、肺部栓塞、急性心肌梗塞以及外周动脉血栓栓塞治疗方面，现在接受这些药剂的静脉内施用作为有用的治疗。
所有溶栓剂的主要毒性是由两个因子引起的出血。利用溶栓药物的治疗倾向于溶解沉积在血管伤害部位的病理性血栓和血纤蛋白。此外，一种全身性溶解状态是纤溶酶的全身性形成的结果，该纤溶酶引起其它凝固因子的血纤蛋白原溶解和破坏。大量血纤蛋白溶解开始，同时上述过程的抑制性控制受到控制。由溶栓剂造成的血纤蛋白原的全身性损失和血小板机能障碍也可以产生出血趋势。因此，溶栓剂忌用在有自动出血或者有大量出血危险的情况下。
如果肝素与链激酶或t-PA同时施用，那么将有2％-4％的患者发生严重出血。颅内出血是最严重的问题；它发生的情况为大约1％，并且其频率与所有三种溶栓剂相同。腹膜后出血也是一种严重的并发症。与用来治疗肺部栓塞或者静脉血栓形成相比，当溶栓剂用来治疗心肌梗塞时出血频率变小；这一区别可能是因为治疗的持续时间(对于心肌梗塞为1-3小时，相比于肺部栓塞和静脉血栓形成的12-72小时)所致。
一般来说，静脉血栓形成和其可能威胁生命的肺部栓塞都是利用肝素或丙酮苄羟香豆素来预防和治疗。低剂量的皮下肝素经常在外科病人中用来预防静脉血栓形成，但是对于那些处于极高危险性的病人(例如在髋骨折之后)它是无效的。丙酮苄羟香豆素减少肺部栓塞的死亡率，同时可以更安全地以低剂量或者分段治疗方法施用于固定术或手术后的患者。然而，一旦静脉血栓形成已经发展，为了阻止血凝块发展和/或肺部栓塞，最大剂量丙酮苄羟香豆素的4-5天治疗重叠最大剂量肝素的5-10天治疗是必要的。溶栓剂已经用来治疗肺部栓塞和深静脉血栓形成，但是它们在减少死亡率方面的功效仍然需要建立。阿斯匹林在治疗静脉血栓栓塞方面几乎没有价值。
对于急性动脉血栓形成，溶解血栓治疗一般是选择的治疗。溶解血栓治疗的目的在于实现形成血栓的血管的迅速再灌注，并保持血管的开放；这些目标基于以下前提血流量的迅速的和持久的恢复减少有关的并发症。然而，血管再闭塞的多次发作典型地跟随着溶解血栓治疗。虽然肝素广泛用作为溶解血栓治疗的附属品，但是它并不加速血栓溶解或防止血管的再闭塞。[Klement等，血栓症的血淤积，68:64-68(1992)]。在新冠状血栓形成的患者中，静脉内溶解血栓治疗使得形成血栓的冠状动脉可以迅速再灌注，因而如果在症状出现后的几小时内施用药物，则可维持心脏功能和减少死亡率。如果在急性血栓形成之后的几小时内施用溶栓剂，那么溶栓剂也可以重建形成血栓的外周动脉的开放。在一些实例中，例如对于冠状动脉的血栓形成，溶栓剂由有关血管的选择性导管插入术进行局部施用。当系统地而非局部地施药时，如果凝血酶时间比正常的大两倍，那么治疗效果是明显的。这样的治疗一般应该紧随肝素治疗之后，然后口服抗凝剂以便进一步防止凝血扩散或者复发。紧随溶解血栓治疗并在凝血酶时间已恢复到其正常范围之前，一般施用肝素以便使患者充分抗凝结五至十天。丙酮苄羟香豆素可以在肝素停止之前开始施用，这取决于延迟的抗凝作用是否需要用于治疗患者的病症。阿斯匹林不是速效的，但是可用于动脉血栓形成的长期预防。最近的研究表明阿斯匹林的低剂量的同时施用提高了心肌梗塞的溶解血栓治疗的效果。有症状性中风的患者用肝素强烈地进行抗凝疗法，随后不确定地施用丙酮苄羟香豆素。推荐阿斯匹林用于预防患有下列疾病的患者的中风颈的杂音(bruits)，无症状的颈动脉狭窄、或者瞬时的局部缺血的发作和较轻的中风的历史。
大量的争论继续围绕着肝素在DIC中的利用。通常储备肝素用于突然发作的爆发性形式的弥漫性血管内凝血，其中强烈的去纤维蛋白作用伴随着不到100mg/dL的血纤蛋白原水平，并且替代治疗不能控制出血。在这些情况下，以10-15单位/千克/小时的速率以连续的静脉内注入方式施用肝素。如果患者处于因出血而死亡的即刻危险，那么一次性在静脉内施用5000-10,000单位的肝素，然后以每小时1000单位的注入速率继续施用肝素。
肝素也可以用于治疗不稳定的心绞痛和接受2天以上持续时间的心房纤维性颤动的选择性复律法的患者。丙酮苄羟香豆素和阿斯匹林用于预防脑部栓塞，特别是对于处于由于心房纤维性颤动而致的危险中的患者。50％以上的患有脑部栓塞的患者有心房纤维性颤动。也推荐丙酮苄羟香豆素来治疗有机械性心脏瓣膜的患者(对于其而言，尽管有抗凝作用但相关的栓塞危险是每年每患者为2％-6％)、患有风湿性僧帽瓣瓣膜病的患者(对于其而言，相关的血栓栓塞并发症的发病率是每年为1.5％-4.7％)以及有栓塞历史的患者。推荐阿斯匹林用于治疗有僧帽瓣瓣膜脱垂的患者。
抗血栓形成剂日常也用来防止下列体外装置的闭塞血管内插管(肝素)、在血液透析患者中的血管存取分流器(阿斯匹林)、血液透析机(肝素)和心肺旁路机器(肝素)。此外，它们已用于治疗某些肾部疾病(肝素/丙酮苄羟香豆素)和小细胞肺癌(丙酮苄羟香豆素)。
BPI是自哺乳动物多形核白细胞(PMNs或者中性白细胞)的颗粒剂中分离的蛋白质，该白细胞在防卫入侵的微生物中是十分重要的血细胞。人BPI蛋白质已通过结合离子交换色谱[Elsbach，生物化学杂志，254:11000(1979)]或者大肠杆菌亲和色谱[Weiss，等，血液，69:652(1987)]的酸抽提自PMNs中分离。以这样方式获得的BPI在这里称作为天然BPI，并且其显示出具有强力的抗广谱格兰氏阴性细菌的杀菌活性。人BPI的分子量大约是55,000道尔顿(55kD)。整个人BPI蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的DNA的核酸序列已在Gray等(生物化学杂志，264:9505(1989))的

图1中报道过，该文献与本文一并参考。Gray等的氨基酸序列列在关于此的SEQ ID NO:1中。美国专利号5,198,541公开了重组体基因编码和BPI蛋白质(包括BPI全蛋白质和BPI片段)的表达方法。
BPI是强阳离子性的蛋白质。BPI的N末端一半携带高的净阳性电荷；该分子的C末端一半携带-3的净电荷。[Elsbach和Weiss(1981)，见上文。]有大约25kD的分子量的BPI的蛋白水解N末端片段本质上具有天然产生的55kD的人BPI全蛋白质的所有抗菌功效。[Ooi等，生物化学杂志，262:14891-14894 1987)]。与N末端部分相比，分离得到的人BPI蛋白质的C末端区只稍微地显示出可检测的抗格兰氏阴性有机体的抗菌活性。[Ooi等，J.Exp.Med.174:649(1991)。]由重组方法已产生大约23kD的N末端BPI片段(称作＂rBPI23＂)，并且该片段也具有抗格兰氏阴性有机体的抗菌活性和内毒素中和活性。[Gazzano-Santoro等，感染免疫60:4754-4761(1992)。]已报道BPI的杀菌作用具有对格兰氏阴性物种的高度特异性，例如在Elsbach和Weiss，炎症基本原理和临床联系，编者Gallin等，第30章，Raven出版有限公司(1992)中。BPI杀灭格兰氏阴性细菌的确切机理目前还不完全清楚，但是一般认为BPI一定是通过阳离子性BPI蛋白质和LPS上带负电的位点之间的静电和疏水相互作用，首先结合到细菌的表面。在敏感的格兰氏阴性细菌中，一般认为BPI结合破坏了LPS结构，从而引起降解磷脂和肽聚糖的细菌酶的活化，改变细胞的外膜的通透性，以及开始最终导致细胞死亡的发作。[Elsbach和Weiss,(1992)，见上文]。已把LPS称作为＂内毒素＂，这是由于它刺激的强力的炎性反应，即由宿主炎性细胞(最终可以导致不可逆的内毒性休克)刺激介体的释放。BPI结合到脂质A上并中和该脂质，据报道该脂质是LPS的最大毒性和最大生物活性的组分。
除BPI的杀菌和内毒素结合/中和活性外，BPI已显示出结合和中和肝素。1994年9月20日颁布共同拥有的美国专利号5,348,942，该专利的权利要求书涉及用BPI蛋白质产物(即它们的促凝血活性)中和肝素的抗凝作用的方法。没有关于作为抗凝剂或者溶栓剂的BPI的任何建议或者用途，也没有关于BPI用于预防或者治疗血栓形成病症的任何建议。
本领域需要能够发挥抗凝作用或者溶解血栓作用而没有不利的严重副作用的方法和组合物，以及能够提高现有的抗凝剂或者溶栓剂的疗效的方法和组合物，理想的是其可以减少这样的现有试剂的所需剂量。
发明概述本发明提供了用于利用BPI蛋白质产物减缓血凝块的形成和增加血凝块的溶解的新方法，以及还提供了用于通过以治疗上有效量施用BPI蛋白质产物来治疗血栓形成病症的方法。
