专利名称：：治疗人黄斑变性的纯玉米黄质3r－3'r立体异构体的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于生物化学领域，它涉及称为玉米黄质(缩写为ZX)的一种黄色色素的某种异构体。如果作为药物或维生素给人施用，则该色素可治疗或预防一种能损坏视网膜而引起失明、被称为黄斑变性的疾病。视网膜是一种连接眼球背面的组织。视网膜很复杂，它包括12层不同的层。在很多医学教材中对它描述和阐释过，例如Gittinger1988，和Vaughn和Asbury1992(后面列出了所有引文)。视网膜中部有一个称为视网膜黄斑的特殊圆形区，它在人眼中直径约为1-1.5毫米。该黄斑有两个特征使它有别于视网膜的其它部分。首先，该黄斑含有较少的视网膜杆；它的感光器大多数呈圆锥形(在凹部即黄斑的正中心，根本就没有视网膜杆)。其次，该黄斑明显呈黄色，这是由称为黄体素和玉米黄质的两种色素引起的。两种色素都属于称为“类胡萝卜素”的一类分子。在概述黄斑变性之后，下文将讨论这些类胡萝卜素色素的化学性质。黄斑变性“黄斑变性”是指涉及逐渐损伤视网膜细胞或视网膜中心黄斑区内感光锥体的任意疾病。论文和教科书例如Taylor1993、Gittinger1988和Vaughan和Asbury1992中对它描述和阐释过。有数种黄斑变性。最常见的一种称为“年龄相关性黄斑变性”，通常缩写为AMD(某些文献中为ARMD)。AMD能损坏视力，程度从轻度降低视力至完全失明。有两种AMD，常称为“湿”形和“干”形。湿形涉及在视网膜内进攻性生长毛细血管和其它血管，直至血管干扰和破坏视网膜层的正常组织。尽管有时可利用激光隔离新形成的血管来治疗这种AMD，但激光疗法只能暂时延迟血管生长，它通常不能防止最终基本上丧失全部视力；湿形AMD几乎总是导致最终完全失明或接近完全失明。患AMD的患者中大约只有5-10％的人患有湿形AMD。另一种AMD称为“干”形AMD。由于至少有90％的AMD属于这种类型，所以通常也就将它简称为AMD。虽然这种AMD通常不会引起完全失明，但它能严重损伤患者的视力，致使患者不能认识或鉴别熟悉物体如朋友或亲戚的面孔。于是，它常会导致机能性失明，使得人们不能在公共场所安全地驾车或行走，不能进行正常活动。还有多种疾病涉及黄斑变性症状，这些疾病包括Stargardt病、Best病、Batten病、Sjogren-Larsson综合征、视网膜锥-杆营养不良和羊蜡样脂褐质沉积症。描述这些疾病的论文引用于Dorey等1993中。此外，涉及溶酶体贮存问题(例如家族性黑蒙性白痴)或渐进性神经细胞变性(如阿尔茨海默氏病)的其它疾病也与黄斑变性有关。这些疾病中有很多具有遗传成分，这已由遗传证实；已分离出引起这些疾病的一些基因，并且遗传筛查试验可指示一个人是否具有缺损基因。遗传试验或家族史证明，携带或很可能携带这种基因的人患黄斑变性的危险性较高。通过慢慢地夺去人们的视力，AMD使它的受害者们遭受极大的痛苦。它每年耗费亿万美元，既包括生产率的损耗，也包括对于必须为患有失明或视力受严重损害的人们提供或帮助支付医疗保健费用和其它帮助的家庭成员、保险机构、社会团体和其它单位造成的沉重负担。鉴于AMD引起的这些问题，科学家和医师们数十年来一直在探索治疗或预防由黄斑变性引起的失明和其它视力降低的方法。然而，尽管努力了半个多世纪，但迄今未获有效的疗法。诊断脉络膜小疣和脂褐质黄斑变性通常由特殊的视网膜照片来诊断。在一种诊断方法中，医师对患者注射荧光标记药物，让药物循环流经患者全身，然后拍摄视网膜的放大照片，称为血管造影照片。医师分析该照片以确定两种细胞碎片中一种或两种的存在与否和浓度。已知的并研究了数十年的一种细胞碎片称为脉络膜小疣。它分为两种不同形式。少量的硬脉络膜小疣(直径小于63微米的小颗粒)通常存在于40岁以上的人眼内。除非存在量反常，硬脉络膜小疣不表示视网膜损伤。反之，大量的更大软脉络膜小疣沉积物(也称为湿脉络膜小疣)表示发生或出现了明显视网膜损伤，因为软脉络膜小疣大斑点能破坏和瓦解视网膜层，并阻止视网膜细胞吸收血液中的正常营养物质。视网膜中含有大量软脉络膜小疣的患者常称为患有黄斑变性。患黄斑变性的患者中常见的另一种视网膜碎片称为脂褐质。直到最近才明了脂褐质与AMD之间的关系(例如，Weiter等1988，和Dorey等，1993)。类胡萝卡素化学“类胡萝卜素”包括一大类分子；业已鉴定了600种以上类胡萝卜素的性质。这些分子具有一些特征，包括1.类胡萝卜素是由5个碳原子的分子即异戊二烯偶合而生成的。由于结构单元含有5个碳原子，所以多数类胡萝卜素包含5个碳原子的倍数。2.类胡萝卜素具有多重不饱和键。这使它们能吸收光谱的蓝色和近紫外区内高能光波。3.由于类胡萝卜素吸收蓝色和近紫外光谱区中的波长，不吸收其它光谱区中更长的波长，所以类胡萝卜素通常呈黄色、橙色、棕色或红色。“类胡萝卜素”这一名称来自胡萝卜；最先知道的类胡萝卜素被鉴定为使胡萝卜显橙色的色素。类胡萝卜素在溶液中引起的颜色由多种因素决定，包括浓度和存在的其它化学物质。4.类胡萝卜素具有“共轭”双键。这表明双键与单键交替存在，所以链中每个碳原子与另一个碳原子形成双键，但没有碳原子与另外两个碳原子同时形成双键。对于这种排列的理解可参考图1，该图中示出了β-胡萝卜素、ZX和黄体素的结构。不同类胡萝卜素的共轭程度不同，共轭程度更高的分子通常提供更好的保护作用以抗高能光辐射所致的“光毒”损害。例如，图1中所示的3种类胡萝卜素，每一分子的整个直链部分都是共轭结构，具有交替的双键和单键。在β-胡萝卜素和ZX的分子中，共轭结构延续至两个端环上的第一个键。但黄体素的共轭程度更低，因为它的端环之一上的双键未形成完全共轭结构的正确排列。ZX和黄体素的唯一差别在于一个(而不是两个)端环上双键的位置。由于(通过进化)设计和选择类胡萝卜素吸收蓝光和近紫外光可能有害的能量，所以实际上它们被用作防护色素。它们在植物中广泛存在，因为植物的主要目的之一是尽可能多地吸收阳光，同时将由蓝光辐射、紫外线辐射和近紫外线辐射引起的细胞损伤减至最小。紫外线辐射对植物的损坏是一个严重问题，而类胡萝卜素有助于使它减至最小。由于类胡萝卜素相当适合于防止光毒损害，所以动物也已(通过进化)获得了利用类胡萝卜素作为光防护色素的方法。由于动物自体不能合成类胡萝卜素，所以它们必须消化来自植物源的类胡萝卜素(或类胡萝卜素前体)。β-胡萝卜素就是一个例子；哺乳动物必须从植物或从肉类获取它。一旦进入哺乳动物体内，β-胡萝卜素就被转化为其它分子形式，包括维生素A(视黄醇)，它是通过将β-胡萝卜素裂解为两半而形成的。类胡萝卜素可分为两大类胡萝卜素和叶黄素。胡萝卜素不含任何氧；它们是纯粹的烃类，只由碳和氢构成。而叶黄素(如ZX和黄体素)还含有氧。图1示出了ZX的左、右端环上碳原子的编号。一般将左端环上的碳原子从1至6编号，而右端环上的碳原子被称为“撇”号数，例如3’碳(发音为“三撇”)。由于ZX的左、右端是完全对称的，所以术语“左”和“右”仅仅是习惯说法以便于讨论。但是应注意，黄体素是非对称的；“左”环上的双键位置与“右”环上的双键位置不同。由于ZX是通过在β-胡萝卜素分子两端的#3碳原子上连接两个羟基而形成的，所以它的化学名称为3，3′-二羟基-β-β-胡萝卜素；一些化学家将它称为胡萝卜素-二醇。该分子被命名为“玉米黄质”“zeaxanthin”是因为它最早被鉴定为使玉米呈黄色的色素，而玉米的学名是Zeamavs。如前所述，自然界中已鉴定出600种以上的类胡萝卜素。有几十种在生物化学和商业上很重要。ZX和黄体素在本发明中尤为重要，因为它们存在于哺乳动物和大多数其它动物的视网膜中。黄体素在商业上很重要，因为它(以植物提取物的形式，主要得自金盏花)被普遍喂食给鸡，而使鸡皮肤和蛋黄的颜色更黄，从而吸引销售商和消费者。ZX可具有相同效果并且比黄体素效力更大，但ZX资源太贵而不能用作家禽饲料。美国专利5,308,759和5,427,783(由Gierhart转让给AppliedFoodBiotechnology，Inc，该公司是此处的受让人和申请人)旨在论述ZX太贵不能用作动物饲料的问题。