专利名称：：益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌，特别涉及使用它们来提高经疫(菌)苗初次免疫或自然感染获得初次免疫机体的特异性免疫水平，以及它们在疫(菌)苗发展和免疫策略方面的应用。理想的疫(菌)苗应符合两个条件一是安全性好，二是具有良好的免疫原性。两者通常是一对矛盾，要么安全性较好，免疫原性较差；要么免疫原性较好，毒副作用较强。这种矛盾限制了疫(菌)苗在实践中的应用和发展。目前，疫(菌)苗的免疫接种方案多为先初次接种，经过一定时间后再实行加强免疫。这种免疫策略程度不一地存在着操作复杂、成本增加、使用麻烦尤其儿童难以接受等缺点。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌是人和动物肠道内正常菌群的重要的成员，在抗感染、调节机体免疫、抗衰老、抗肿瘤和提供某些营养物质等方面起着非常重要的作用。肠道正常大肠杆菌也是正常菌群成员之一，它作为保护性抗原基因的载体，在疫(菌)苗研究中被广为使用。但是，本发明所涉及的利用益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌来提高机体特异性水平和免疫力的免疫程序和策略，在国内外未有报道。本发明之目的，是利用益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫(菌)苗保护性抗原基因的大肠杆菌，对经疫(菌)苗皮下注射和口服途径初次免疫的机体，或自然感染获得初次免疫的机体，经过一定时间后，通过与初次免疫相同的途径，分别和以其不同的组合对初次免疫机体进行免疫调节，来解决经疫(菌)苗初次免疫或自然感染获得初次免疫以后，特异性免疫力下降和保护期短的问题。本发明的内容要点与技术方案如下1.选用无特异病原体(SpecificpathogenfreeSPF)动物BALB/c小鼠(购自卫生部北京药品生物制品检定研究所)，雌雄各半，随机分组，雌雄分盒饲养。2.菌种来源于中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，菌种主要特征(见附表1)。附表1.菌种的主要特征名称主要特征福氏2a志贺氏菌301野生型毒株痢疾I型志贺氏菌112野生型毒株DOM3*双价(福氏2a、痢疾I型志贺氏菌)菌苗；thyA-；无抗生素抗性E.coliX511表达痢疾I型志贺氏菌脂多糖的大肠杆菌分叉双歧杆菌从正常儿童粪便中分离嗜酸乳杆菌E.coliLE392基因工程菌株*志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3以福氏2a志贺氏菌thyA基因缺陷株为受体菌，转入痢疾I型志贺氏菌的菌体抗原基因构建而成。3.细菌培养志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3和E.coli.X511，分别从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用LB(NaCl10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，加蒸馏水至1000ml，PH7.4)培养基；野生型毒株福氏2a志贺氏菌301和痢疾I型志贺氏菌112，分别从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用PA(牛肉膏1.5g，NaCl3.5g，K2HPO4.3H2O4.8g，KH2PO41.32g，胰蛋白胨5g，葡萄糖1g，酵母粉1.5g，加蒸馏水至1000ml，PH7.2)培养基；于摇床中37℃、160转/分钟过夜培养，次日作50倍稀释，继续培养2-3小时。分叉双歧杆菌从冻干菌种管复苏后厌氧培养，挑取单个菌落，用BL(牛肉膏3g，多蛋白胨10g，胰蛋白胨3g，植胨3g，葡萄糖10g，酵母粉5g，可溶性淀粉0.5g，吐温801ml，5％半胱氨酸10ml，肝汤150ml，羊血50ml，琼脂15g，溶液A10ml，溶液B.5ml，加蒸馏水至1000ml，PH7.2；溶液AKH2PO425g，K2HPO425g，加蒸馏水至250ml；溶液BMgSO4.7H2O10g，FeSO4.7H2O0.5g，NaCl0.5g，MnSO40.337g，加蒸馏水至250ml)培养基，于厌氧罐中37℃培养48-72小时。嗜酸乳杆菌，从-70℃冰箱取出复苏培养，挑取单个菌落，用MRS(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，K2HPO42.0g，醋酸钠5.0g，枸缘酸三氨2.0g，吐温801ml，MgSO4.7H2O200mg，MnSO4.4H2O50mg，加蒸馏水至1000ml，PH6.0)培养基在37℃温箱中静置过夜培养。收集菌体，用生理盐水(皮下注射免疫)或0.2mol/LNaHCO3(口服免疫)配制成所需要的菌浓度。4.经皮下注射初次免疫及免疫调节的程序菌苗候选株DOM3皮下注射初次免疫程序(见附表2)；皮下注射免疫调节程序(见附表3)，在最后一次皮下注射初次免疫6周后(即第7周内)，通过皮下注射途径，分别给予分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511和其不同的组合，对经初次免疫的小鼠进行免疫调节。附表2.