按照本发明，BPI蛋白质产物(如rBPI21)以有效量施用于患有血栓形成病症的患者以治疗(包括预防和治疗)这样的病症。由包括减缓或延迟血凝块形成(即抗凝活性)的活性或者通过提高、加速或者增加血凝块溶解(即溶解血栓活性)，BPI蛋白质产物减少血栓形成病症的副作用。
在本发明的另一方面，提供了用于通过同时施用BPI蛋白质产物和溶栓剂治疗血栓形成病症的方法，该BPI蛋白质产物包括tPA、链激酶、尿激酶、尿激酶原、APSAC、动物唾腺纤溶酶原激活物、其它纤溶酶原激活物以及这样的纤溶酶原激活物的衍生物。按照本发明的这一方面，溶栓剂溶解血凝块，而BPI蛋白质产物提高溶栓剂的溶解活性和/或延迟血凝块的形成，从而延迟、减少或者阻止血栓形成。就溶栓剂(如纤溶酶原激活物)的内源性水平和治疗水平来说，BPI蛋白质产物是有效的。
本发明的这一方面也提供了用于减少在患者中通过同时施用BPI蛋白质产物和溶栓剂达到理想治疗或者预防效果(如溶解血凝块)所需的溶栓剂剂量的方法。
本发明还提供了用于在接受溶栓剂(如tPA)治疗的患者中通过同时施用BPI蛋白质产物和上述溶栓剂加速再灌注和/或延迟或者阻止再闭塞的方法。
此外期待在用于治疗血栓形成病症的药物的制备中或者在用于在血液中减缓血凝块形成和加速血凝块溶解的药物的制备中利用BPI蛋白质产物。还期待在与溶栓剂同时施用(在血栓形成病症的治疗中)的药物的制备中以及在用于在接受溶栓剂治疗的患者中加速再灌注或者减少再闭塞的药物的制备中利用BPI蛋白质产物。
正如从下列详细描述所要意识到的，本发明的方法提供了比常规疗法更安全的和更有效的血栓形成病症的治疗。通过减少抗血栓形成试剂的达到理想疗效所需的剂量，BPI蛋白质产物可以减少或者消除潜在的副作用(经常与常规抗血栓形成剂疗法相联系)，而不干扰这些药剂的抗血栓形成的活性。重要的是，这样的BPI蛋白质产物的利用可以通过减缓血凝块形成或者加速血凝块溶解来提高上述药剂的抗血栓活性。
对于本领域技术人员来说，当考虑本发明的下列详细描述(描述其目前准备的实施方案)时，本发明的许多附加方面和优点将是明显的。发明的详细描述包括急性血管疾病(如心肌梗塞、中风、外周动脉闭塞、深静脉血栓形成、肺部栓塞以及其它血液系统血栓症)的血栓形成病症构成主要的健康威胁。这样的病症由血凝块(由血纤蛋白和血小板聚集体组成)引起的血管的部分或者全部闭塞所造成。治疗干预与许多局限性、并发症、危险以及副作用相联系，该治疗干预是利用阻止或者延迟血凝块形成的药剂(即抗凝剂)或者利用溶解血凝块的药剂(即溶栓剂)。最重要的是与上述药剂的治疗剂量有关的出血副作用以及与再灌注之后的血栓再形成和再闭塞有关的并发症。现在料想不到地发现BPI蛋白质产物的施用可有效地减缓血凝块的形成和加速血液中血凝块的溶解。在血凝块形成期间所施用的存在于血液中的BPI蛋白质产物延迟凝血时间和/或可以改变血凝块(形成更松散的、很不稳定的血块)的特性。
期待BPI蛋白质产物可以单独地施用或者与其它抗血栓形成的药剂(抗凝剂或者溶栓剂)同时施用。抗凝剂是具有减缓血凝块形成的药理学作用的药剂，如dalteparin和依诺肝素、香豆素衍生的口服抗凝剂(如丙酮苄羟香豆素)以及阿斯匹林。溶栓剂是具有加速血凝块溶解的药理学作用的药剂，并且包括纤溶酶原激活物(如t-PA)、链激酶、尿激酶、尿激酶原(proutokinase)、APSAC、动物唾腺纤溶酶原激活物及其衍生物。
按照本发明方法所利用的BPI蛋白质产物出乎意料地具有在内源性水平或者纤溶酶原激活物(如tPA)增加的水平上使血凝块更易于溶解或裂解的性质。无论tPA在血凝块形成之前或在血凝块形成之后存在，BPI蛋白质产物都可增强血凝块的溶解能力，例如加速血凝块的溶解或裂解或者提供更完全的血凝块溶解或者裂解。因此，BPI蛋白质产物在下列方法中是有用的用于治疗血栓形成病症的方法、用于溶解或者裂解血栓形成患者的血凝块的方法、用于延迟或者抑制硬血凝块形成或者在患者中补充溶解血栓的治疗的方法。
BPI蛋白质产物的上述生物活性包括杀菌、内毒素结合和中和、肝素结合和中和活性，这些生物活性在BPI蛋白质产物的抗凝活性或者溶解血栓活性和由这些未预料到和以前未发现的活性形成的治疗用途方面并无建议或者甚至暗示。尤其是，考虑到BPI蛋白质产物的以前发现的活性，作为治疗血栓形成病症的药剂的BPI蛋白质产物的活性特别令人诧异的结合和中和肝素(参见，共同转让的美国专利号5,348,942)。
本文所使用的术语＂治疗＂包括对血栓形成病症的预防和治疗。
本文所使用的术语＂血栓形成病症＂包括与血栓形成或者指向血栓形成的趋势有关的症状或者由它们产生的症状。这些症状包括与动脉血栓形成相联系的症状，例如冠状动脉血栓形成和所导致的心肌梗塞、脑部动脉血栓形成或者心内血栓形成(由于例如心房纤维性颤动)和所导致的中风以及其它外周动脉血栓形成和闭塞；与静脉血栓形成相联系的症状，例如深静脉血栓形成和肺部栓塞；与患者血液向外来的或者受伤的组织表面的暴露相联系的血栓形成，包括有病的心脏瓣膜、机械心脏瓣膜、血管移植以及其它体外装置(如血管内插管、在血液透析患者中的血管存取分流器、血液透析机器以及心肺旁路)；以及与凝血病相联系的症状，如凝固性过高和弥漫性血管内凝血病(不是内毒素引发的凝固级联的结果)。
本文所使用的＂同时施用＂或者＂共同施用＂或者＂共同治疗＂包括与另一种药剂结合或者混合、与之一起或者在其之前或之后施用药剂。可以用不同的方法施用BPI蛋白质产物和其它抗血栓形成(包括抗凝或者溶解血栓)药剂。例如，BPI蛋白质产物可以静脉内施用，而抗血栓形成药剂可以肌内、静脉内、皮下或者口部施用。此外，BPI蛋白质产物可以例如以烟雾化或者雾状的形式施用，而抗血栓形成剂可以例如静脉内施用。BPI蛋白质产物与抗血栓形成剂都优选静脉内施用，在该情况下它们可以在相同的静脉内线路上、或者在中度潮红之后、或者在不同的静脉内线路上依次给药。BPI蛋白质产物和抗血栓形成剂可以同时或者依次施用，只要以可以使上述两种药剂在血栓形成部位达到有效浓度的方式施用它们。在BPI蛋白质产物和抗血栓形成剂的依次施用期间，也期待变化于数分钟到数小时之间的持续时间可以干预药剂的施用。
一般希望以一定剂量和通过与通常的临床实践一致的途径施用常规的抗血栓形成剂。对于某些这样的抗凝剂与溶栓剂，当其作为单一疗法施用时，典型的剂量和施药治疗方法讨论如下。当然，这些剂量的变化由个体患者的良好的医疗实践和临床状况所确定。
按照患者对药物的敏感性(由其对凝血酶原时间(PT)比的效应表明)，丙酮苄羟香豆素的剂量必须是具有个体特色的。施用剂量典型地是2-5mg/天，并且大多数患者令人满意地保持2-10mg/天的剂量。一般口服丙酮苄羟香豆素，但是如果患者不能口服药物，那么就静脉内施用。
尿激酶的目的是溶解急性肺部栓子和冠状动脉栓子，并且该酶也用来恢复静脉内插管和导管的开放。上述药物典型地是首先以2,000单位/磅的剂量用10分钟施用，其后用12小时以2,000单位/磅/小时的连续注入速度施用。所施用的尿激酶的整个剂量变化于2.25百万-6.25百万单位之间，这取决于患者的体重。当它用来清洗静脉内插管或者导管时，以在1ml体积中一次注入5,000单位的剂量来施用尿激酶。
链激酶的目的是用于治疗急性心肌感染，溶解冠状内血栓、动脉血栓形成或者栓塞、深静脉血栓形成、肺部栓塞，以及用来清洗阻塞的插管或者导管。对于急性心肌梗塞的治疗，可以通过静脉内注入用60分钟施用1.5百万单位药剂。此外，可以通过冠状内注入施用20,000单位大丸剂，其后以2,000单位/分钟用60分钟施用药剂。对于其它非心肌梗塞的适应征，用30分钟静脉内注入250,000单位的剂量对大多数患者是合适的。
一般用2-5分钟通过静脉内注入以30单位的单一剂量施用Anistreplase(也称作为ASPAC)。其目的是用来治疗急性心肌感染以及用于溶解冠状动脉血栓。
tPA的施用剂量是基于患者的体重，其总量不超过100毫克。对于体重超过67kg的患者，推荐剂量是首先为15mg的静脉内大丸剂，其后为用30分钟的15mg的连续注入，并且还跟随着用60分钟注入的35mg药剂。对于体重小于或等于67kg的患者，推荐剂量是首先为15mg的静脉内大丸剂，其后为用30分钟以0.75mg/kg(不超过50mg)施药，并且还跟随着用其后的60分钟以0.5mg/kg(不超过35mg)施药。