这些专利涉及利用细菌在商业规模上生产ZX，使它可给家禽和鱼喂食。除了植物外，一些类胡萝卜素还由某些细菌合成。这些细菌是在直接受太阳光曝晒的场所进化而成的，所以它们的类胡萝卜素与植物中的一样起相同的光防护作用。描述得自细菌的类胡萝卜素的文献包括McDermott等1972，美国专利5,429,939(Misawa等1995)，和那些参考文献中引用的其它论文。美国专利5,429,939(Misawa等1995)列出了编码生物合成包括ZX在内的各种类胡萝卜素时涉及的酶的一些基因的DNA序列。还描述了在生成ZX中各主要基因(包括crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ)的作用。包含带有这些基因的质粒的细胞保藏于美国典型培养物保藏中心(例如噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)ATCC19321和草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC39368)，和日本发酵研究所(例如，大肠杆菌(E.Coli)FERMBP2377)。玉米黄质立体化学和异构体类胡萝卜素化学的一个重要方面包括“立体化学”和“立体异构体”)。该标题在任何大学有机化学课本中均有阐释。只要有机分子中某个碳原子连有4种不同的原子或分子基团，则该碳原子被称为“手性”碳原子。当某有机分子中存在一个手性碳原子时，则与手性碳原子键连的4个不同基团可按两种排列方式之一排列。这两种不同的排列方式称为立体异构体。这两种立体异构体中之一将使偏振光“向右”偏转，而另一种立体异构体将使偏振光“向左”偏转。引起向右偏转的异构体称为R型立体异构体(也称为D型立体异构体)。引起向左偏转的异构体称为S型立体异构体(也称为L型立体异构体)。由于ZX中的#3和#3’碳原子都有手性，所以它有4种可能的立体异构体。在3R-3’R异构体中，#3和#3’碳原子都具有R构型。在3S-3’S异构体中，#3和#3’碳原子都具有L构型。为方便起见，本文将这两种立体异构体称为R-R异构体和S-S异构体。第三种和第四种异构体是两种“混合的”或“内消旋”(一个R和一个S)异构体3R-3’S异构体和3S-3’R异构体。由于ZX是关于中点完全对称的，所以这两种异构体在各方面都相同；如果将3R-3’S异构体画在纸上，则旋转纸会使它变成3S-3’R异构体。实际上，一个“内消旋”异构体是由S-R和R-S异构体二者组成的。如果采用标准的化学合成方法制备ZX，则这4种可能的异构体每种均占总量的大约25％。然而，由于S-R和R-S异构体其实是相同的，所以它们的“内消旋”异构体将占总量的50％，而R-R和S-S异构体大约各占25％。所有这三种立体异构体的混合物称为“外消旋”混合物。然而，类胡萝卜素在视网膜组织中的细胞和酶特异性极其精确，且不同的异构体或立体异构体不能互换。虽然在惯常的化学术语中可将黄体素和ZX看作彼此的异构体(因为它们具有相同数量的碳原子、氢原子和氧原子)，但视网膜细胞将它们当作完全不同的和性质截然不同的分子。由于生物学因素的缘故，适合于本文的唯一异构体为立体异构体。本文提到的玉米黄质的“异构体”都表示ZX的具体立体异构体，而不包括黄体素。黄体素和ZX被当成完全不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素中可能出现的小的、微细的和轻微的立体异构差异实际上都对视网膜组织极为重要。显然，能被人视网膜细胞正常吸收和利用的ZX立体异构体只有R-R异构体(即3R-3’R立体异构体)。据报道，业已在视网膜组织中发现微量的ZX的内消旋(R-S)异构体。然而，这些微量物可能是由于在一定条件下自发进行的某些分子转化作用，致使从黄体素前体形成内消旋-玉米黄质(Bone等1993和1994)。在实验室中，ZX的立体异构体可通过例如手性柱色谱法(Bone等1993)或圆二色性分析法(Britton1994)的方法来相互区分。黄斑中的玉米黄质和黄体素早在1970年，人们就已熟知类胡萝卜素在保护植物避免光毒损坏中的作用。人们还知道动物组织中存在类胡萝卜素，和动物的所有类胡萝卜素都源自植物，因为动物不能合成类胡萝卜素。基于这些信息，许多文章指出了动物和植物中类胡萝卜素之间的相似性，并总结出类胡萝卜素在动物体内起保护作用避免光毒损伤。认识了类胡萝卜素在动物体内的光防护性作用之后，研究人员开始研究类胡萝卜素在视网膜中的化学性质和作用。一组实验包括的测试中对实验动物喂不合任何类胡萝卜素的食物，这类食物由不含类胡萝卜素的谷物或籽(如买罗高粱籽)制备。结果表明，丧失类胡萝卜素的实验动物视网膜中未生长任何黄斑区，且这些视网膜中含有异常高含量的软脉络膜小疣，表示视网膜已受损害(Malinow等1980，Kirschfeld1982，Ham等1984，和Snodderly等1984)。鉴于这些发现，研究人员认为类胡萝卜素似乎对健康的视网膜至关重要。这些研究人员当时一直在为常识即胡萝卜和叶多的绿蔬菜对眼有好处搜集分子角度的证据。然而，科学家们尚不知黄斑中的黄色色素是否以最终形式吸收，或者它们是否可在动物体内用其它前体如β-胡萝卜素或番茄红素而合成。在1949年把黄体素鉴定为黄斑中黄色色素之一(Wald1949)。直到多年后才将ZX鉴定为另一种黄斑色素(Bone等1985)。至八十年代中期或晚期归纳了关于黄斑色素的已知信息的论文包括Handelman和Dratz1986，Werner等1987，Pease等1987，Haegerstrom-Portnoy1988，和Handelman等1988。这些论文特别证实，ZX(它是充分共轭的，因而它多少比黄体素提供更好的保护作用以抗光能引起的损伤)是在凹部即黄斑正中心的小区内主要的色素。同心地离开凹部而向黄斑的外周边靠近，则ZX的量逐渐减少，而黄体素的量随之渐增，所以在黄斑外围，黄体素是主要的黄色色素。更近期的文献阐述了视网膜老化和损伤的各方面，且尤其集中于在视网膜中作为防护剂的类胡萝卜素，这类文献包括Sperduto等1990，Gerster1991，Schalch1992，和Seddon等1994。总之，十余年前人们就已知黄体素和ZX是黄斑中的两种色素，且科学家们在十多年前就预测到这些色素能帮助保护黄斑以抗光毒损伤。然而，尽管10多年前就有这些发现和建议，但还没有人开发出能明显有效地预防或阻止(更不用说逆转)逐渐加重的黄斑变性的任何药物、任何营养的或饮食的辅助剂或其它形式的疗法。需要对前面的话语需稍作限定，因为已知β-胡萝卜素、维生素A和维生素E对于保护视网膜组织有一定程度的有益效果(例如参见，美国专利5,310,764，Baranowitz等1994，和下面引用的由theEyeDiseaseCaseControlStudyGroup撰写的两篇论文)。这些专利和论文声称或建议，β-胡萝卜素、维生素A和维生素E对于预防或减轻与黄斑变性相关的损坏作用具有可测到的效果。这种说法可能正确，因为类胡萝卜素、维生素A和维生素E一般可起抗氧化剂作用。但遗憾的是，β-胡萝卜素、维生素A和维生素E带给视网膜的益处相当有限，且不能达到有效治疗的程度。实际上，黄斑变性都是不可预防的、不可阻止的和不可逆转的。任何广谱抗氧化剂(如β-胡萝卜素、维生素A和维生素E)都只能达到治标程度。由于未能达到真正的效果，所以业已应用那些维生素(获得极为有限的和不理想的成功)试图减缓黄斑变性引起的严酷损伤。根据现有技术，还应注意很多保健食品店销售的类胡萝卜素制品标示为有益于眼睛和视力。那种对于类胡萝卜素混合物的标称可能有道理，因为(如前所述)已知β-胡萝卜素和维生素A适用作一般的抗氧化剂。但是，可商购的类胡萝卜素混合物都不含甚至是微量的ZX。保健食品店销售的类胡萝卜素混合物中绝大部分类胡萝卜素都是非玉米黄质的类胡萝卜素(主要是β-胡萝卜素和维生素A)。几个重要的管理机构和研究联合体的主张和研究目标也值得认真关注。