专利名称：抗凝血酶－iii的生产方法纯化方法及含该酶的制剂的利记博彩app
专利说明血酶-III酶萍 婕把 III酶萍裕婕捌钢寄垦 III痛约痛目血酶-III萍诳血酶-III目枚冉傻摹 血酶-III(撕为AT-III)一2虻鞍椎堑状血小AT-III为65,00068,000械酶苹浴AT-III强血酶血浴 猓珹T-III血酶苹裕叶血罨 X突罨疘X也苹浴荼AT-III血维酶鹊酶苹浴 些苹通诟毓赂为佟 些缘AT-III驯斐Ｔ惯∝鄙⒀ 血(DIC)AT-III枚冉母 猓珹T-III愿鼐缀裕驯硕执谢裕使斯潭(JP-A-63-23896玫铩癑P-A指未蠊毡专搿 遥AT-III一执血械牡剩一萍时要潜诘牟睢 些畲πＲ恢 0液态却10小时牵荼AT-IIIPH68时榷模56却6小时丧失80幕(J.Biol.chem(锘е 2463694(1971))一妫报指14.7w/v拼拢AT-III60液态却10小时AT-III幕榷(Thrombosis Research(血栓芯)22233(1981)J.Biol.chem.25612140(1981))然0.351.5M(10.2944.12w/v)拼陆AT-III液屑时通叩泳鄄斓紸T-III谋(Vox Sang48325(1985)) 植畲σ苍底T-III酆系谆频椎龋裕通俅谓泄潭卮(JP-A-63-23896)水色追(JP-A-1-275600)实姆斜然潭卮砑词挂灰册导碌偷幕曰剩遥水色状染椎目裕前宓白∽gG鹊龋俅谓写猿去些祝纱嘶曰驶峤低 一目峁┮窖礎T-IIIAT-III液态斜时榷AT-III幕圆壹AT-III谋(浠 谩酆玫鹊) 猓荒酷供去染锏癆T-III鹊鹊一同时AT-III幕浴 浠八垫及一AT-IIIAT-III 裕通雍AT-III水液AT-III姆汛锏剿 些目募目模侔(a)(b)械一 (a)榷录群AT-III水液群员旨前血酶III缘85撸壹群血酶III谋员95撸 (b)使媒脂砗珹T-III水液沾AT-III 猓ㄒ灰┭达到吮些目暮目模药锖的捌盇T-III药峡山艿危约选药峡山艿濉 图
图1潜示越铜拥脂AT-III洗式图 图2潜示浓榷越铜拥脂AT-III洗式影图 图3潜示媒铜拥脂AT-III前HPLC-GPC图 图4潜示Ouchterlony械越铜拥脂拇AT-III前史图巍 图5潜示媒铜拥脂+未铜脂AT-III前HPLC-GPC图 (I)原 AT-III水液(撕蟪３为AT-III水液)影血谆铮–ohn掖玫募(Fr.)II+III液IV约雍蔚血谢血VIII牟锛吨ＧＴ藏毖 通蚬こ痰确玫暮AT-III液也杀诖AT-III小 专US3,842,061(JP-A-48-35017)专US4,340,589(JP-A-54-95715)EP-A-339919(JP-A-1-275600)EP-A-551084泄舜血液血谢AT-III木宕跨，玫一牵血谐去玫牡掖IV-1IVII+III液一通筒写 猓彩瓜 EP-A-53165(JP-W-57-500768)[铩癑P-W指未蠊毡专搿盷蚬こ谭[EP-A-90505(JP-A-58-162529)]票AT-III (II)却 荼却矸ˋT-III水液说露潞说时诮却恚度菏鼻壁盒的踩撅。裕5070选约60却恚蔽 020小时选约10小时液PH为510选6.59.0为选使说幕液械凇AT-III水液AT-III谋为10500位/ml选1200位/ml为选25100位/ml荼1位AT-III指嗟 ml血AT-IIIAT-III幕浴AT-III幕强刹模使铣傻AT-III圆(Test Team AT-III-2-kitDaiichi Pure chemicalsCo.Ltd)舛 址式却恚谷碅T-III芑员为却前85撸选95撸AT-III水液械AT-III谋为95撸选99摺 AT-III谋强刹模通效液色(HPLC)使0.3M然-0.05M位液(PH7.0)平G3,000SWXL(TosohCorp.)舛 为锏街苍和等堵 却怼 (III)榷 诒却榷选选谢巍然啤 诒谢脂谋突虿槐偷一元(一)元()元()选210碳原樱为选26碳原印一元影一元(拾帷⑨、影帷⑨、)元影偷脂(帷 帷⑨、帷 偷脂(帷 (绫 元(於、劝)元腔(绫结、石)元影元腔()校选苹帷⑹、帷㈧冬幔∑会。