包含BPI蛋白质产物的治疗组合物可以系统地或者局部地施用到有关的血管中。全身性施用方法包括口服、静脉内、肌内或者皮下注射(包括注入用于长期释放的贮器)、眼球内和眼球后、鞘内、腹膜内(例如通过灌洗)、利用烟雾化或者雾状药物的肺内、或者经皮的施药。优选的全身性方法是静脉内施用。在一些实例中，例如对于冠状动脉或者外周动脉血栓形成，利用有关血管的选择性导管插入术局部地施用BPI蛋白质产物是有利的。当肠胃外施用时，一般以每天1-100mg/kg的剂量注射BPI蛋白质产物组合物，优选为每天0.1-20mg/kg的剂量，更优选为1-20mg/kg/天的剂量。可以每天以相同的、减少的或者增加的剂量(其只要由治疗医生确定)，通过连续注入或者间歇注射或者注入继续治疗。本领域技术人员易于优化BPI蛋白质产物和/或其它抗血栓形成剂的有效剂量和单一疗法或者同时施药治疗方法，这些剂量和疗法都是由良好的医疗实践和个体患者的临床状况确定的。
当BPI蛋白质产物与抗血栓形成剂同时施用，BPI蛋白质产物以及抗血栓形成剂的每一个可以以足以有单一疗效的量施用，或者它们可以分别以比单一疗法少的量施用。可以预期BPI蛋白质产物能够改进现有的抗凝剂或者溶栓剂的疗效，这些药剂将减少所需的剂量以发挥所需的它们的抗凝或者溶解血栓作用。反过来，这减少了与溶栓剂有关的不利副作用的危险(包括例如不需要的内部或者外部出血)。
BPI蛋白质产物可以以各种方法提高其它抗血栓形成剂的疗效。例如，降低达到疗效所需的抗血栓形成剂的剂量可以减少治疗的毒性和/或成本，以及由此使得试剂有更广泛的用途。此外，相比于单独施用任一试剂所能达到的效果，同时施用可以产生增加的、更迅速的或者更完全的抗凝或者溶解血栓作用。
还期待BPI蛋白质产物组合物在体外或者体内有用于恢复或者保持为凝结的血液或者血纤蛋白所阻塞的插管、导管以及管的开放，有用于保持血液的抗凝作用(例如在血袋中)，以及有用于保持血液的流动性(例如在血液透析和体外循环中，以及在例如心脏瓣膜或者修复学的异质移植物周围)。
正如本文所使用的，＂BPI蛋白质产物＂包括天然和重组产生的BPI蛋白质；BPI蛋白质的天然的、合成的以及重组的生物活性的多肽片段；BPI蛋白质或者其片段的生物活性的多肽变体(包括杂交体融合蛋白质和二聚体)；BPI蛋白质或者其片段或变体的生物活性的多肽类似物(包括半胱氨酸取代的类似物)；以及BPI衍生的肽。按照本发明施用的BPI蛋白质产物可以由本领域所知的任一方法产生和/或分离。美国专利号5,198,541(其公开部分与本文一并参考)公开了重组体基因编码以及表达BPI蛋白质(包括称作为rBPI50的重组体BPI全蛋白质和BPI的重组体片段)的方法。1993年5月19日申请的、共同拥有的、共同悬而未决的美国专利申请系列号07/885,501和其部分继续申请美国专利申请系列号08/072,063以及相应的、在1993年5月19日申请的PCT申请号93/04752(它们都与本文一并作为参考)公开了用于纯化重组体BPI蛋白质产物(在培养物中基因转化的哺乳动物宿主细胞中表达的以及由该细胞分泌的)的新方法，以及公开了怎样产生适合于掺入稳定的、均相的药物制剂中的大量重组体BPI产物。
BPI的生物活性片段(BPI片段)包括生物活性分子，除该片段分子缺乏全蛋白质的氨基末端氨基酸、内部氨基酸和/或羧基末端氨基酸之外，该生物活性分子具有与天然的人BPI全蛋白质相同的或者类似的氨基酸序列。这样的片段的非限制性例子包括大约25kD的天然的人BPI的N-末端片段(描述在Ooi等，J.Exp.Med.,174:649(1991)中)，以及编码天然人BPI的1至大约193或199的N末端氨基酸的DNA的重组体表达产物(描述在Gazzano-Santoro等，感染免疫，60:4754-4761(1992)中，并且称作rBPI23)。在那本出版物中，表达载体用作为编码重组体表达产物(rBPI23)的DNA源，该重组体表达产物具有31个残基信号序列和成熟人BPI的N-末端的前199个氨基酸(正如Gray等，见上文的图1所描述的)，不同的是，位于第151位的缬氨酸由GTG而非GTC所规定和第185残基是谷氨酸(由GAG规定的)而非赖氨酸(由AAG规定的)。也产生了重组体全蛋白质(rBPI)，该重组体全蛋白质具有Gray等，见上文的图1所描述的序列(SEQ ID NO:1和2)，不同的是，该重组体全蛋白质记为rBPI23并且第417残基是丙氨酸(由GCT规定的)而非缬氨酸(由GTT规定的)。其它例子包括BPI片段的二聚形式，如共同拥有和共同悬而未决的美国专利申请系列号08/212,132(1994年3月11日申请)以及相应的PCT申请号PCT/US95/03125中所描述的二聚形式，这些申请的公开部分与本文一并参考。优选的二聚物包括二聚化的BPI蛋白质产物，其中的单体是具有BPI全蛋白质的大约1-175至大约1-199的N末端残基的氨基末端BPI片段。特别优选的二聚物是具有1-193的N末端残基的二聚形式的BPI片段，其被指定为rBPI42。
BPI的生物活性变体(BPI变体)包括但不限于重组体杂交体融合蛋白质(包含BPI全蛋白质或者其生物活性片段和至少一种其它多肽的至少一部分)以及二聚形式的BPI变体。这样的杂交体融合蛋白质和二聚形式的例子由Theofan等描述在共同拥有的、共同悬而未决的美国专利申请系列号07/885,911及其部分继续申请美国专利申请系列号08/064,693(1993年5月19日申请)和相应的PCT申请号US93/04754(1993年5月19日申请)中，这些申请与本文一并参考并且包括杂交体融合蛋白质，该蛋白质在氨基末端包含BPI蛋白质或其生物活性片段，以及在羧基末端包含免疫球蛋白重链或其等位变体的至少一个恒定区。也期待将同样构型的杂交体融合蛋白质(包括部分或者所有脂多糖结合蛋白质(LBP))用于本发明中。
BPI的生物活性类似物(BPI类似物)包括但不限于BPI蛋白质产物，其中的一个或多个氨基酸残基已为不同的氨基酸所取代。例如，共同拥有的、共同悬而未决的美国专利申请系列号08/013,801(1993年2月2日申请)和相应的PCT申请号US94/01235(1994年2月2日申请)(这些申请的公开部分与本文一并参考)公开了BPI和BPI片段的多肽类似物，其中的半胱氨酸残基由不同的氨基酸所取代。这一申请所描述的优选的BPI蛋白质产物是编码BPI全蛋白质的N末端氨基酸的1至大约193或199氨基酸的DNA的表达产物，但是其中的在残基序号132上的半胱氨酸为丙氨酸所取代并且该半胱氨酸被指定为rBPI21Δcys或者rBPI21。其它例子包括二聚形式的BPI类似物，例如共同拥有的和共同悬而未决的美国专利申请系列号08/212,132(1994年3月11日申请)以及相应的PCT申请号PCT/US95/03125，它们的公开部分与本文一并参考。
按照本发明方法的有用的其它BPI蛋白质产物是得自或者基于由重组或者合成方法产生的BPI的肽(BPI衍生的肽)，如那些在下列申请中所描述的肽共同拥有的和共同悬而未决的美国专利申请系列号08/504,841(1995年7月20日申请)和在共同拥有的和共同悬而未决的PCT申请号PCT/US94/10427(1994年9月15日申请)(其相应于1994年9月15日申请的美国专利申请系列号08/306,473)以及PCT申请号US94/02465(1994年3月11日申请)，其相应于1994年3月11日申请的美国专利申请系列号08/209,762，该申请继续申请是1994年1月14日申请的美国专利申请系列号08/183,222的部分继续申请，该申请是1993年7月15日申请的美国专利申请系列号08/093,202的部分继续申请(其相应的国际申请是1994年3月11日申请的PCT申请号US94/02401)，该申请是1993年3月12日申请的美国专利申请系列号08/030,644的部分继续申请，上述所有申请的公开部分与本文一并参考。
目前优选的BPI蛋白质产物包括重组产生的BPI的N末端片段(尤其是那些如rBPI21或rBPI23的分子量为大约21-25kD的N末端片段)，或者这些N末端片段的二聚形式(例如rBPI42二聚体)。此外，优选的BPI蛋白质产物包括rBPI50和BPI衍生的肽。