在美国，theNationalInstituteofHealth(通过theNationalEyeInstitute(NEI)和theNationalAdvisoryEyeCouncil起作用)最近发表了两篇报道，即“VisionResearchANationalPlan1994-1998，”NIHPublicationNo.93-3186(1994；具体见pp.55-65)，和“Agerelatedeyediseasestudy，”NIHPublication93-2910(1993)。两篇报道和他们描述的研究工作都集中于认为β-胡萝卜素(而不是ZX)是治疗AMD最有前途的化合物。就申请人所知和所信，在与NEI的官员们探讨了本主题后，NEI和隶属于theNationalInstituteofHealth的其它机构都不愿资助或者最近尚未资助有关玉米黄质有可能治疗AMD的研究。反之，NIH和其它靠税款资助的机构拨给数百万美元以资助关于β-胡萝卜素作为治疗或预防AMD最有前途的候选物质的研究。应仔细关注的其它主要研究人员属于“EyeDiseaseCaseControlStudyGroup”。该研究小组近期发表了如下两篇论文“Antioxidantstatusandneovascularage-relatedmaculardegeneration，”Arch.Ophthalmol.11104-109(1993)和“Riskfactorsforneovascularage-relatedmaculardegeneration，”Arch.Ophthalmol.101701-1708(1992)。同NIH的正式报道一样，这两篇论文均未启示或建议将玉米黄质作为药物用于治疗AMD，且该联合组织也拒绝资助任何关于ZX作为治疗或预防AMD的可能物质的研究。还应注意，在将类胡萝卜素用于治疗或预防癌(起始于Peto等1981)和用于阻止胆固醇形成和减少在动脉内沉积的斑块(Jialal等1991)方面引起很多关注。有大量科学文献涉及不同活性的类胡萝卜素，且对于化学合成包括黄体素和ZX的类胡萝卜素的方法存在着浓厚兴趣。然而，不管过去数十年中所有对类胡萝卜素的研究和合成方面的努力怎样，迄今尚未见报道治疗或预防黄斑变性的任何有效方法。鉴于黄斑变性给受害者们和社会造成的巨大费用和痛苦，必须指出，这是一个严重问题。因此，本发明可能是一项重大突破，它提供如下两项(1)安全而有效的药物，用于治疗被诊断为患有黄斑变性的患者，和(2)可与维生素九相比的营养辅剂，任何到了或过了中年、可能患有黄斑变性的男士或女士想要减小疾病危险性的话均可服用它。黄体素和玉米黄质的合成现有技术现有技术中很多项目描述了制备ZX的方法。这些项目可分为两类发酵法，其中微生物在制备过程中起关键作用；和非发酵合成法，其中应用纯粹的化学反应。现有技术有很多项目建议ZX应当用于已知用途，例如家禽饲料或鱼饲料中的添加剂，使肉的颜色变深使之更具吸引力。显然，这些尝试均未导致任何在商业规模上的生产或销售ZX。在1995年10月，购买纯化形式或半浓缩形式的ZX(其中ZX含量约在5wt％以上)的唯一途径需要从专门的化学公司例如AtomergicChemicalsCorporation(Farmingdale，NY)或SpectrumChemicalManufacturingCompany(Gardena，CA)购买毫克量的ZX。1995年这些专业制造商的纯ZX(为含有不需要的S-S和S-R异构体的合成外消旋混合物形式)，价格为每毫克约$90-约$125。换算成每克ZX(外消旋混合物形式)约$100,000(以美国货币表示)。显然，这些制剂在用作药物或营养辅剂方面没有现实可能性，不仅因为它们价格高昂，还因为它们含有大量不需要的和可能有害的S-S和内消旋异构体。在本发明之前，公众根本得不到任何形式的纯化或半纯化的R-R玉米黄质。描述利用微生物发酵法生产ZX的现有技术项目包括(1)Courington和Goodwin1955，已知这是描述由得自黄杆菌属(Flavobacter)的细菌生产ZX的最早文献。(2)美国专利3,891,504(Schocher和Wiss，1975，转让给HoffmanLaRoche)，也描述了由黄杆菌属细胞生产ZX。将这类含有ZX的细胞喂给鸡之后，引起了适度着色。(3)美国专利3,841,967(Dasek等，1974)和美国专利3,951,743(Shepherd等，1976)。它们均转让给Nestle。这些专利描述了可用于提高细菌生产的ZX量的方法和营养物。(4)更近期的美国专利(US5,308,759和5,427,783，均由Gierhart发明)，转让给AppliedFoodBiotechnology，Inc.，与本文相同的受让人与申请人。这些专利描述了从密苏里河分离的细菌菌株(多食黄杆菌(Flavobacteriummultivorum))。发现这些细菌可产生ZX而不会产生大量其它类胡萝卜素。这对于本文提及的家禽和鱼很重要，其中对家禽和鱼喂食可使肉和蛋黄颜色更深；因为被动物食用后，摄入血流时类胡萝卜素之间相互竞争。因此，由Gierhart鉴定的多食黄杆菌菌株中没有其它类胡萝卜素，就可使动物组织获得更多的作为色素的ZX，于是就会提高它的效力和性能。’759专利要求了生产用于家禽或鱼饲料的ZX的方法，用到AFB的多食黄杆菌。分案即’783专利，要求了饲料混合物。这两件专利都限于将ZX用于家禽饲料或鱼饲料，且都未提及将ZX用于医治人的任何信息。Gierhart的两件专利均未述及有关ZX的具体立体异构体，原因有二(1)当1989年提出这些申请时，还不知道由AFB的多食黄杆菌细胞产生的ZX立体异构体情况，和(2)由于这些专利只涉及生产用于家禽饲料或鱼饲料的ZX，所以没有明显理由涉及不同的立体异构体。AFB的野生型菌株多食黄杆菌保藏于ATCC，并获得ATCC登记号为55238。由于这些细菌产生一种称为鞘脂的脂质，所以ATCC将这类细菌重新归类为多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorum)，并在它们的目录中该名下列出了这些细胞。ATCC目录中的鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)名尚未出现于被视为微生物分类学正式指南的下列参考著作中Bergy’sManualofSystematicBacteriology，它由InternationalJournalofSystematicBacteriology增补和修订。在过去20年中报道了由标准化学合成法(未应用微生物)制备ZX，包括美国专利4,153,615(Saucy1979)，4,952,716(Lukac等1990)，和5,227,507(Lukac等1993)。然而，这些方法存在严重的缺点。它们通常需要很多反应步骤，且每步的产率小于100％，所以多步操作最后的ZX终产率相当小。此外，化学合成一般生成不需要的ZX的S-S和S-R立体异构体，还有各种转化或降解产物如氧化的玉米黄质，和在直链部分和/或端环上失去一个或多个双键的玉米黄质分子。总之，在本发明之前，还没有作为药物或营养辅剂适合人们消费的纯化过的R-R玉米黄质的已知资源。因此，本发明的一个目的是公开AFB的多食黄杆菌菌株(ATCC登记号为55238)及其诱变子代能产生作为单一可检测异构体的ZX的R-R立体异构体，而不产生可检测量的、不需要的S-S或S-R立体异构体。本发明的另一个目的是公开应用AFB的多金黄杆菌菌株(ATCC登记号为55238)的子代细胞来制备药剂的方法，该药剂用于治疗业已诊断为患有黄斑变性、特别是年龄相关性黄斑变性的患者。本发明的又一个目的是公开应用AFB的多食黄杆菌菌株(ATCC登记号为55238)的子代细胞来制备供人服用的营养辅剂的方法，该营养辅剂的形式可与维生素丸相比，或作为如人造黄油的食品中的添加剂，用于减小生命晚期黄斑变性的危害。