皮下注射初次免疫程序菌名菌量(CFU)/0.1ml间隔日部位次数DOM31083腹股沟皮下3附表3.皮下注射免疫调节程序组别菌量CFU/0.1ml间隔日部位次数分叉双歧杆菌10103腹股沟皮下3嗜酸乳杆菌10103腹股沟皮下3E.coliX5111093腹股沟皮下3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌各10103腹股沟皮下3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coli.X511各1010+1093腹股沟皮下3生理盐水0.1ml3腹股沟皮下35.经口服初次免疫和免疫调节及抗体监测程序(见附表4)。其中S，断尾取血50μl，稀释20倍，离心取稀释血清；F，取小鼠粪便，稀释10倍，置4℃浸泡过夜，经12,000rpm×10分钟离心取上清；V，经口灌入志贺氏菌双价菌苗候选株DOM3109/ml×0.5ml；N，经口灌入0.5ml0.2mol/LNaHCO3溶液；X，经口灌入E.coliX511菌109/ml×0.5ml；L，经口灌入嗜酸乳杆菌109/ml×0.5ml；B，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml×05ml；M1，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml，嗜酸乳杆菌109/ml等量混合液0.5ml；M2，经口灌入分叉双歧杆菌109/ml，嗜酸乳杆菌109/ml，E.coliX511菌109/ml等量混合液0.5ml。所有菌液均用0.2mol/LNaHCO3配制。附表4.经口服初次免疫和免疫调节及抗体监测程序组别\天037143033374460IS，F，VS，FS，FS，FS，F，NS，FS，FS，FS，FIIS，F，VS，FS，FS，FS，F，XS，FS，FS，FS，FIIIS，F，VS，FS，FS，FS，F，LS，FS，FS，FS，FIVS，F，VS，FS，FS，FS，F，BS，FS，FS，FS，FVS，F，VS，FS，FS，FS，F，M1S，FS，FS，FS，FVIS，F，VS，FS，FS，FS，F，M2S，FS，FS，FS，FVIIS，F，NS，FS，FS，FS，F，NS，FS，FS，FS，FVIIIS，FS，FS，FS，FS，FS，FS，FS，FS，F6.抗体滴度检测的方法(酶联免疫吸附实验Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)包被抗原福氏2a志贺氏菌301和痢疾I型志贺氏菌112菌体；羊抗鼠IgA、IgM(HRP)购自Sigma公司，羊抗鼠IgG(HRP)购自华美生物制品公司。7.抗体滴度动态检测在最后一次皮下注射初次免疫后第1周、2周、3周、4周、5周、6周(于第7周内，皮下注射分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、E.coliX511及其不同的组合进行免疫调节)、8周、9周、10周、11周、12周，对小鼠经眼眶采血，每组采5-11只小鼠眼眶血，每只鼠均测其血清中特异性抗体IgA、IgM、IgG的滴度，小鼠血清抗体滴度的几何均数，作为该组小鼠血清中相应抗体的滴度。8.对皮下注射免疫调节后小鼠的攻击在经DOM3初次免疫而未经免疫调节小鼠的血清抗体滴度下降至接近免疫前水平时(即在第9周)，用野生型毒株经腹腔攻击经免疫调节后的小鼠，观察每组小鼠的生存、死亡的情况，确定各组保护力的差异。实验观察结果1.分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、E.coliX511对经初次免疫的SPFBALB/c小鼠的免疫增强作用(见附图1)。1).菌苗候选株DOM3的免疫原性经DOM3皮下注射初次免疫后，小鼠血清中抗体IgA和IgG滴度峰值出现在最后一次皮下注射后第2周，而IgM滴度峰值出现在第1周然后血清滴度逐步下降，约在最后一次皮下注射6周后，趋于稳定。小鼠血清中同时具有抗福氏2a志贺氏菌和抗痢疾I型志贺氏菌的特异性抗体，而且其滴度变化的趋势基本一致。说明菌苗候选株DOM3具有良好的双价性，但是抗福氏2a志贺氏菌的抗体滴度高于抗痢疾I型志贺氏菌的抗体滴度，这可能与菌苗本身特点有关(见附图2(a)、(b)、(c))。2).经皮下注射免疫调节前后小鼠血清中特异性抗体滴度的动态变化(见附图3(a)、(b)、(c))。小鼠经最后一次皮下注射免疫调节后第一周，对于血清中特异性抗福氏2a志贺氏菌的抗体IgG，分叉双歧杆菌组、嗜酸乳杆菌组、E.coliX511组、分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌组和分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511组，对初次免疫后小鼠的免疫增强作用，经单因素方差分析，和对照组即生理盐水组之间比较，均存在着显著性差异(P＝0.0000，＜0.05)。对于血清中特异性抗痢疾I型志贺氏菌的抗体IgG，与血清中特异性抗福氏2a志贺氏菌的抗体IgG相同，分叉双歧杆菌组、嗜酸乳杆菌组、E.coliX511组、分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌组和分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511组，对初次免疫后小鼠的免疫增强作用，与对照组比较，也均存在着显著性差异(P＝0.0000，＜0.05)。