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(2)诖色 -脂F.F.(Pharmacia)AF-chelate Toyopearl 650M(TosohCorp.)色濉 (3)AT-III圆舛ㄊ 通铣傻锓ㄊ筍-2238胁舛⊿2238玫姆应止液歉Test Team AT-III-2-kit(Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd)系摹一(20mg)S-2238芙21ml水小血酶液(1.2U/ml)Green Cross Corpoation谋准AT-III液(1U/ml)杉莶-40麓牛使时煤40mM Tris60mM EDTA0.14M NaCl0.2HSA(血椎)2.4U/ml丶PH8.4液呀品110mU/ml一荻50l品100l血酶液停375印牛100l液筒确5樱然螅1000l应止梅应405nm虏舛ㄒ喝Ｊ姑弊糀T-III液瞥谋准直呒品AT-III浴 却每AT-III品AT-III芑[U/ml液(ml)]却前AT-IIL芑之鹊陌俜始为AT-III圆剩示诒1 (4)AT-III然 通舛科稟280nm(撕为A280)碌燃品械牡玫AT-III猿缘每品谋然(U/A280)示诒1 (5)HPLC 通G3000 SWXL(7.8mm30mmTosoh)装SystemGold(Beckman)使煤50mM坪0.3M NaClPH7.0液展液写拢为0.7ml/min280nm陆屑狻 HPLC贸AT-III示诒1颖1也傻玫AT-III谋猿潭(谋邸鄣) (6)Ouchterlony 猿梅通每一品浓280nm约30每(图4械一)血铜(1)(Hoechst N-血血铜)转(2)(Hoechst N-血转)税椎(3)(HoechstN-血椎)前(4)(Hoechst N-血前椎)私榈 5)(DAKO A030)甩2虻鞍(6)(DAKO A033)甩1鹊酶(7)(DAKO A012)IgA(8)(DAKO A02621)IgG(9)(DAKO A04231)IgM(10)(Hoechst-IggM()血)血酶原(11)(DAKO A325)涂血维原(12)(DAKO A080) 实施1 一Cohn掖旨敕的糏V-110kg状锉 00水校液屑岜蹬ㄎ w/v嘶30樱通岜笛冈橙ペ笛冈 嘶玫液PH6.513w/v叶#4,000(平舛 值2,6003,800Nippon Soda Co.Ltd)停某去贸铮 玫液俅30w/v木叶#4,000停幕纱纬傻某铩 盏某芙约20水校预水平母-脂(pharmacia)希AT-III0.4M然液洗票猿去实祝然2.0M然液通曰洗训AT-III帧 嘶玫AT-III水液示诒1榷停PH7.8然60却10小时舜AT-III水液攵⊥鞠 ButylToyopearl 650Tosoh Corp.)哟预使煤3M然频20mM苹液(PH7.5)平猓雇灰何挂涸晃 帧然0.5苹液(PH7.5)透夜曰么AT-III 舛ㄈ疵枯碅T-III品幕裕约却前AT-III幕缘牟省傻玫每AT-III品牡省 1 ()却AT-III芑却前AT-III芑之鹊陌俜省 HPLC()AT-III 坪然时鄄斓叫钝和聚很得 疲诘浓驴晒鄄斓饺缎毙a-Cit指疲Sorb指山娲 实施2 使-脂F.F.AT-III 1.5ml-脂F.F.(0.92.3cm)霞同(1.5ml)水浓为10mg/mlCuSO45H2O越辖然2(3ml)水洗痈牛通3暮0.1M坪0.5MNaClPH8.0液平PD-10(pharmacia)驯同液木却3ml AT-III浓液(A2804.20)纱票希1.5ml/Fr(Fraction)占洗鸭帧然霞每菥为3(4.5ml)牡PH7.57.06.0暮0.1M坪0.5M NaCl液同式1.5ml/Fr占洗鸭帧通250mMEDTA2Na去辖然3水洗玫 示图1图1示蟛糠值PH8.0铜PH7.5PH7.5时洗选 2示铜洗液GPC-HPLC慕2示诒铜前未缘()AT-III为88.0诖洗鸭懈么斜PH值卤为100也说液PH8选PH7.5时通效爻去AT-III拥祝些PH6.5时也岜 2 系品械AT-III龋88 实施3 浓鹊影 为舛ㄉ灰盒蹬ㄈ涤办，使0.1M苹液(PH7.5)通0.1M(PH7.5)屑0.1M NaCl0.5M