BPI蛋白质产物的施用优选同时施用包含BPI蛋白质产物和药物上可接受的稀释剂、辅药或者载体的药物组合物。BPI蛋白质产物可以与或者不与已知的表面活性剂、其它化疗剂或者附加的已知的抗微生物剂结合施用。一种包含BPI蛋白质产物(例如rBPI50、rBPI23)的药物组合物在柠檬酸盐缓冲的盐水(5或者20mM柠檬酸盐、150mM NaCl、pH5.0)中包含浓度为1mg/mL的BPI蛋白质产物，缓冲液包含0.1％重量百分比的泊咯沙姆188(Pluronic F-68,BASF Wyandotte,Parsippany,NJ)和0.002％重量百分比的多乙氧基醚(Tween 80,ICI AmericasInc.,Wilmington,DE)。另一种包含BPI蛋白质产物(例如rBPI21)的药物组合物在5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、0.2％泊咯沙姆188和0.002％多乙氧基醚中包含2mg/mL浓度的BPI蛋白质产物。这样的组合描述在共同拥有的、共同悬而未决的PCT申请号US94/01239(1994年2月2日申请)中，该申请对应于美国专利申请系列号08/190,869(1994年2月2日申请)和美国专利申请系列号08/012,360(1993年2月2日申请)，所有这些申请的公开部分与本文一并参考。
当考虑到下列的说明性例子时，将可了解本发明的其它方面和优点。实施例1说明了BPI蛋白质产物在试管测定中在变化的条件之下对血凝块形成和血凝块裂解/溶解的影响。实施例2说明了在微量滴定板测定中在变化的条件之下BPI蛋白质产物对血凝块形成和血凝块裂解/溶解的影响，该影响由浊度测量方法监测。实施例3说明了体内的BPI蛋白质产物对大鼠血栓模型(同时施用tPA)的影响。实施例1BPI蛋白质产物对血凝块形成和血凝块裂解/溶解的影响利用人血浆样品在各种条件之下利用试管测定来确定BPI蛋白质产物对血凝块形成和血凝块裂解或者溶解的影响。除非注明用其它方法，否则在这些试验中所利用的人血浆由从各种供体身上抽至ACDVacutainer_管(Becton Dickinson,Mountainview,CA)(包含柠檬酸盐作为抗凝剂)中的人血液制备，并将其冻结存储在-70℃下。对于富含血小板的血浆(PRP)的制备，使抗凝处理过的血液在大约180xg下离心5分钟并在这种低速离心后除去血浆。对于缺乏血小板的血浆(PPP)的制备，使抗凝处理过的血液在大约460xg下离心10分钟在这种高速离心后除去血浆。
在确定BPI蛋白质产物是否与血浆蛋白质相互作用的初始实验中，使由两个人供体收集的ACD血浆通过包含rBPI23(经由溴化氰与琼脂糖凝胶结合)的柱子。使大约40mL血浆通过rBPI23-琼脂糖凝胶柱从而使血浆组分的结合得以实现。用磷酸盐缓冲的盐水(10mM磷酸盐，0.15MNaCl,pH7.2)洗涤该柱，直到洗涤液的OD280＜0.02。用高浓度盐水(1.5MNaCl)洗脱结合的血浆组分，并用SDS-PAGE分析蛋白质洗脱物。几条蛋白质带的氨基酸序列分析显示凝血酶原和血纤蛋白原通过rBPI23结合在一起。
作为范例的BPI蛋白质产物延迟血凝块形成(即抗凝活性)和/或加速所形成的血凝块的溶解或裂解(即溶解血栓活性)的能力得到评价。这样的抗凝和/或溶解血栓的活性显示出BPI蛋白质产物在患有血栓形成病症的患者中治疗这样的病症的用途。在如下的各种条件之下在PPP和PRP中评价BPI蛋白质产物的影响。A．不同表面环境的影响在聚丙烯或者玻璃试管中在存在和缺乏rBPI21的条件下评价血凝块的形成和溶解。对于这一个和尔后例子中的所有实验，用5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、0.2％泊咯沙姆188(Pluronic F-68,BASFWyandotte,Parsippany,NJ)以及0.002％多乙氧基醚(Tween 80,ICI Americas Inc.,Wilmington,DE)，以2mg/mL配制所利用的rBPI21。以同样配方配制1mg/mL的本文所利用的其它BPI蛋白质产物。所利用的0.1％HSA-TBS是在三羟甲基氨基甲烷缓冲的盐水(TBS)
中的0.1％人血清白蛋白(HSA)[Alpha Therapeutics，洛杉矶，CA]。对于这一实验的血凝块形成部分，以下列顺序将下列试剂混合在一起(1)160μL的PPP(供体RL)；(2)40μL的rBPI21(10或者250μg/mL，在0.1％HSA-TBS中)；以及(3)200μL的40mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使上述试管处于室温下，通过和缓地倾斜该试管并目检试管中的凝胶血凝块形成，每1分钟检查上述试管一次。测定在CaCl2加入之后的血凝块形成时间(以分钟表示)。
血凝块形成在玻璃管中比在聚丙烯管中快。然而，rBPI21延长了在玻璃和聚丙烯管中的凝血时间。所测的较高的rBPI21浓度(25μg/mL)引起凝血时间的最长延迟。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在加入CaCl2后第33分钟，在每根试管中加入44μL的tPA[Calbiochem,San Diego,CA](600单位/mL或者1μg/mL)以产生60单位/mL(100ng/mL)的tPA终浓度。这在对tPA所观察到(在一定的生理状态/条件下)的提高的内源性浓度的范围内[参见，例如yon der M_hlen等，血液，85:3437-3443(1995)；Suffradini等，New.Engl.J.Med,320:1165-1172(1989)]。在室温下温育上述试管10分钟，然后将其放置在37℃水浴中。由目检检查每根试管的血凝块溶解/裂解。
在5分钟之后，在玻璃管中的BPI21处理过的血凝块已自试管侧面分离，而所有其它血凝块仍然粘着在试管的侧面。在3.5小时，在25μg/mLrBPI21聚丙烯管中的血凝块变得更小，在1μg/mL rBPI21和对照聚丙烯管中有大约1/3大小的血凝块。与聚丙烯管相比，血凝块在玻璃管中的溶解/裂解时间比在聚丙烯管中快。25μg/mL rBPI21的存在加速了血凝块的溶解。在以后的所有实验中，利用聚丙烯管来最大限度地减少玻璃的蛋白质吸附作用。B．钙离子浓度的影响在存在或者缺乏rBPI21的条件下，用不同浓度的钙(10、15、20mM)来评价血凝块的形成和溶解以确定最佳的钙浓度。对于这一实验的血凝块形成部分，以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)40μL的rBPI21(10或者250μg/mL，在0.1％HSA-TBS中)；以及(4)200μL的20、30或者40mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使上述试管处于室温下，并通过目检(每1分钟一次)检查上述试管的凝胶血凝块形成。在所试验的所有钙浓度中，增加的rBPI21浓度与增加的凝血时间有关。较高的rBPI21浓度引起凝血时间的最长延迟。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在加入CaCl2后第35分钟，在每根试管中加入44μL的tPA(600单位/mL，或者1μg/mL)以产生60单位/mL或100ng/mL的tPA终浓度。在37℃水浴中温育上述试管，并由目检(大约每二十分钟一次)检查每根管子的血凝块溶解/裂解。