本发明的第三个目的是公开含有作为单独或最主要异构体的R-R立体异构体的玉米黄质制剂，这类制剂呈适于人口服的调和物形式，可作为药物以治疗视网膜疾病或变性，或者作为营养辅剂以减小老人们视力衰退的危害。下列对本发明的概述和描述将使这些和其它目的更为明显。本发明公开了制备玉米黄质的方法，该玉米黄质含有作为单独可检测的或最重要的异构体的玉米黄质3R-3’R立体异构体(也称为R-R异构体，或R-R玉米黄质)，它作为药物或营养辅剂供人吸收。ZX是人视网膜黄斑细胞中的一种黄色色素，能吸收蓝光和近紫外光辐射，因而能保护视网膜以抗光毒损伤。只含有所需的R-R异构体的ZX制剂是由多食黄杆菌细胞株(ATCC登记号为55238)产生的。这些细菌不产生任何可检测量的不需要的S-S或S-R立体异构体；并且它们不合成大量的其它类胡萝卜素如β-胡萝卜素或黄体素，口服后这些类胡萝卜素可与ZX竞争消化摄取。应用这类细菌合成之后，ZX可由例如溶剂提取的方法纯化，并可口服，可作为患有黄斑变性患者的治疗药物，也可作为营养辅剂供想要减小患年龄相关性黄斑变性的危险性的人们服用(年龄约为50或60岁的人普遍会患年龄相关性黄斑变性)。还公开了便于吸收的调和物，例如(1)含有与例如植物油的载体混合的R-R玉米黄质的水密胶囊；(2)含有作为添加剂的R-R玉米黄质的各种食品(例如人造黄油、乳制品、糖浆、制曲奇饼干面团和未猛烈烧烤过的肉制品)，和(3)可加入汤、色拉、饮料或其它食品的粒状调和物。图1描绘了β-胡萝卜素、黄体素和玉米黄质的分子结构，示出了这三种类胡萝卜素的结构和端环的编号系统。这些结构是现有技术中已知的。图2包括的流程图描述了由微生物生产ZX的发酵和纯化步骤，其中合成立体异构纯的3R-3’R玉米黄质。本发明公开了制备药物或营养调和物的方法，其中的药物或营养调和物供人服用以预防或减轻黄斑变性，该病会损坏视力和引起失明。供人吸收的玉米黄质制剂应含有作为“最主要”异构体的ZX的3R-3’R立体异构体(为方便起见，也称为R-R异构体，或R-R玉米黄质)。此处定义的“最主要的异构体”表示至少含有90％或更多的R-R异构体的制剂，其中包括的不需要的S-S或S-R异构体占制剂中所有玉米黄质的10％以下。任何供人用的制剂应优选包含作为单独可检测异构体的ZX的R-R异构体，其中不含可检测量的不需要的S-S或S-R异构体。本文公开了这类制剂。近期，采用手性柱色谱分析法(如Bone等，1993年所述)已发现，当按实施例中所述方法发酵时，由AppliedFoodBiotechnology(AFB)分离的多食黄杆菌菌株(ATCC登记号为55238)产生作为单独可检测ZX异构体的R-R异构体。如实施例4中所述，Landrum教授的分析表明，由发酵得自多食黄杆菌菌株的细胞产生的ZX制剂中没有可检测量的S-S异构体或R-S内消旋异构体。如果让人服用作为药物或营养辅剂的ZX制剂，则玉米黄质的R-R、R-S或S-S异构体的差异相当重要，因为天然存在于人视网膜中的ZX异构体只有R-R异构体。据认为，从医药角度来看，吸收大量的R-S和S-S异构体将是很不希望的和危险的，因为(1)人视网中没有天然存在的R-S和S-S异构体，只是当黄体素在视网膜细胞内降解时可能形成作为副产物的极微量这两种异构体，和(2)R-S和S-S异构体会竞争替换视网膜组织中所需的R-R异构体，可能导致严重的长期细胞损伤和医学并发症。本文公开的由多食黄杆菌发酵制备的ZX制剂立体异构纯度极有价值，因为化学合成ZX之后分离立体异构体特别难且费用昂贵。虽然在小规模的实验装置中有可能分离立体异构体，但在商业化规模中分离费用却特别高。用作治疗AMD患者的处方药物在本发明的第一方面中，本文公开的R-R玉米黄质制剂可作为药物调制和服用，即作为可由医师开处方的药剂，用于治疗业已诊断为患有黄斑变性，或患有能引起以黄斑变性为症状或表现的疾病的患者，例如Stargardt病、Best病、Batten病、Sjogren-Larsson综合征、视网膜锥-杆营养不良、羊蜡样脂褐质沉积症，或溶酶体贮存病例如家族性黑蒙性自痴。当用于这类治疗时，ZX制剂必须具有足够量ZX的R-R异构体以达到治疗剂的含量，如下文所述，该治疗剂处于可供人服用的载体物质或剂型(例如胶囊)中。在一个优选的实施方案中，用于药物治疗的ZX以单位剂量形式包装，例如胶囊或药片。每个剂量优选应至少包含约1毫克(mg)R-R玉米黄质，如果要求更佳疗效，还可包含约3mg-约10mg玉米黄质。在本发明的第二方面，本文公开的R-R玉米黄质制剂可作为预防药剂调制和供已诊断为对黄斑变性易感性高的患者服用，例如因为家族史或遗传诊断为上面列举的疾病的患者。供很可能会患AMD但实际上尚未患有AMD的患者服用而制备的单位剂量，可包含更少的量，例如每个剂量约0.1mg-约2mg。应用本文的公开说明，这些剂量均可以商业上合理的价格提供。含有25毫克(或更少的量)呈油状载体流体的胶囊可以经济的方式制备，其中采用微生物发酵和溶剂提取步骤相结合。如果运用更彻底的纯化如实施例4中所述方法，则可生产含量更高(例如每个剂量100毫克或更多)的粉状调和物。用作维生素或营养辅剂在本发明的第三个方面中，ZX可被制作成和包装成维生素或营养辅剂或食品添加剂的形式，供这种人消费，即他们目前未患黄斑变性，但希望在生命晚期减小患黄斑变性的可能性。用于这类目的吸收时，合适的剂量应为远远高于现今保健食品店中出售的粉状物中测得的痕量，但要少于当ZX作为治疗药物供已诊断为患有AMD的患者服用时的量。基于每天吸收的剂量，这种剂量可能在约0.05毫克至多达约5mg的范围内。例如，当R-R玉米黄质属于多种维生素胶囊或片剂中一打或更多种物质之一时，合适的剂量为0.05-1.0mg；但对于需要更高剂量的人们购买的不需处方但可合法出售的这类辅剂，剂量可以为1mg-5mg。不管是用作治疗药物还是营养辅剂，供人服用的ZX制剂应含有作为ZX的单独的或“最主要立体异构体”的R-R异构体。本文应用的术语“最主要的立体异构体”所描述的ZX制剂中所需的ZX的R-R异构体至少约占混合物中全部ZX的90％，而不需要的S-S或S-R异构体少于约10％。在任何供人吸收的制剂中，R-R异构体都应优选为唯一可检测到的ZX的异构体。本发明已在商业规模和合理价格上使这一条件切实可行，因为本文描述的多食黄杆菌细菌系产生的R-R异构体是唯一可检测到的ZX的立体异构体。如果纯化后发酵的混合物中存在任何S-S或S-R异构体，则它们的量少到按实施例4中所述方法测不出。此外，与大多数细菌菌株不同，本文所述的多食黄杆菌细胞不产生类胡萝卜素的混合物；这些细胞产生的可检测类胡萝卜素只有R-R玉米黄质。由于ZX必定与其它类胡萝卜素竞争消化摄取和组织沉积，这样在口服之后可能有利于提高ZX摄取和视网膜沉积，尤其是当ZX被用作药物治疗黄斑变性病例时。通过细菌发酵法进行的工业规模制备如本领域技术人员所知那样，用于在实验装置中发酵细菌的方法当转化为大规模的制备操作时费用很高且难于控制。因此，本申请人为商业应用多食黄杆菌研制了更好的营养物和方法。与在此之前在美国专利5,308,759和5,427,783中公开的介质和条件相比，该改进的营养物和方法大大易于操作，且生产每克ZX的费用要低得多。优选的营养物和条件描述于实施例1中。发酵后，可往细胞中加入一种或多种稳定化合物，以防ZX在纯化期间降解。在开始巴氏杀菌或其它处理之前，当细胞仍在发酵罐中时就可加入稳定剂。申请人已测试了各种候选稳定剂。应用实施例2中列举的组合稳定剂可获得迄今最佳结果。加入稳定剂之后，可加热至55℃达25分钟对细菌进行巴氏杀菌，以杀死细菌而不损坏ZX。然后将培养物冷却至室温，通过机械方法如交叉流微量过滤从细胞中脱除液体。这样可将细胞和固形物的浓度从约10vol％的初始值提高到约60-80vol％的滤后浓度。于是形成细胞浆。可与含有存活的或已杀死但完整的微生物细胞的其它食品(干酪、酸牛奶、啤酒等)相比，多食黄杆菌细胞(呈完整的和可能存活的状态)可适于人们直接吸收。多食黄杆菌细胞没有已知的致病性。它们是从冷水流分离出来的，且由于它们适于在冷水中生活，所以它们在人体的温度下不能很好地生存或繁殖。