NaCl票幕液舛ㄈ磁ˋT-III液铜色为也说通PD-10却浓AT-III液每只液芗A280值约为5然螅每5ml液同液平1ml铜(0.82cm)稀喜始3ml值墓液剩嗖空忌 ml然螅直酶缘幕液洗樱洗时洗液占杉1ml洗式示图2每洗液AT-III鹊GPC-HPLC舛ㄊ 3 3 系品AT-III拇为81.15 图2示诓NaCl秃0.1M0.5M NaCl之洗品没蟹圆臁Ｒ 示拢洗液AT-III拇为100.0耍示液浓鹊谋浠 没影臁 猓姑礟H7.37.57.70.1M苹液(0.1MNaCl)舛≒H浠办；示诖朔围PH谋浠 没影臁Ｊ .1M苹液(0.1MNaClPH7.5)舛 碌色为示诖朔围诘露缺浠 影臁 实施4 诜糯写潭鹊确痛实 通PD-10(A2804.05)却浓AT-III液牒 .1MNaClPH7.50.1M液谢液然蠼液25ml旨5ml铜Toyopearl 650M(1.52.8cm)希同液平狻 嗟壁 .5ml去然螅应品同时玫洗液2暮平饣阂合此惨 32.5ml)为AT-IIIA280值AT-III曰示诒4色前GPC-HPLC图示图3 4示玫幕剩A280为80.3AT-III为89.6遥图3示GPC-HPLC洗液示AT-III牡一澹槽猴、AT-III实住 猓稯uchterlony时未潜诘实(血铜住转住椎住前椎住榈白 2住1鹊酶IgAIgGIgM血酶原血维原(图4) 耍示PH7.5通铜Toyopearl 650M色卓沙去械住酆捅AT-III 4 实施5 铜脂漏铜 知铜色校咏系铜通椎同时微漏漏铜姆校一小未辖脂(霞山辖)一脂印牵漏铜姆效诤0.1MNaClPH7.50.1M苹液械20ml值却玫Fr.II+III液浓AT-III液(A2804.96)拥铜系Toyopearl(1.52.8cm5ml)希同液平猓茨贾合 27.5mlA2803.18)械23.5旨拥同平)未咏系Toyopearl 650M(0.82.0cm1ml)希喜未募(25mlA2802.63)每铜牟舛ㄊ沮 5 5示然通铜蟹10,300ppb漏铜纸液通未辖系Toyopearl 650M全漏铜为漏驯15ppb浅咏水平(13ppb) 原虾未咏洗液GPC-HPLC图示图5图5示Fr.II+III液玫原也鼙铜为AT-III姆未姆濉Ｓ纺次 9.9 实施6 铜未辖Toyopearl玫拇 堑为使色撞效吆远铜未咏辖屑狻r.II+III液Fr.IV木却浓AT-III液院0.1M NaClPH7.50.1M苹液透1600俅味同液透100(透为160,000)使Centyiprep-30(Amicon)浓稀(Fr.IVA2805.23FR.II+III液A280-5.50)通使Centriprep-30透诓幔雇 600透些液每20ml施诖5ml(1.52.8cm)铜系(Toyopearl1ml(0.82.0cm)未辖系Toyopearl希些同幕液平狻Ｏ囱狄菏┢肥比ツ 洗训募趾喜10m嗟 铜洗蛹稀 颖6示拇钥杉Fr.II+III夜Fr.IV原暇示玫幕曰剩为90摺遥然为约10U/A280使械药萍幕取 6 实施7 AT-III药萍票 实施5频么AT-III巍浓通BMM(bemberg MicroporousMembrane)膜(Asahi chemical Industry Co.Ltd.)恕纱票AT-III品50位/ml2w/v露0.52w/v坪0.5w/v然苹希1N平嘶PH7.27.5通Millipore殖n500位然涠吃幻兑┢ 然细吮站实施员员诓氡就肺钢变化透慕远准摹 19961120盏萁毡平8-309281199764盏萁平9-163426些全诖慰
权利要求
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全文摘要
从含抗凝血酶－Ⅲ的水溶液中制备抗凝血酶－Ⅲ的方法,其包括下列步骤(a)和(b)中至少一步:(a)在稳定剂存在下加热含抗凝酶－Ⅲ的水溶液,致使加热后仍保持加热前的抗凝血酶－Ⅲ活性的85%或更高,且加热后的抗凝血酶－Ⅲ单体的比率保持为95%或更高;和(b)用金属螯合树脂处理含抗凝血酶－Ⅲ的水溶液,并回收纯化的抗凝血酶－Ⅲ。
文档编号A61K38/36GK1189502SQ9712645
公开日1998年8月5日 申请日期1997年11月20日 优先权日1997年11月20日
发明者井手野祥次, 瓜生胜宽, 上村八寻 申请人:株式会社绿十字