rBPI21加速血凝块的溶解。此外，这在25μg/mL rBPI21浓度下最明显。利用10mM钙观察到最佳的血凝块形成和血凝块溶解。在尔后的所有实验中，将10mM CaCl2用于引发凝血和溶解。C．tPA的凝血之前和凝血之后加入的影响在存在或者缺乏rBPI21的条件下，用tPA的凝血之前或者凝血之后加入来评价血凝块的形成和溶解。对于这一实验的血凝块形成部分，以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)40μL的rBPI21(10或者250μg/mL，在0.1％HSA-TBS中)；(4)只用在凝血之前，44μL的tPA(600单位/mL或者100ng/mL)；以及(5)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使上述试管处于室温下，并通过目检(每1分钟一次)来检查凝胶血凝块形成。测量CaCl2加入之后血凝块形成的时间(以分钟表示)。只在凝血之前加入tPA的25μg/mL rBPI21的试验中观察到血凝块形成的延迟。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在加入CaCl2后第35分钟，在凝血之后的试管中加入44μL的tPA(600单位/mL，或者1μg/mL)。所有试管(凝血之前和之后)中的tPA终浓度是60单位/mL或100ng/mL。在37℃水浴中温育所有试管，并由目检(大约每二十分钟一次)检查每根试管的血凝块溶解/裂解。以小时(凝血之后加入tPA)或者以分钟(凝血之前加入tPA)评价血凝块溶解时间。在这一实验中，当tPA在凝血之前加入时的血凝块溶解比当tPA在凝血之后加入时的快速至少6倍。25μg/mL的rBPI21似乎加速血凝块溶解时间。由于在凝血之前加入tPA的条件下的血凝块的出乎意料的迅速溶解，在这一实验中不能评估血凝块溶解的精确时间。这些结果显示通过在血凝块形成之前而非在血凝块形成之后加入tPA，可显著地加速血凝块的溶解。D．凝血之前加入各种浓度tPA的影响在存在或者缺乏rBPI21的条件下，通过凝血之前加入tPA至终浓度0、6、60单位/mL来评价血凝块的形成和溶解。对于这一实验的血凝块形成部分，以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)40μL的rBPI21(10或者250μg/mL，在0.1％HSA-TBS中)；(4)44μL的tPA(600单位/mL或者100ng/mL)；以及(5)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使上述试管处于室温下，并通过目检(每1分钟一次)来检查凝胶血凝块形成。测量CaCl2加入之后血凝块形成的时间(以分钟表示)。加入增加量的tPA(0、6、60单位/mL)并不显著改变血凝块在上述试验条件下的形成时间。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在加入CaCl2后第53分钟，将所有试管放置在37℃水浴中，并由目检检查这些试管的血凝块溶解/裂解。以小时或者分钟评价血凝块溶解时间。没有tPA时，观察不到任何血凝块溶解。观察到tPA剂量响应效应，其中高浓度(60单位/mL)tPA产生最迅速的血凝块溶解。在这些有此供体血浆的条件下，rBPI21对血凝块形成的延迟有更大的效应，而对血凝块溶解有最小限度的效应。明显的是个体血浆供体可以有显著不同的血液凝结和溶解时间(与以上的A-C部分的结果相比)。这些差别可能是由于个体血浆供体中的关键凝血因子的浓度不同所致。E．活化之前和活化之后加入的rBPI21和tPA的影响当rBPI21和tPA都在钙加入之前加入(活化之前或加钙之前)以及都在钙加入之后(活化之后或加钙之后)第4分钟加入时，评价血凝块的形成和溶解。以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)84μL有tPA(300单位/mL或者50ng/mL)的rBPI21(5、25或者125μg/mL)或者缓冲液对照(0.1％HSA-TBS)；以及(4)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使上述试管处于室温下，并通过目检(每1分钟一次)来检查凝胶血凝块形成。测量CaCl2加入之后血凝块形成的分钟数。<
>在这一实验中，只有当rBPI21在钙加入之前存在时，25μg/mLrBPI21才减缓血凝块形成。当rBPI21在钙加入之后第4分钟加入时，没有观察到对血凝块形成速率的任何显著影响。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在CaCl2加入之后的第15分钟，将所有试管放置在37℃水浴中，并且由目检(大约每分钟一次)检查这些试管的血凝块溶解/裂解。测量血凝块溶解的分钟数。<
>与在加钙之前加入相比，当rBPI21和tPA在加钙之后加入时，血凝块溶解的速度似乎更快。在加钙之前和加钙之后的两组中检测到对血凝块溶解的小的rBPI21剂量响应效应。这些结果表明与钙加入(血凝块活化)有关的rBPI21和tPA加入的时间安排影响血凝块的形成和溶解。
在利用更高血浆浓度的附加实验中，当rBPI21和tPA在钙加入之前加入以及在钙加入之后第3分钟加入时，评价血凝块的形成和溶解。以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)160μL的PPP(供体PC)；(2)有tPA(300单位/mL或者50ng/mL)或者缓冲液对照(0.1％HSA-TBS)的84μL的rBPI21(5、25或者125μg/mL)；以及(3)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
使试管处于室温下，并由目检(每1分钟一次)检查试管的凝胶血凝块形成。测量CaCl2加入之后的血凝块形成的分钟数。在这一实验中，当在钙加入之前存在时，25μg/mL rBPI21减缓血凝块形成(大约50％延长)。当25μg/mL rBPI21在钙加入之后第3分钟加入时，观察到对血凝块形成的轻微影响(大约22％延长)。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在CaCl2加入之后的第15分钟，将所有试管放置在37℃水浴中，并由目检检查这些试管的血凝块溶解/裂解。测量血凝块溶解的分钟数。在加钙之前和加钙之后加入的两组中，再一次检测到对血凝块溶解的小的rBPI21剂量响应效应。只观察到在加钙之前和加钙之后加入rBPI21和tPA的组之间在血凝块溶解方面的最小限度区别。虽然在以前的实验中观察到在加钙之前和加钙之后加入的组之间在血凝块溶解方面的较大区别，但是这一结果可能是由于所利用的不同血浆浓度所致。这些结果进一步证实了以前实验的结果与钙加入(血凝块活化)有关的rBPI21和tPA加入的时间安排以及血浆浓度影响血凝块形成和溶解。F．凝血温度的影响在几种温度下评价血凝块形成和溶解。对于这一实验的血凝块形成部分，以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)40μL rBPI21(10、50或者250μg/mL)；(4)44μL tPA(600单位/mL或者100ng/mL)或者缓冲液对照(0.1％HSA-TBS)；以及(5)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
在室温(R.T.)或者37℃下温育上述试管，并由目检(每1分钟一次)检查凝胶血凝块的形成。测量CaCl2加入之后血凝块形成的分钟数。
在37℃下血凝块形成进行得比在室温下快。然而，在这两种温度下，25μL/mL rBPI21延迟血凝块形成。在这一实验中所利用的试验条件下，较低浓度的rBPI21对血凝块形成速率似乎没有影响。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在CaCl2加入之后的第15分钟，在凝血之后的试管中加入44μL tPA(600单位/mL或者1μg/mL)以产生60单位/mL(或100ng/mL)的终浓度。将上述试管放置在37℃水浴中，并由目检检查血凝块溶解/裂解。以小时(当tPA在凝血之后加入时)或者以分钟(当tPA在凝血之前加入时)测量血凝块溶解的时间。
#-基于在7小时时间点的血凝块大小来估计的时间。
相比于在血凝块形成之后加入，当tPA在血凝块形成之前加入时，血凝块溶解大大地加速了。对于凝血之前加入tPA的情况，相比于在室温下，当血凝块在37℃下形成时，rBPl21大大地缩短了血凝块的溶解时间(大约35％比大约3％)。尔后的所有实验在37℃下完成。G.rBPl2l、BPl50以及rLBP的影响用rBPI21、rBPI50和rLBP评价血凝块的形成和溶解。以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)60μL的0-1％HSA-TBS；(2)100μL的PPP(供体PC)；(3)40μL rBPI21、rBPI50或rLBP(10、50或者250μg/mL)或者缓冲液对照；以及(4)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