此外，这些细胞没有任何已知的毒性成分；它们呈革兰氏阴性，因而没有革兰氏阳性菌那样的细胞壁结构。当以细胞浆的形式直接向鸟或鱼喂食时，该细菌细胞显得很适合于作递送载体。当动物消化该细胞时便释出ZX，于是ZX被吸收入血流，沉积入各种组织(包括视网膜)中适当的部位。因此，含R-R玉米黄质的完整多食黄杆菌细胞可适合人们直接消费，需要的话，可以下述三种形式中的任一种(1)完整的存活形式；(2)巴氏杀菌后完整的杀灭形式；或(3)调和物，该调和物中的细菌细胞已被杀死且它们的膜已破裂，以破开细胞使得更易于获得ZX。这可通过下列方法达到，如超声处理(运用高频声波)、高压或研磨。如果采用溶剂提取操作来破裂细胞膜，则可略去这一步骤。需要的话，ZX制剂可包括细胞漂洗步骤，其中在发酵后通过用含所需组分如稳定剂、防腐剂、调味剂等等的溶液冲洗细胞而除去多余的营养物和废代谢物。纯化需要的话，可将细胞浆(含完整的或破裂的细胞)干燥以进一步浓缩细胞并提高干物料中的ZX浓度。这可通过机械方法例如喷雾干燥(利用热能)或者冷冻干燥(在真空下冻干)来实现。如果进行干燥，则所得固体残余物常被称为干生物量；它一般包含约1-10wt％的ZX，和其它细胞固形物、得自发酵介质的残余固体和上述稳定剂。先于或晚于(或代替)破裂或干燥，可进行提取步骤以浓缩ZX，它主要积聚于细胞膜中。提取用的合适溶剂一般包括极性有机溶剂。迄今认为最佳溶剂是四氢呋喃(THF)，它侵蚀细胞从而无需单独的膜破裂步骤。虽然在实验室操作中应用THF时不需搅拌，但在工业生产中在溶剂混合步骤期间可能需要搅拌。其它溶剂也已测试过而且将继续测试和估价，但迄今测试的没有一种有THF那样好。迄今测试过的非环状有机溶剂(例如丙酮和乙醚)具有较低的ZX溶解度，而其它溶剂如甲醇、乙醇、和己烷对ZX的溶解度甚至更小。在使溶剂尽可能多地溶解ZX的条件下，将溶剂与细胞浆或干生物量混合。然后采用例如离心分离或过滤法将溶解的液体部分与固形物分离。固形物可以弃去或用作其它处理步骤(需要的话，包括重复的溶剂提取循环)的原料。通常通过蒸发处理液体部分以除去溶剂。残留下粘稠的油状物，其中含有R-R玉米黄质和由溶剂从细胞浆中溶出的其它可溶性组分。当将THF用于一次性操作提取含1-3wt％ZX的细胞时，接着蒸发除去THF之后，所得液体包含约5wt％-约20wt％ZX。表现出良好的初步结果的另一种溶剂提取包括运用超临界流体(即在常压下一般是气体但在较高压力下变成可作为溶剂的液体的化合物)。二氧化碳是在超临界提取中用得最广泛的溶剂，且可获得工业规模的CO2提取系统。在这种系统中，在高压反应器中将液化二氧化碳与细胞浆或干生物量混合。然后使该液体流过一系列容器，这些容器逐渐减小压力。ZX可在较高压力下从溶液中沉淀析出，所以可在减压步骤早期收集ZX，而大量杂质仍溶于二氧化碳中并将被带到进一步降压的其它反应器中。应用夹带剂(例如乙醇、丙二醇或乙酸乙酯)可进一步提高超临界溶剂提取的效果。在初步实验中已测试了几种这类夹带剂，它们业已表现为显著提高ZX在超临界二氧化碳中的溶解性。虽然在超临界提取中广泛应用了二氧化碳，但也用到其它化合物(包括各种含氮或含氯氟烃化合物)。可以测试随压力变化经历气相和液相的任何这类溶剂，以确定它是否适合于如本文所述纯化得自细菌的ZX。需要的话，由溶剂提取或超临界提取而得的含ZX的油状流体，可与如植物油那样的载体物质混合，然后不需要任何进一步纯化ZX而包封于供人吸收而设计的胶囊内。这样可提供制备供人吸收的半纯、可消化形式的R-R玉米黄质的经济方法，可作为药物供给患有黄斑变性的患者，或者作为营养辅剂供给希望在生命晚期减小患黄斑变性的危险性的人们。也可进一步纯化呈半纯、油状液体的R-R玉米黄质，以提高ZX浓度和除去任何杂质。这可通过例如下列方法实现(1)双溶剂系统，其中应用两种选择的溶剂的组合；(2)在基质(例如织物滤床)上吸附，促使ZX结晶；或(3)逆流色谱法。实施例4中描述了采用色谱法纯化ZX至约98％的纯度。用于其它类胡萝卜素的纯化方法公开于美国专利5,382,714(Khachik1995)和4,851,339(Hills1989)中。由于它们的化学相似性，可纯化β-胡萝卜素或黄体素的任何技术也可能在纯化ZX时给出良好结果。服用方法经口吸收是让人服用ZX以保护视网膜的优选方法，如下文所述，采用的吸收方式例如有日服或周服的胶囊，或应用添加了ZX的食品或食品添加剂。治疗时不需在固定的时间间隔按时服用(如日服或周服药丸)，而是时断时续地服用使得每次剂量能在适当的时间段(例如一天或更多天，优选在一周以内)消逝，这样就能使小量ZX逐渐沉积于黄斑组织内。与任何维生素辅剂一样，单次剂量可能有益，但单次剂量在数年期间没有定期小剂量那样好。对于哺乳动物摄取类胡萝卜素的研究表明，日服比周服或其它偶尔摄取更好，由于血液浓度中表现出的“荷载”因素。由于口服后摄取类胡萝卜素量较低，所以患有严重黄斑变性的患者最好采用其它服药方式例如肌内或静脉内注射，或植入缓释装置。可注射的载体调和物可包括水、缓冲剂和带有多羟基的有机化合物如丙二醇、葡聚糖或环糊精化合物。可采用各种口服包装方式，只要它能保护ZX以防氧化和考虑ZX的油性性质。合适的口服组合物实例包括(a)可消化的水密胶囊和含于其内的流体，该胶囊和流体大小应适于整个吞咽，且都是药理上可接受的，其中的流体含有与适当载体或稀释剂如植物油混合的R-R玉米黄质。需要的话，如实施例9或10中所述那样，该流体化ZX可以是微胶囊化或包封于微胶粒内，以保护ZX防止在胃中降解。这种胶囊可由较硬的、紧密的材料制成，或者由柔韧的材料例如包封维生素E的常用胶囊材料制成。如果构成胶囊的材料能抗胃中的酸性并能被肠道中的酶消化，则可保护ZX以防在胃中降解，并提高ZX的生物利用率。然而，已知至少一部分作为咀嚼的植物质成分进入胃的ZX能在经过胃时未受损坏；因此，保护ZX以抗胃酸并非很重要，且胶囊材料的选择将是经济上的优选问题而不是科学规定。(b)适于人口服的片剂，该片剂包含R-R玉米黄质和与玉米黄质相容的可压缩的粘结材料，该粘结材料能使该片剂在适当压力下压缩之后保持其形状，并且该片剂是药理上可接受的，其大小适于整个能吞咽。需要的话，该片剂可带有一层包衣以保护ZX抗胃酸。(c)包含供人消费的食品的组合物，它是营养上可接受的且味道良好，它适合作为玉米黄质的载体，且它含有作为添加剂的R-R玉米黄质。ZX是一种橙黄色色素，它的疏水性通常与植物油、油酥和鸡油一样；它也类似于如β-胡萝卜素的其它类胡萝卜素食品着色剂。因此，它可作为营养着色剂加入各种食品，例如人造奶油、乳制品、糖浆、焙烤食品、制曲奇饼干面团、胡桃巧克力小方饼面糊、不进行猛烈烧烤的肉制品和汤佐料。其它合适的食品可包括粒状调和物，例如用作汤、色拉、焙烤食品等等的添加剂的加盐的或加香料的调料。需要的话，粒状调和物可具有保护性包衣以减弱胃酸对ZX的降解。许多文献描述了β-胡萝卜素和其它类胡萝卜素作为着色剂和营养添加剂的应用；实例包括Klaui等1970；Klaui和Bauernfeind1981；Colombo和Gerber1991，和美国专利4,522,743(Horn等1985)，5,180,747(Matsuda等1993)，5,350,773(Schweikert等1994)，和5,356,636(Schneider等1994)。由于它们的化学相似性，任何在供人食用的食品中加入β-胡萝卜素或黄体素的方法也同样可能直接应用于R-R玉米黄质。(d)包含供人吃的食料的组合物，其中的食料含有对人无害的微生物细胞，它还含有玉米黄质的R-R异构体。这种食料可选自干酪、酸牛奶、牛奶和啤酒。需要的话，该微生物细胞可以是存活的，或者它们已由例如巴氏杀菌或裂解的方法杀死。其它包装形式也行得通而且可优选供各种应用。检测动物内的R-R玉米黄质测试用得自ATCC55238系的多食黄杆菌细胞合成的ZX在一种鸟内的保护视网膜作用，该鸟名为Coturnixcoturnixiaponica，通常称为日本鹌鹑。