特异性抗体IgM、IgA的结果与抗体IgG类似。值得注意的是，E.coliX511组和分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX51组，可能因为具有刺激特异性免疫记忆的作用，其特异性抗体滴度较其它组别为高。3).经皮下注射免疫调节后可提高初次免疫小鼠对志贺氏菌野生型毒株攻击的保护作用。分别给予分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、E.coliX511以及分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌、分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511进行免疫调节，在最后一次皮下注射免疫调节后的第14天，用野生毒株福氏2a志贺氏菌301和痢疾I型志贺氏菌112分别腹腔攻击免疫调节后的小鼠。分叉双歧杆菌组、嗜酸乳杆菌组、E.coliX511组和分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌组及分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511组，对小鼠以234LD50(LD50＝2.2388×105CFU)的野生型毒株福氏2a志贺氏菌301和184LD50(LD50＝2.9535×105CFU)的野生型毒株痢疾I型志贺氏菌112分别攻击的保护，与对照组比较，均具有显著性差异(P＜0.05)。结果表明，尽管抗体滴度有高有底，但是保护效果趋于一致。分叉双歧杆菌和嗜酸乳杆菌可将其非特异性免疫保护作用，用于特异性保护力的提高，采用这种免疫策略，非特异性免疫保护和特异性免疫保护可实现有机结合，达到最佳的保护效果(见附表5)。2.口服分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511及其不同的组合，可提高经口服初次免疫小鼠肠道的特异性抗体IgA滴度。口服分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511及其不同的组合前后小鼠粪便、血清中特异性抗体的动态变化(见附图4-9)。口服分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511及其不同的组合，对经口服初次免疫小鼠粪便中抗福氏2a志贺氏菌和抗痢疾I型志贺氏菌的抗体IgG、IgM无显著增强作用；口服分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511及其不同的组合，程度不一地提高了经口服初次免疫小鼠粪便的特异性抗福氏2a志贺氏菌和抗痢疾I型志贺氏菌的抗体IgA水平，分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌组和分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511组，与E.coliX511组的峰值相当；分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和E.coliX511及其不同的组合，对经口服初次免疫小鼠血清中抗福氏2a志贺氏菌和抗痢疾I型志贺氏菌的抗体IgG、IgM有一定的增强作用。本发明的积极效果是，采用该免疫策略，不仅能提高机体的特异性免疫水平和保护力，而且安全可靠，对利用疫(菌)苗或在自然感染群体中预防和控制传染病方面，具有很大的使用价值和商业价值，应用前景广阔。附表5.皮下注射初次免疫的小鼠经同途径免疫调节后对小鼠的保护效果初次免疫菌株免疫调节菌株攻击菌株攻击菌量死亡数生存数P值*福氏2a志贺氏菌301234LD50128＜0.05DOM3分叉双歧杆菌痢疾I型志贺氏菌112184LD50164＜0.05福氏2a志贺氏菌301234LD50155＜0.05DOM3嗜酸乳杆菌痢疾I型志贺氏菌112184LD50155＜0.05福氏2a志贺氏菌301234LD50128＜0.05DOM3E.coliX511痢疾I型志贺氏菌112184LD50812＜0.05福氏2a志贺氏菌301234LD50128＜0.05DOM3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌痢疾I型志贺氏菌112184LD50146＜0.05福氏2a志贺氏菌301234LD50128＜0.05DOM3分叉双歧杆菌+嗜酸乳杆菌+E.coliX511痢疾I型志贺氏菌112184LD50812＜0.05福氏2a志贺氏菌30234LD50200DOM3生理盐水痢疾I型志贺氏菌112184LD50200*与生理盐水组X2检验。附图1-益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌提高初次免疫机体特异性抗体滴度示意图其中-初次免疫-益生菌调节免疫附图2-经皮下注射初次免疫小鼠血清中特异性抗体滴度动态变化图其中(a)-IgG滴度动态变化(b)-IgM滴度动态变化(c)-IgA滴度动态变化。