在37℃水浴中温育上述试管，并由目检(每1分钟一次)检查凝胶血凝块的形成。测量CaCl2加入之后血凝块形成的分钟数。
25μg/mL rBPI21减缓血凝块形成的速率，而rBPI50和rLBP的凝血时间和对照相差不大。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在CaCl2加入之后的第15分钟，在所有试管中加入44μL的tPA(600单位/mL,1μg/mL)以产生60单位/mL的终浓度(100ng/mL)。然后，将上述试管放置在37℃水浴中，并由目检检查血凝块的溶解/裂解。测量血凝块溶解的分钟数。
*-基于在11小时的血凝块大小估计的时间。
在所检定的所有浓度下，rBPI21减少大约50％的血凝块溶解时间。rBPI50减少血凝块溶解时间，在1μLg/mL下为大约29％，在5μLg/mL下为大约19％，以及在25μg/mL下为大约50％。rLBP减少血凝块溶解时间，在5μLg/mL下为大约57％，在25μg/mL下为大约29％，并且在1μLg/mL下无任何明显的影响。这些结果显示总的来说，rBPI21在提高tPA对血凝块溶解的效应方面比rBPI50和rLBP更有力。H．新鲜的富含血小板的血浆(PRP)和血小板缺乏的血浆(PPP)的影响在存在或者缺乏rBPI21的条件下，利用从相同的供体中新鲜收集的富含血小板的血浆(PRP)和血小板缺乏的血浆(PPP)来评价血凝块的形成和溶解。以下列顺序在聚丙烯试管中将下列试剂混合在一起(1)120μL的新鲜的PRP或者PPP(供体EL)；(2)80μL的rBPI21(5、25或125μg/mL)或者对照(0.1％HSA-TBS)和tPA(300单位/mL)；以及(3)200μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
在37℃水浴中的温育上述试管，并由目检(每1分钟一次)检查凝胶血凝块形成。测量CaCl2加入之后的血凝块形成的分钟数。
在PPP和PRP中都观察到rBPI21对血凝块形成速率的直接剂量响应效应；较高的rBPI21浓度引起较大的血凝块形成的延迟。对于在这一实验中使用的试验条件，PRP显示出比PPP快的凝血时间。
对于这一实验的血凝块溶解部分，在37℃下连续不断地温育而无须进一步加入试剂。测量血凝块溶解的分钟数。
对于所有试验条件，新鲜的PRP有比新鲜的PPP长的血凝块溶解时间。对于每种血浆类型(PRP或者PPP)，血凝块溶解在1μg/mL rBPI21浓度下都是最快的。计算血凝块形成至血凝块溶解的时间，并将其显示如下。
在这一实验中，观察到血凝块形成的剂量响应效应；在PRP和PPP中增加rBPI21浓度导致凝血时间的增加。然而，并没有明显地观察到血凝块溶解的rBPI21剂量响应效应。总的来说，在1μLg/mL rBPI21下观察到较快的血凝块溶解时间。然而，如果测量血凝块形成与血凝块溶解之间的时间，那么在血凝块溶解时间方面仅仅有中等程度的差别。从这些结果来看，似乎观察到rBPI21浓度越低，对血凝块溶解而非血凝块形成的影响就越大。当rBPI21浓度增加时，观察到较大的对血凝块形成而非血凝块溶解的影响。I.rBPI21对新鲜收集的血液的影响用rBPI21和新鲜收集的血液评价血凝块形成。对于这一实验，将血液收集到四支硅化的3mL Vacutainer_管(包含50、100、200μLg/mLrBPI21或者对照配方缓冲液)中。在血液收集之后将每支管子倒转几次，并将它们放置在冰上直到已收集了所有管子的血液。(每支管子的收集时间小于三十秒)。
将所有管子放置在37℃水浴中，并通过和缓地倾斜管子和目检(每一分钟一次)检查血凝块形成
s>增加的rBPI21浓度以依赖于剂量的方式减缓血凝块形成的速率，但是并不完全阻止血凝块形成。实施例2利用微量滴定板测定的BPI蛋白质产物对血凝块形成和血凝块溶解的效应利用人血浆样品在各种条件之下利用96孔微量滴定板测定来评价BPI蛋白质产物对血凝块形成的效应。这些试验进一步证实了实施例1中所描述的试管测定的结果。对于这些试验，如实施例1所描述的一样制备人血浆、PRP或PPP。
对于基于平板的测定，所有实验都在37℃下进行，并且每孔的总体积是大约200μL(当存在或者缺乏凝血之前加入的tPA时)或者大约250μL(其中50μL的tPA在凝血之后加入至包含200μL试样的孔中)。A．BPI蛋白质产物和tPA在凝血之前加入的影响新鲜的PRP和PPP当rBPI21和tPA在加钙之前加入至新鲜的PRP或者PPP中时，评价血凝块形成。以下列顺序将下列试剂加入至96孔微量滴定板(例如，Dynatec,Chantilly,VA,CoStar,Cambridge,MA)的每个孔中(1)60μL 0.1％HSA-TBS；(2)50μL的新鲜的PRP或者PPP(供体PM)；(2)20μL的rBPI21(1000、250、50、10或者2μg/mL)；(4)20μL的tPA(600单位/mL、100ng/mL)；以及(5)50μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.8)。
在CaCl2加入之后，立即通过利用自动平板读数器(Vmax平板读数器，Molecular Devices,Menlo Park,CA)以不同时间(在这一实验中为2小时，间隔时间为2分钟)的在405nm的光密度来测量上述孔的浊度。在5秒之内扫描整个平板。点绘2小时期间每2分钟时间间隔的OD405-时间数据。随着OD405随时间的变化(即当血凝块形成时OD405增加)，测量血凝块形成的速率。在OD405达到峰值之后，tPA的凝血之前加入使得血凝块溶解，该溶解可由OD405随时间而减少测得。
在这一实验中，rBPI21在5、25和100μg/mL浓度下完全阻止PRP和PPP的血凝块形成。在1μg/mL下，rBPI21有效地延长血凝块存在的时间，该延迟由达到OD405峰值水平(血凝块时间)的时间的延迟和OD405峰值强度(血凝块密度)的减少测得。在0.2μg/mL rBPI21下，血凝块形成时间和对照相差不大。B．当tPA在凝血之前加入时各种BPI蛋白质产物和对照蛋白质的影响冻结的PPP当在钙加入之前在PPP中加入rBPI21、rBPI50、rBPI42、LBP和祝马丁(具有与RBPI21相似大小和电荷的对照阳离子性蛋白质)以及tPA时，评价血凝块形成。以下列顺序将下列试剂加入至96孔微量滴定板的每一孔中(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)50μL的已冻结在-70℃下的PPP(供体PM)；(3)20μL的蛋白质产物(rBPI21、rBPI50、rBPI42、LBP以及祝马丁，每一种为1000、250、50、10或者2μg/mL)；(4)20μL的tPA(600单位/mL,100ng/mL)；以及(5)50μL的20mMCaCl2(在TBS中，pH7.4)。
在CaCl2加入之后，立即在以上的部分A所描述的各种时间以OD405测定上述孔的浊度。在这一实验中，以由OD405达到峰值时的时间测定的血凝块形成的分钟数来测量血凝块形成的时间。
+相比于对照本质上减少(例如3-4倍)的峰值高度*在配方缓冲液对照中的较高的柠檬酸盐有效浓度在100μg/mL下，rBPI21、rBPI50、rBPI42完全阻止血凝块形成(根据在2小时动力学平板读数器分析过程中在OD405方面没有可检测到的增加来测量)；在25μg/mL下，这些BPI蛋白质产物本质上阻止凝血(根据在2小时期间只有轻微的OD405增加来测量)。在5μg/mL下，rBPI21和rBPI50有效地延迟血凝块形成的时间(根据OD405峰值水平出现的时间的延迟来测量)。在这一实验中，LBP和祝马丁不影响血凝块形成的时间。阳离子性对照蛋白质祝马丁的影响的缺乏表明BPI蛋白质产物所致的血凝块形成的时间的延迟不仅仅是由于它们的阳离子性质所致的电荷作用。C．BPI蛋白质产物和各种纤溶酶原激活物的凝血之前加入的影响冻结的PPP当在钙加入之前在PPP中加入rBPI21和纤溶酶原激活物(tPA、尿激酶或者链激酶)时，评价血凝块形成。以下列顺序将下列试剂加入至96孔的微量滴定板的每孔中(1)60μL的0.1％HSA-TBS；(2)50μL的已冻结在-70℃下的PPP(供体PM)；(3)20μL的rBPI21(1000、250、50、10或2μg/mL)；(4)20μL的PA(tPA,1000ng/mL；对于尿激酶，100和1000ng/mL；对于链激酶，100和1000ng/mL)；以及(5)50μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.4)。