这种鸟为人的黄斑变性提供有用的动物模型，是因为下列因素的缘故(1)在一些重要方面日本鹌鹑的整个视网膜象人的黄斑。例如，该鹌鹑视网膜包含ZX和黄体素，而且与人的黄斑相似，它富含感光锥而不是视网膜杆。(2)日本鹌鹑视网膜表现出与人视网膜有某些相同的病理症状。例如，日本鹌鹑视网膜积累软脉络膜小疣和脂褐质，它们与人的AMD发生紧密相关。(3)虽然鹌鹑视网膜比人视网膜小得多，但由于存在ZX和黄体素而使整个鹌鹑视网膜呈黄色。这有效地使鹌鹑的整个视网膜作为人视网膜中心小黄斑区的模型，而且它使得分析和观察容易得多。(4)日本鹌鹑的视网膜无血管，其结构类似于人视网膜的凹部区。(5)日本鹌鹑的寿命大致为1-1.5年(雌性)和3-4年(雄性)。这使得易于研究老化过程，而对于寿命更长的动物却很难进行这种研究。在Fite等1991和Fite等1993中，这些因素讨论得更详细。测试试验如实施例5-8中所述。结果极好，清楚地表明由多食黄杆菌细胞生产的R-R玉米黄质(1)在口服后适当地沉积于黄斑中，和(2)在保护视网膜细胞以抗光毒损伤方面高度有效。此外，如实施例8中讨论的那样，初步结果表明，在保护视网膜以抗光毒损伤方面R-R玉米黄质远比β-胡萝卜素有效。当以高剂量对试验动物喂食β-胡萝卜素时，β-胡萝卜素提供的较小保护效果甚至达不到统计显著性水平。反之，当对动物喂食同样剂量的R-R玉米黄质时，它完全阻滞和防止了被测视网膜损伤的显示。R-R玉米黄质的微生物源本文公开的多食黄杆菌细胞在ATCC保藏(如前所述，ATCC登记号为55238；按ATCC分类，将它们称为多食鞘氨醇杆菌，但在Bergy’sManual中未改变它们的名称)。该细胞系为本领域技术人员提供数种选择方法以进行微生物法合成异构体纯的R-R玉米黄质。首先，这些细胞直接的和未修饰的子代可用于合成R-R玉米黄质而没有可检测量的其它不需要的立体异构体。由这些细胞产生的全部类胡萝卜素包括90％以上的ZX，即所需的类胡萝卜素。其次，ATCC55238株的子代在修饰后可用于提高ZX的R-R异构体产量的方法中。可用例如下列数种方法中的任一种产生突变型或其它变种细胞系(1)用例如紫外线或X-射线辐射的诱变剂或者用已知的化学诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理野生型ATCC55238株的子代；(2)通过将多食黄杆菌细胞与能主动地促进细菌细胞之间DNA缀合和交换的其它种细菌混合，而产生有性组合体；或者(3)用能引起较大量DNA重排的细菌转座子或病毒处理多食黄杆菌。这些技术引起子细胞中的随机改变，再通过筛选试验分析这些子代以鉴定和分离能生产更高含量ZX的子代细胞。应用能抑制产生ZX的生物合成途径中涉及的一种或多种酶的化学物质(例如二苯胺、烟碱或洛伐他汀)便利筛选试验的进行。在非专业人员的术语中，这些抑制药物产生障碍物，后者只能由可产生异常高含量ZX的突变型细胞克制。幸好可用于鉴定高产量突变体或变体的试验简便、快速和容易。由于ZX是黄色色素，所以可简便地采用目视观察培养板来鉴定具有下列所需特征的突变型菌落(1)良好的细胞生长速率和(2)可产生异常大量黄色色素的能力。需要的话，在用诱变剂处理后的筛选试验中也可应用自动化设备(例如自动化平板读数器，或与流式细胞仪联用的细胞分选装置)。这些诱变技术和筛选技术都是本领域中常见的和熟知的。直接从ATCC55238野生型株得到的任何细胞都看成这些细胞的子代，即使它们被按上面列举的任意方法修饰、诱变或与其它细胞系有性组合。在第三种可选方法中，可生产非子代微生物细胞，它们包含分离自或者得自ATCC55238细胞系的基因，它们表达有助于合成R-R玉米黄质的酶。这类基因可应用已知技术分离和鉴定。例如，得自列于美国专利5,429,939(Misawa等1995，上面讨论的)中生产类胡萝卜素“crt”基因的DNA序列，可作为杂交探针用于在ATCC55238细胞系基因组中搜寻具有同源DNA序列的产生类胡萝卜素的基因。从这些细胞分离的产生类胡萝卜素的基因于是就可被插入能用于基因转化任何类型所需宿主细胞的质粒、粘粒、噬菌体或其它合适的载体，其中的宿主细胞例如有大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。这种可控基因工程能应用得自ATCC55238细胞的基因使转化的细胞产生R-R玉米黄质。此外，ATCC55238细胞的ZX-生产基因的蛋白质编码部分(即转录成信使RNA的基因部分，它随后被翻译成合成ZX的酶)可处于高效能和/或诱导型基因启动子控制之下。包含得自不同基因的基因启动子的这类“嵌合的”基因可用于多种目的，例如(1)当细胞在生长和繁殖时抑制ZX的生产，然后在发酵期间大大提高细胞生产的ZX；和(2)将基因插入优选为商用的新型宿主细胞，例如大肠杆菌细菌或酵母细胞，其中可应用熟知的和高度优化的发酵、处理和纯化技术。从ATCC55238细胞系分离的ZX-生产基因还可用其它熟知技术增强。例如，细菌基因常应用“非优选的”密码子，减少和控制由基因产生的蛋白质的量。为了松驰这种限制机理，得自ATCC55238细胞系的ZX合成基因中的非优选密码子可由能增强ZX-生产酶在选择的宿主细胞中表达的“优选”密码子替代。另一个实例是，半胱氨酸残基可通过在相同或其它蛋白质分子中与其它半胱氨酸残基形成不希望有的二硫键而阻碍酶的活性或稳定性。因此，有时可通过用其它氨基酸残基置换一个或多个半胱氨酸残基而增大酶的活性或稳定性(例如，授予Mark的美国专利4,737,462)。此外，蛋白质的表达常常可通过插入编码例如甘氨酸的常见氨基酸的密码子以代替编码蛋氨酸和色氨酸的密码子而得以增强，其中后两种氨基酸较不常见并且倾向于减缓和减少蛋白质的表达。当引起这种性质的氨基酸取代的合成基因产生后，可测试修饰的蛋白质以确定它被以更高量或更稳定的形式表达时是否保持所需的酶促活性。这些是已知基因工程技术的实例，它们可通过从ATCC55238细胞系分离的ZX-生产基因来评价，以确定这种修饰作用是否可提高多食黄杆菌细胞或其它种类宿主细胞生产的ZX。权利要求中的短语“已被遗传工程化以包含至少一个玉米黄质-合成基因的细胞，其中的基因含有得自ATCC登记号为55238的多食黄杆菌菌株的DNA序列”包括这样的细胞，它含具有化学法合成的DNA序列的基因，合成中应用通过分析ATCC55238细胞系或其子代而确定的DNA或mRNA序列。自动DNA合成仪是人们熟知的并可用于复制任何已知基因序列，而无需复制起始宿主细胞。“玉米黄质-合成基因”包括这样的任意基因它能表达ZX生物合成途径中涉及的酶或其它蛋白质，而且如果它被插入适当的宿主细胞就可用于提高ZX生产，不用考虑ZX生物合成途径中该基因编码的具体酶。实施例实施例1工业规模发酵本申请人在初始小规模实验室试验多食黄杆菌而优选的营养培养基等同于美国专利5,308,759(Gierhart1994)和5,427,783(Gierhart1995)中实施例3的营养培养基E。该营养培养基包含数种昂贵且难于加工的成分。为减少费用和为方便起见，在这些申请最初提出之后进行了大量研究以制备更好的工业规模营养培养基。目前优选用于工业规模发酵的营养培养基已排除玉米粉和几种其它成分。这些优选的培养基包含浓度在1-10％w/v范围内的高麦芽糖淀粉糖浆或甜菜糖蜜，还有0.5-4％w/v的玉米浸泡液的浓缩液；0.5％w/v的七水合硫酸铵；0.5％w/v的氯化钠；0.1％w/v的七水合硫酸镁；0.1％w/v的乙酸钠；0.001％w/v的七水合硫酸亚铁；0.2％w/v的酵母提取物；0.01％w/v的硫胺素-HCl；1-6％w/v的水解酪蛋白(例如NZAmineHD，由SheffieldProducts，DivisionofQuestInternational，Norwich，NY出售)；和1％v/v的植物油。当这些组分一起混合后，加入足够的NaOH以提高pH至6.5；反之，如果将该营养培养基的pH调至7.5，如美国专利5,308,759和5,427,783中实验室规模的试验中所述，则太多的固形物从玉米浸泡液的浓缩液中沉淀析出。