<p>表33</tables>从表33中记载的结果可知，含有抑制诱发牙周疾病的1L-1β和前列腺素的生成及过氧化物、可抑制分解牙周组织的胶原酶酯素活性的牛膝提取物，和或含有促进胶原合成、抑制胶原酶活性的榆白皮提取物的本发明软膏(实施例2-1～2-12)的牙周疾病治疗效果，从1周到1个月，比不含有牛膝或榆白皮的比较例(2-11～2-18)，显示出优良的效能，比较例的齿龈炎指数，1个月以后，随着时间的延长不断上升，反之，使用根据本发明研制的软膏时，抑制牙周疾病发生的IDOM3组；IIDOM3+E.coliX511组；IIIDOM3+嗜酸乳杆菌组；IVDOM3+分叉双歧杆菌组；VDOM3+嗜酸乳杆菌+分叉双歧杆菌组；VIDOM3+嗜酸乳杆菌组+分叉双歧杆菌+E.coliX511组；VIINAHCO3对照组；VIII空白对照组。附图7-经口服免疫调节前后小鼠血清中特异性抗体滴度动态变化图其中(a)-抗痢嫉I型志贺氏菌抗体IgG的变化；(b)-抗福氏2a志贺氏菌抗体IgG的变化。IDOM3组；IIDOM3+E.coliX511组；IIIDOM3+嗜酸乳杆菌组；IVDOM3+分叉双歧杆菌组；VDOM3+嗜酸乳杆菌+分叉双歧杆菌组；VIDOM3+嗜酸乳杆菌组+分叉双歧杆菌+E.coliX511组；VIINAHCO3对照组；VIII空白对照组。附图8-经口服免疫调节前后小鼠血清中特异性抗体滴度动态变化图其中(a)-抗痢嫉I型志贺氏菌抗体IgM的变化；(b)-抗福氏2a志贺氏菌抗体IgM的变化。IDOM3组；IIDOM3+E.coliX511组；IIIDOM3+嗜酸乳杆菌组；IVDOM3+分叉双歧杆菌组；VDOM3+嗜酸乳杆菌+分叉双歧杆菌组；VIDOM3+嗜酸乳杆菌组+分叉双歧杆菌+E.coliX511组；VIINAHCO3对照组；VIII空白对照组。附图9-经口服免疫调节前后小鼠血清中特异性抗体滴度动态变化图其中(a)-抗痢疾I型志贺氏菌抗体IgA的变化；(b)-抗福氏2a志贺氏菌抗体IgA的变化。IDOM3组；IIDOM3+E.coliX511组；IIIDOM3+嗜酸乳杆菌组IVDOM3+分叉双歧杆菌组；VDOM3+嗜酸乳杆菌+分叉双歧杆菌组；VIDOM3+嗜酸乳杆菌组+分叉双歧杆菌+E.coliX511组；VIINAHCO3对照组；VIII空白对照组。权利要求1.益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用，其特征是对机体通过皮下注射和口服途径进行初次免疫，或自然感染获得初次免疫，经过一定时间后，按与初次免疫相同的途径，分别给予益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫(菌)苗保护性抗原基因的大肠杆菌及其不同的组合，对初次免疫的机体进行免疫调节，以提高机体的特异性免疫水平和保护力。2.按照权利要求1所述的益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用，其特征是制备疫(菌)苗，对机体经皮下注射和口服途径进行初次免疫，或自然感染获得初次免疫。3按照权利要求1和2所述的益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用，其特征是在初次免疫或自然感染获得初次免疫一定时间后，制备益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫(菌)苗保护性抗原基因的大肠杆，按与初次免疫相同的途径，分别给予益生菌如分叉双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达疫(菌)苗保护性抗原基因的大肠杆及其不同的组合，对初次免疫的机体进行免疫调节。4.按照权利要求1，2和3所述的益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用，其特征是采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测经益生菌免疫调节后机体的血清和粪便中的特异性抗体IgG、IgM和IgA水平。5.按照权利要求1，2和3所述的益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用，其特征是对经益生菌免疫调节后的机体，以野生型毒株攻击，观察其保护效果。全文摘要本发明涉及益生菌在提高机体特异性免疫力及疫(菌)苗发展中的应用,对经疫(菌)苗皮下注射和口服途径初次免疫或自然感染获得初次免疫的机体,经一定时间后,采用益生菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和表达保护性抗原基因的大肠杆菌,分别和以其不同组合,按与初次免疫相同途径进行免疫调节,以提高机体特异性免疫水平和保护力,结果与对照组比较,具有显著性差异(P<0.05),该免疫策略安全可靠,在利用疫(菌)苗或在自然感染群体中预防和控制传染病方面有很大使用价值和广阔应用前景。文档编号A61K39/02GK1186696SQ9712584公开日1998年7月8日申请日期1997年12月25日优先权日1997年12月25日发明者徐建国,林纪胜,蓝景刚申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所