在CaCl2加入之后，立即以与以上A部分所描述一样的OD405来测量上述孔的浊度。在这一实验中，在100μg/mL下，rBPI21完全阻止血凝块形成(根据在2小时动力学平板读数器分析过程中在OD405方面没有可检测到的增加来测量)；在25μg/mL下，在其中tPA、尿激酶或者链激酶存在于凝血之前的混合物中的条件下，rBPI21本质上阻止血凝块形成。在5μg/mL下，观测到rBPI21的减少血凝块形成的效应。在1和0.2μg/mL下，rBPI21血凝块形成时间与对照相差不大。在试验的尿激酶的浓度(10和100ng/mL)下，血凝块溶解并不随着血凝块形成而发生，而这种情况在100ng/mL tPA和100ng/mL(但不是10ng/mL)链激酶下确实发生。D．BPI蛋白质产物对得自各种供体的血浆的影响新鲜的PPP当在钙加入之前在新鲜PPP中加入rBPI21(但不是tPA)时，评价血凝块形成。以下列顺序将下列试剂加入至96孔的微量滴定板的每孔中(1)80μL的0.1％HSA-TBS；(2)50μL的新鲜PPP(供体MW、RD和RL)；(3)20μL的rBPI21(1000、250、50、10或2μg/mL)；以及(4)50μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.4)。
在CaCl2加入之后，立即以与以上A部分所描述一样的OD405来测量上述孔的浊度。在这一实验中，各种浓度的rBPI21都减缓或者阻止血凝块形成。在上述响应过程中在同时试验的三种供体血浆样品中观察到一些个体变异。对于全部的三种供体，25和100μg/mL的rBPI21完全阻止新鲜PPP的血凝块形成。在5μg/mL下，rBPI21也完全阻止得自一种供体(RL)的PPP的血凝块形成，并本质上阻止得自另两种供体(MW和RD)的PPP的凝血。在1μg/mL下，rBPI21本质上阻止得自一种供体(RL)的PPP的凝血，并在另两种供体(MW和RD)的PPP中观察到减少的凝血。甚至在0.2μg/mL rBPI21下观察到对一种供体的轻微影响；一般在0.2μg/mL rBPI21下，血凝块形成与对照相差不大。E．在凝血酶诱导的血凝块形成之后的多种BPI蛋白质产物和凝血之后的tPA加入的影响新鲜的PPP当在含有0.125单位/mL凝血酶和钙的新鲜PPP中加入rBPI21和tPA时，评价血凝块溶解。以下列顺序将下列试剂加入至96孔微量滴定板的每一孔中(1)80μL的0.1％HSA-TBS；(2)50μL的已冻结在-70℃下的PPP(供体PM)；(3)20μL的rBPI21或rBPI42(50、10或2μg/mL)；以及(4)50μL的20mM CaCl2(在TBS中，pH7.4，含有0.5单位/mL凝血酶)。
在凝血酶和CaCl2加入之后，使血凝块形成发生，并加入50μL含有0.5单位/mL肝素的tPA(300单位/mL,500ng/mL)(在TBS中，pH7.4)。在血凝块形成和tPA加入之后(大约15分钟)，以OD405测量上述孔的浊度。在这一有由凝血酶诱导的血凝块形成的初始实验中，在凝血之后加入tPA的条件下，rBPI21和rBPI42使血凝块得以溶解(根据OD405随时间的减少测量)。在tPA浓度不变(100ng/mL)的条件下，rBPI21或rBPI42浓度(0.2,1和5μg/mL)的增加导致加速的血凝块溶解(即OD405减少的速率快大约2-4倍)。实施例3BPI蛋白质产物对在大鼠血栓形成模型中由tPA诱导的血凝块溶解的影响利用大鼠血栓形成模型来测定含有溶栓剂(tPA)的BPI蛋白质产物(rBPI21)对血凝块溶解和在溶解血栓治疗之后的再闭塞的效应。如本文所述修改Klement等(血栓形成血郁滞，68:64-68(1992))的方法，以便测定rBPI21(在5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、0.2％泊咯沙姆188、0.002％多乙氧基醚80中)对tPA诱导的体内血凝块溶解的效应。在这一实验中，用氯胺酮/Rompum使两组大鼠(5只属于载体处理的组，5只属于rBPI21处理的组)麻醉，并将导管放置在两条施用有治疗剂的颈静脉中。插管于右边的普通颈动脉中以测量血压和心率。在下腹部中进行中线切开以便露出终动脉和髂部血管，将这些血管与结缔组织剥离并与腔静脉(其中可能是大静脉)分离。结扎主动脉(可观察到的)的大量小分支的全部以便分离大约1cm长的一段血管。用20标准计量钝针(由橡皮隔片密封)插管于左髂部动脉。将超声流转导器胶管管头放置在右髂部动脉周围，以便用流量计[Crystal Biotech,Holliston,MA]测量血流量。流量信号记录在记录仪上。
进行下列过程以便伤害主动脉并因此提供血凝块形成的表面。将上述20标准计量针推进至主动脉并慢慢地沿1-1.5cm长度靠着管壁移动。重复这一过程8次。移去上述针，并用平滑的钳子夹压上述主动脉的同一区域4次。其后，通过在两个位置和缓地拉紧丝线而在终动脉产生一个狭窄的区域。此时测量右髂部血流量并指定其为＂闭塞之前的＂水平。
此时，历时30秒(4mL/kg)以如大丸剂一样的2mg/mL溶液在rBPI21处理过的大鼠中将20mg/kg rBPI21静脉内地施入颈静脉之一中，该2mg/mL溶液在5mM柠檬酸盐、0.2％泊咯沙姆188、150mM NaCl(Pluronic F-68,BASF Wyandotte,Parsippany,NJ)和0.002％多乙氧基醚80(Tween 80,ICI Americas Inc.,Wilmington,DE)、pH5中；其后以20mg/kg/小时的恒定速率(该速率持续到本实验结束)注入rBPI21。载体处理过的大鼠接收相同的容量；载体溶液是5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、0.2％泊咯沙姆188(Pluronic F-68,BASFWyandotte,Parsippany,NJ)以及0.002％多乙氧基醚80(Tween 80,ICI Americas Inc.,Wilmington,DE)、pH5。其次，用恰好放置在血流胶管管头之上的小金属钢夹使右髂部动脉闭合。由于左髂部动脉已经为针导管所密封，因此使血液限制在闭塞之上。最后，在受伤害的部位之上使主动脉闭合，从而产生具有郁滞的狭窄区域。使闭塞保持30分钟，然后除去闭塞。由没有记录到血流通过右髂部动脉提供了血凝块已形成的证据。
在闭塞撤除之后的第五分钟，以1mg/kg的大丸剂将t-PA施入其它颈静脉(其中还没有施用rBPI21)，其后在1小时内注入1mg/kg。在1小时之后，中止tPA和rBPI21(或者载体)注入，并结束实验。将血凝块溶解定义为通过右髂部动脉的血流量恢复到闭塞之前的水平的50％。记录直到血凝块溶解的时间长度，以及记录直到在初始的血凝块溶解之后的第一次再闭塞的时间。也记录血管经过1小时的t-PA处理之后再闭塞的时间。将再闭塞定义为血流量减少至闭塞之前的水平的10％。用“学生”T检验进行缓冲液处理的组和rBPI21处理的组之间的统计比较。t-PA和rBPI21都不产生任何不利的全身性影响，除了只是由于主动脉的闭塞所致的血压的升高。
上述结果表明在血凝块溶解的平均时间上没有任何显著性差异，该平均时间对于缓冲液处理的组为14.4±5.1分钟，对于rBPI21处理的组为16.1±4.2分钟。多发性再闭塞发作发生在所有大鼠中。在两组之间，第一次再闭塞的时间无明显的差异。然而，在rBPI21处理的组中，再闭塞的次数在统计上明显地减少(p＜0.05)；rBPI21处理的组平均为4±1.6次再闭塞发作，而缓冲液处理的组平均为9±1.7次再闭塞发作。
对于本领域技术人员，可望对上述发明进行许多修改和改变。因此，唯一的这样限制(出现于所附的权利要求书中)应该置于其上。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Xoma公司(ⅰa)发明人White,Mark L.