该培养基在121℃下高压灭菌30分钟灭菌之后被冷却至27℃并用5-10％v/v的“液体预培养物”接种，该“液体预培养物”中包含能产生R-R玉米黄质而不产生S-S或S-R立体异构体的多食黄杆菌菌株。用于制备液体预培养物的细胞被保持在平板计数琼脂的斜面试管上。对这些斜面培养物用多食黄杆菌的克隆菌落接种，其中该杆菌得自由本申请人在ATCC保藏的菌株(ATCC登记号为55238)。在28℃下培养48小时之后，在4℃下冷藏原种斜面直至用作液体培养基的接种物。存活细胞也可应用通常的冰箱、干冰或液氮冷冻以长期贮存。液体预培养物的制备如下应用得自琼脂斜面的细胞接种盛装在300ml带挡板的烧瓶中、按上述方法制备的30ml液体培养基。生长条件为28℃、pH7.2-7.6，通过在250RPM下搅拌使之通气，培养24小时。在初始培养24小时后，将盛于一个或多个30ml预培养烧瓶中的细胞用于接种盛装在适当大小发酵罐中的数量多十倍的营养培养基。然后在28℃下将细胞培养48-72小时。应用NaOH和/或磷酸将pH维持在6.80-7.20。这样将溶解氧的含量保持在30-40％的饱和度在罐内搅拌速度为400-1000RPM时，以每分钟每体积液体为1体积空气的流速将过滤后的空气鼓泡通过该发酵罐。定期取样进行高效液相色谱分析表明，将细胞在这些条件下发酵约72小时内一般可产生最大量的ZX。实施例2稳定剂的加入通过实施例1的发酵法生产的ZX需要稳定以便于后续的纯化和配制，并保证纯度。可在制备或纯化过程期间的任意时刻将稳定化合物加入多食黄杆菌细胞(或含有ZX的细胞提取物)；通常，当细胞仍在发酵罐内时应加入一种或多种稳定剂。申请人已测试了各种候选稳定剂。迄今获得的最佳结果是应用了稳定剂的一种组合，在加入细胞之前将它们一起混合于少量合适的溶剂(例如20升发酵罐应用约2毫升乙醇)。优选的稳定剂混合物包括叔丁基氢醌(缩写为TBHQ；也称为2-(1，1-二甲基)-1，4-苯二酚)，用量为当与细胞混合后，形成的最终浓度范围为约250μg/L(每升微克)至高达约50mg/L；混合后浓度范围约250μg/L至约250mg/L的乙氧喹；浓度范围为约250μg/L至约250mg/L的α-生育酚；和浓度范围约500μg/L至约500mg/L的EDTA(乙二胺四乙酸)。适当的浓度可变范围宽，这取决于很多因素，例如后续的纯化步骤和预期的包装和吸收方式。这些稳定剂当用于一次通过性THF提取、接着与植物油混合并水密包封于维生素类丸剂时，它们的优选浓度约为TBHQ25-50mg/L；乙氧喹250-500μg/L；α-生育酚250-500μg/L；和EDTA500-1000μg/L。加入稳定剂后，将细胞培养物加热至55℃达25-50分钟进行巴氏灭菌。这样可杀死细菌而不损坏它们产生的ZX。然后将培养物冷却至室温，采用交叉流微量过滤系统将培养液中的含ZX细胞和其它固形物与液相分离，这样可使细胞/固形物浓度从初始值约10-15vol％提高到约60-80vol％的滤后浓度。该方法得到一种细胞浆，它还含有来自营养培养基的某些残余固形物。至于如实施例5-7中所述对进行视网膜试验的日本鹌鹑喂食的ZX制剂，将该细胞浆冷冻至-70℃，然后在25℃的完全真空下冻干，得到含有约1-10wt％ZX的干生物量。在过去的试验中，分别测定每批中的ZX量，再合并不同浓度的每批物质并混在一起以保证用于日本鹌鹑试验时的恒定浓度。生产供人吸收的ZX时，如实施例3中所述那样用溶剂提取而得粘稠的油状流体。实施例3半纯化成油状液体在按实施2中所述那样产生细胞浆后，可用多种方法中的任一种处理它们。如前所述，需要的话可采用例如下列方法破碎细胞膜以打开细胞且更易于获得ZX超声处理(高频声波)、高压或研磨，将细胞温度保持在低于约30℃以防氧化。不过，当将四氢呋喃(THF)用于溶剂提取步骤中时就不需该处理步骤，因为无需机械作用帮助THF就能很有效地破裂细胞膜。在实验室规模操作中应用THF时不需搅拌；但在工业制备操作中的溶剂混合步骤期间搅拌很可能有益于操作。在迄今做过的试验中，THF提取包括了将约8-20份体积的已纯化过滤了的THF与1份体积其中含60-80％固形物的细胞浆在低于25℃下混合2-24小时。THF主动攻击细胞，得到一种絮凝固形物的悬浮液。在高达20000g下离心数分钟后，大部分THF可通过倾析除去。残余的THF可被真空蒸发掉，留下粘稠的油状物。在一次性通过的操作中用THF提取而处理含1-3wt％ZX的细胞浆时，所得油状物通常含有约5-20wt％的ZX。实施例4制备呈干粉形式、高度纯化的玉米黄质，它含有100％纯R-R异构体呈干粉形式、高度纯化的玉米黄质制剂，是通过下述液相色谱法处理实施例3中所述的THF提取的油状流体而制备的。将含ZX的油状液体溶于己烷，然后通过装填中性氧化铝粉的色谱柱。应用两倍于柱体积的己烷洗柱，以除去例如β-胡萝卜素和番茄红素的类胡萝卜素杂质以及脂质和其它杂质。然后使80∶20的己烷∶丙酮混合物流过柱子以释放ZX。真空干燥洗脱出的ZX溶解物。色谱分析表明，ZX纯度至少达98％，只有痕量的可检测杂质。在相对未保护状态(处于正常冷藏，中等频度地取样，未含任何抗氧化剂，并且未采取任何防止与大气中的氧接触的措施)下大致贮存6个月后，取该ZX制剂样本交给FloridaInternationalUniversityinMiami，Florida的JohnLandrum教授(Bone，Landrum等的论文的合作者)进行立体异构分析。他应用二氨基甲酸酯衍生作用进行手性柱色谱分析，结果表明，该六个月未保护的制剂含92％ZX。杂质似乎主要是先于ZX洗脱的酮-类胡萝卜素；酮-类胡萝卜素是在类胡萝卜素分子某处连接有额外的氧原子，且它们属于类胡萝卜素未在抗氧化保护下贮存后形成的常见副产物。Landrum教授的手性分析表明，该制剂中100％的ZX是所需的R-R异构体。其中没有可检测量的、ZX的不需要的S-S或S-R立体异构体。我们认识到，上述色谱法纯化尽管完全可行并且高度有效，但不太适合工业上大量制备高度纯化的ZX。美国专利5,382,714(Khachik1995；也可参见Khachik等1991)中描述了一种为纯化黄体素而开发的可选方法，该方法在两溶剂提取体系中应用冷乙醇-水混合物，接着冷冻干燥，这为工业生产的应用提供了一种良好的备选方法。实施例5应用不同的规定食物组进行玉米黄质对日本鹌鹑的试验所有涉及日本鹌鹑的试验都是与AppliedFoodBiotechnology，Inc.(本申请的受让人)签约在theSchepensEyeResearchInstituteofHarvardMedicalSchool(Boston，Massachusetts)进行的。所有的处理组和对照组都包含统计上显著数量的鸟。在大多数场合中，对照组中的数量与处理组中一样多。缺乏类胡萝卜素的鸟食得自PurinaMills(St.Louis，Missouri)。这种鸟食只出售供实验应用；是采用天然缺乏类胡萝卜素的谷物(如买罗高粱籽)制得的。喂食给日本鹌鹑的所有ZX制剂都呈得自多食黄杆菌细胞的干生物量形式，所述细胞被发酵、用实施例2中所述稳定剂稳定化，进行了巴氏杀菌以杀死细胞，并用冻干法干燥。这些发酵和制备步骤是由AppliedFoodBiotechnology，Inc.在O’Fallon，Missouri的设施中完成的。所有试验动物都是从缺乏类胡萝卜素的蛋孵化的。这些蛋是通过对成熟后的亲代鸟(称为P1鸟)只喂食缺乏类胡萝卜素的饲料而得到的。打破它们的蛋并分析类胡萝卜素，直至那些蛋变成缺乏类胡萝卜素的蛋。缺乏类胡萝卜素的亲代鸟后来下的蛋被用于孵化所有试验组和对照组鸟。将试验组和对照组鸟分成四大组，它们接受不同的规定食物，根据它们接受的规定食物中类胡萝卜素不同而将这些组称为C+组、C-组、BC+组、ZX(+5)组和ZX(+50)组。给C+组鸟喂食含几种类胡萝卜素的标准商品化食物；该食物中还含有作为添加剂的合成α-生育酚(维生素E)。给C-组鸟喂食的食物如前述那样基本上缺乏所有的类胡萝卜素。