Ammons,William Steve(ⅱ)发明题目抗血栓形成的材料和方法(ⅲ)序列数2(ⅳ)联系地址(A)收信人Marshall,O’Toole,Gerstein,Murray &amp; Borun(B)街道6300 Sears Tower,233 South Wacker Drive(C)城市芝加哥(D)州伊利诺州(E)国家美利坚合众国(F)ZIP:60606-6402(ⅳ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)当前的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)在先的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅷ)律师/代理人信息(A)名称Jeffrey S.Sharp
(B)注册号31,879(C)参考/证书号27129/33249PCT(ⅸ)电讯信息(A)电话312/474-6300(B)传真312/474-0448(C)电传25-3856(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1813个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅲ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)配置31..1491(ⅸ)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)配置124..1491(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc feature(D)其它信息“rBPI”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG ATG AGA GAG AAC ATG GCC AGG GGC 54Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly-31 -30 -25CCT TGC AAC GCG CCG AGA TGG GTG TCC CTG ATG GTG CTC GTC GCC ATA 102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile-20 -15 -10GGC ACC GCC GTG ACA GCG GCC GTC AAC CCT GGC GTC GTG GTC AGG ATC 150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-5 1 5TCC CAG AAG GGC CTG GAC TAC GCC AGC CAG CAG GGG ACG GCC GCT CTG 198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10 15 20 25CAG AAG GAG CTG AAG AGG ATC AAG ATT CCT GAC TAC TCA GAC AGC TTT 246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe30 35 40AAG ATC AAG CAT CTT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TTC TAC AGC ATG GAC 294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp45 50 55ATC CGT GAA TTC CAG CTT CCC AGT TCC CAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT 342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn60 65 70GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGC AAC GCC AAT ATC AAG ATC AGC GGG 390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly75 80 85AAA TGG AAG GCA CAA AAG AGA TTC TTA AAA ATG AGC GGC AAT TTT GAC 438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90 95 100 105CTG AGC ATA GAA GGC ATG TCC ATT TCG GCT GAT CTG AAG CTG GGC AGT 486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser110 115 120AAC CCC ACG TCA GGC AAG CCC ACC ATC ACC TGC TCC AGC TGC AGC AGC 534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser125 130 135CAC ATC AAC AGT GTC CAC GTG CAC ATC TCA AAG AGC AAA GTC GGG TGG 582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp140 145 150CTG ATC CAA CTC TTC CAC AAA AAA ATT GAG TCT GCG CTT CGA AAC AAG 630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys155 160 165ATG AAC AGC CAG GTC TGC GAG AAA GTG ACC AAT TCT GTA TCC TCC AAG 378Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170 175 180 185CTG CAA CCT TAT TTC CAG ACT CTG CCA GTA ATG ACC AAA ATA GAT TCT 726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser190 195 200GTG GCT GGA ATC AAC TAT GGT CTG GTG GCA CCT CCA GCA ACC ACG GCT 774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala205 210 215GAG ACC CTG GAT GTA CAG ATG AAG GGG GAG TTT TAC AGT GAG AAC CAC 822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His220 225 230CAC AAT CCA CCT CCC TTT GCT CCA CCA GTG ATG GAG TTT CCC GCT GCC 870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala235 240 245CAT GAC CGC ATG GTA TAC CTG GGC CTC TCA GAC TAC TTC TTC AAC ACA 918His Asp Arg Met Va1 Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr250 255 260 265GCC GGG CTT GTA TAC CAA GAG GCT GGG GTC TTG AAG ATG ACC CTT AGA 966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala G1y Val Leu Lys Met Thr Leu Arg270 275 280GAT GAC ATG ATT CCA AAG GAG TCC AAA TTT CGA CTG ACA ACC AAG TTC 1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe285 290 295TTT GGA ACC TTC CTA CCT GAG GTG GCC AAG AAG TTT CCC AAC ATG AAG 1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys300 305 310ATA CAG ATC CAT GTC TCA GCC TCC ACC CCG CCA CAC CTG TCT GTG CAG 1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln315 320 325CCC ACC GGC CTT ACC TTC TAC CCT GCC GTG GAT GTC CAG GCC TTT GCC 1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330 335 340 345GTC CTC CCC AAC TCC TCC CTG GCT TCC CTC TTC CTG ATT GGC ATG CAC 1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His350 355 360ACA ACT GGT TCC ATG GAG GTC AGC GCC GAG TCC AAC AGG CTT GTT GGA 1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly365 370 375GAG CTC AAG CTG GAT AGG CTG CTC CTG GAA CTG AAG CAC TCA AAT ATT 1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile380 385 390GGC CCC TTC CCG GTT GAA TTG CTG CAG GAT ATC ATG AAC TAC ATT GTA 1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val395 400 405CCC ATT CTT GTG CTG CCC AGG GTT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GGC TTC 1398Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe410 415 420 425CCT CTC CCG ACG CCG GCC AGA GTC CAG CTC TAC AAC GTA GTG CTT CAG 1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln430 435 440CCT CAC CAG AAC TTC CTG CTG TTC GGT GCA GAC GTT GTC TAT AAA 1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys445 450 455TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC 1551ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT 1611TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG 1671CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT 1731CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC ATTTGTGCTT CATGAAAAAA 1791AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG1813(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度487个氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val-31 -30 -25 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15 -10 -5 1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala5 10 15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys20 25 30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly35 40 45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50 55 60 65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser70 75 80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe85 90 95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile100 105 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr115 120 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130 135 140 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys150 155 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys165 170 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu180 185 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu195 200 205Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys210 215 220 225Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro230 235 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly245 250 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala260 265 270Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser275 280 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290 295 300 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser310 315 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro325 330 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala340 345 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser355 360 365Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370 375 380 385Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu390 395 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val405 410 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val420 425 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe435 440 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450 45权利要求
1．一种减缓血液中的血凝块形成的方法，该方法包含以有效量向病人施用一种BPI蛋白质产物以延迟或者阻止血液中的血凝块形成。
2．一种用于加速血液中的血凝块溶解的方法，该方法包含以有效量向病人施用一种BPI蛋白质产物以加速血液中的血凝块溶解。
3．一种用于治疗血栓形成病症的方法，该血栓形成病症选自由下列疾病组成的组中动脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、脑部动脉血栓形成、中风、心内血栓形成、外周动脉血栓形成或者闭塞、静脉血栓形成、肺部栓塞、与患者血液向外来的或者受伤的组织表面的暴露相联系的血栓形成、凝固性过高、与内毒素无关的凝血病、以及与内毒素无关的弥漫性血管内凝血病，该方法包含向患有上述血栓形成病症的患者施用一种药学上有效量的BPI蛋白质产物。
4．一种用于治疗血栓形成病症的方法，该血栓形成病症选自由下列疾病组成的组中动脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、脑部动脉血栓形成、中风、心内血栓形成、外周动脉血栓形成或者闭塞、静脉血栓形成、肺部栓塞、与患者血液向外来的或者受伤的组织表面的暴露相联系的血栓形成、凝固性过高、与内毒素无关的凝血病、以及与内毒素无关的弥漫性血管内凝血病，该方法包含向患有上述血栓形成病症的患者同时施用一种药学上有效量的BPI蛋白质产物和溶栓剂。
5．权利要求4的方法，其中上述溶栓剂的量少于当上述溶栓剂作为单一疗法施用时所需的药物有效量。
6．一种用于在接受溶栓剂治疗的患者中加速再灌注或者减少再闭塞的方法，该方法包含一种药学上有效量的BPI蛋白质产物和上述溶栓剂的同时施用。
7．一种用于减少在患者中建立再灌注或者减少再闭塞所需的溶栓剂的剂量的方法，该方法包含BPI蛋白质产物和溶栓剂的同时施用，上述溶栓剂的剂量少于当上述溶栓剂作为单一疗法施用时所需的药物有效量。
8．一种用于减缓血液中的血凝块形成的方法，该方法包含使上述血液与有效量的BPI蛋白质产物相接触以延迟或者阻止血液中的血凝块形成。
9．一种用于加速血液中的血凝块溶解的方法，该方法包含使上述血液与有效量的BPI蛋白质产物相接触以溶解或者裂解血凝块。
10．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的方法，其中上述BPI蛋白质产物是具有大约21kD至25kD的分子量的BPI蛋白质的氨基末端片段。
11．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的方法，其中BPI蛋白质产物是rBPI23或其二聚物。
12．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的方法，其中BPI蛋白质产物是rBPI21。
13．一种BPI蛋白质产物在用于治疗血栓形成病症的药物的制备中的用途，该血栓形成病症选自由下列疾病组成的组中动脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、脑部动脉血栓形成、中风、心内血栓形成、外周动脉血栓形成或者闭塞、静脉血栓形成、肺部栓塞、与患者血液向外来的或者受伤的组织表面的暴露相联系的血栓形成、凝固性过高、与内毒素无关的凝血病、以及与内毒素无关的弥漫性血管内凝血病。
14．一种BPI蛋白质产物在用于通过与一种溶栓剂同时施用来治疗血栓形成病症的药物的制备中的用途，该血栓形成病症选自由下列疾病组成的组中动脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、脑部动脉血栓形成、中风、心内血栓形成、外周动脉血栓形成或者闭塞、静脉血栓形成、肺部栓塞、与患者血液向外来的或者受伤的组织表面的暴露相联系的血栓形成、凝固性过高、与内毒素无关的凝血病、以及与内毒素无关的弥漫性血管内凝血病。
15．一种BPI蛋白质产物在用于在接受溶栓剂治疗的患者中加速再灌注或者减少再闭塞的药物的制备中的用途。
16．一种BPI蛋白质产物在用于减缓血液中的血凝块形成的药物的制备中的用途。
17．一种BPI蛋白质产物在用于加速血液中的血凝块溶解的药物的制备中的用途。
18．按照权利要求13至17之任一的用途，其中的BPI蛋白质产物选自由下列物质组成的组中具有大约21kD至25kD的分子量的BPI蛋白质的氨基末端片段、rBPI23或其二聚物以及rBPI21。
全文摘要
本发明提供用于治疗血栓形成病症的抗血栓形成材料和方法,其中有效治疗量的BPI蛋白质产物得到施用。
文档编号A61K38/43GK1222858SQ97195725
公开日1999年7月14日 申请日期1997年5月9日 优先权日1997年5月9日
发明者M·L·怀特, W·S·安蒙斯 申请人:爱克斯欧玛公司