不过，该食物含有所有的其它基本营养物，它还包含作为添加剂的合成维生素A和E。给BC+组喂食的食物缺乏除了作为添加剂的β-胡萝卜素之外的所有类胡萝卜素，与高用量ZX组中所用的配料相同(即每千克饲料加入50mgβ-胡萝卜素)。在开始进行光损伤操作之前7天，转而对BC+组的鸟喂食含β-胡萝卜素的食物。该组可直接比较β-胡萝卜素和ZX补充鸟的一个亚组，在光损伤之前7天，使该亚组的鸟从缺乏的食物转至ZX补充的食物。如实施例8中所述，这种直接比较表明，ZX在防止光毒损伤中高度有效，而β-胡萝卜素的保护效果太低而达不到统计上有效量。给ZX+组的鸟喂食的食物缺乏所有其它类胡萝卜素，但其中包括含有得自AFB的多食黄杆菌细胞的R-R玉米黄质的干生物量。对这些鸟喂食两种不同剂量的ZX以建立剂量-和-效果相互关系并与各种视网膜损伤指标关联。ZX(+5)组鸟接受较少量ZX，平均每千克饲料中加入5mgZX。由于日本鹌鹑每天吃约25-35克食物，所以低剂量组中每只鸟每天吸收约0.125-0.175毫克ZX。ZX(+50)组中的鸟接受高十倍的量(每千克饲料50mgZX)，使得这些鸟每只每天平均消耗1.25-1.75毫克ZX。利用Stacewicz-Sapuntzakis等1993描述的方法，通过高效液相色谱(HPLC)法分析对照组、缺乏组和ZX+组的食物中类胡萝卜素浓度。结果示于表1。表1注释ZX＝3R-3’R-玉米黄质β-Cryp＝β-隐黄质β-Car＝β-胡萝卜素Canthax＝斑蝥黄质Lycop＝番茄红素*＝初步鉴定；也可能是玉米黄质的顺式异构体。所有的鸟都喂养和保持在正常孵化笼中。除了下面指出的之外，将它们保持在正常宽范围光照状态，每天光照10-14小时。实施例6视网膜沉积经口吸收的玉米黄质对于实施例5中描述的各组规定食物组鸟进行了化学分析以测定沉积在鸟视网膜中ZX(和其它类胡萝卜素)的浓度。为了进行这些分析，将从缺乏类胡萝卜素的蛋中孵化后被喂食规定食物至少达六个月的鸟采用颈离位法杀死。解剖剜出的眼剥下视网膜组织，采用玻璃的或聚四氟乙烯(TEFLONTM)研杵在250μl蒸馏过的去离子水中将单片视网膜组织研磨至近乎均匀。取10μL匀浆液用于匀浆液的蛋白质分析以归一化各视网膜样本的结果。将含有2％w/v焦棓酚和50μl60％w/v氢氧化钾的250μl甲醇加入残留的240μl视网膜组织悬浮液中。在70℃水浴中加热该混合物达1小时，接着先后加入500μl50％v/v乙醇和2ml己烷。充分旋转混合该混合物，然后在5℃下放置直至出现分层。移出其中含己烷和提取的类胡萝卜素、生育酚、和视黄醇的表相(即浮在残余液面之上的更轻的相)。再往组织匀浆液中加入2ml己烷，旋转该混合物后再次分离。取出表相与第一次的合并。在第次提取循环中再次重复上述操作，以保证完全提取类胡萝卜素、生育酚和视黄醇。然后用1ml水洗涤合并的己烷提取液以除去残余的氢氧化钾。往该己烷一水混合液中又加入1ml己烷，然后用吸液管小心地吸出己烷层(表相)。接着在恒定氮气流中蒸发己烷。残余物中含类胡萝卜素、生育酚、视黄醇和其它未鉴定的己烷可提取化合物。将该残余物溶于溶剂(甲醇∶氯仿∶三乙胺)并按上述方法进行HPLC分析。结果列于下表2，它还示出了高强度光曝晒后的损伤程度。表2</tables>ND＝在这些样本中未检测到。检测到黄体素样化合物，但由HPLC保留时间和光电二极管阵列扫描该峰测知它显然不是黄体素。应注意，上述任一种食物喂食的鸟视网膜中均未检测到β-胡萝卜素。列于表2中的这些视网膜中的浓度表明，经口吸收的R-R玉米黄质确实沉积在接受作为食物辅剂、呈饲料添加剂形式的R-R玉米黄质的试验动物视网膜内，其中的R-R玉米黄质是通过将多食黄杆菌(ATCC登记号为55238)子代细胞发酵而产生的。这些发现很重要，因为ZX必须以正常方式消化，它必须通过肠屏障，它必须进入血流，而且它被鸟眼中视网膜细胞吸收的量必须足以保护视网膜组织以抗光毒损伤。所有这些障碍都被本文所述的细菌发酵制备的R-R玉米黄质制剂克服了。实施例7R-R玉米黄质对视网膜的保护每个规定食物组中某些鸟接受2,000-3,000勒的高强度可见光达28小时，其间采用包括1小时光照接着2小时几乎全暗的循环。在此光照循环期后，将鸟置于几乎全暗处达14小时，最后将鸟杀死。在初始试验中，已测知这种高强度光照量能给所有类胡萝卜素缺乏组的鸟造成严重损伤，并给对照(正常食物)组鸟造成适度损伤。在初始试验中还测知，光照后需要14小时黑暗，这样可测定未保护的(缺乏类胡萝卜素的)鸟中编程性死亡锥核数的极大值。喂食对照食物的鸟在光照后约24小时表现出最多的编程性细胞死亡，而喂食添加了ZX的食物的鸟表现出最多编程性细胞死亡的时间远远大于24小时。可测知损伤之前的时间的延长明显指示ZX的保护性效果。通过显微解剖分离这些鸟的视网膜，在二甲苯中固定后于乙醇中干燥，再包埋于paraplast(Oxford，56℃)中。然后将paraplast中的视网膜组织切片，再用Gallyas1990的方法或者采用碘化丙锭染色以显现表征编程性细胞死亡的固缩核。对放大400×(线型)倍时单个显微视野内看得见的固缩核数进行计数。对于每个处理组至少计数6到8个不同视野内的核数，并取平均值。表2中的结果清楚地表明，视网膜细胞死亡和损伤(1)由细菌法合成的R-R玉米黄质大为减少和/或延迟，与接受正常对照食物相比，甚至在低ZX(+5)用量时也一样；(2)由更高ZX(+50)用量减少得更多。ZX(+50)处理组的视网膜中完全不存在任何固缩核，从而提供使人信服的证据，即得自多食黄杆菌细胞系(ATCC登记号为55238)的R-R玉米黄质在保护视网膜细胞以抗光毒损伤方面获得了巨大的、惊人的突破。就本申请人所知，尚没有其它物质能达到或接近这种保护程度。实施例8直接比较R-R玉米黄质与β-胡萝卜素在保护视网膜组织方面的作用如上所述，对于BC+食物组中的鸟喂食β-胡萝卜素的量(每千克饲料50mg)相当于ZX(+50)组中玉米黄质的用量。这就使得可直接比较β-胡萝卜素与ZX在保护视网膜细胞以抗光毒方面的作用。结果表明，BC+组内的光毒损伤只减小很小的幅度(平均约10％或更少)。与对照组中的标准偏差相比，这种减小量没有统计意义；这种少量减小只是由于随机波动这种情况的概率为0.12-0.14。β-胡萝卜素在视网膜组织中不能提供较好的抗光毒保护作用，而相同用量的R-R玉米黄质在指示细胞损伤和死亡的相同指标中表现为总体100％减少，充分证明了本发现的重要性。通过微生物发酵合成的R-R玉米黄质，表现出远远超过任何现有物质的重大突破。实施例9吸收增强剂的形成只包括所需的玉米黄质R-R异构体、直径小于1微米的含玉米黄质“胶粒”，可得自实施例3中所述的生物量的溶剂提取物或油状流体，通过应用Olson1994中描述的某几种胆汁盐。含有R-R玉米黄质的油状流体可与适当的胆汁盐，例如由MarcorDevelopmentCompanyofHackensack，NewJersey出售的甘氨胆酸或牛磺胆酸的磷酸盐混合；或者通过应用含有胆汁盐混合物的胆囊提取物，例如由SalzmanCorporationofDavenport，Iowa出售的产品。这种胆汁原料可与溶剂提取物或油状物质混合以及与其它某些盐，包括氯化钠、氯化钙或氯化钾混合。然后在包括例如旋转叶片的混合装置的机械匀浆器中处理该混合物，旋转速度和持续时间可由例行实验优化，通过分析由叶片大小和形状、旋转速度和持续时间的各种组合决定的胶粒大小范围而进行优化。如果需要的话，可将所得胶粒干燥脱除溶剂，再应用例如植物油的载体或稀释剂稀释至任何需要的浓度。然后就可将该混合物包封于胶囊或便于吞咽和能保护所得胶粒以抗胃酸降解的其它装置中。也可利用其它乳化剂和脂质以形成小粒径的乳液。可利用描述于Olson1994中的非离子型去污剂，例如Tweens和Spans，以及例如磷脂和鞘脂的脂质原料，它们应能形成小粒子(小于1微米)的脂质囊。实施例9微胶囊化玉米黄质本实施例描述了微胶囊化形式的玉米黄质的制备。微胶囊是大小为10-1000μm的固体粒子，它被涂覆材料或壳包封的芯材(例如R-R玉米黄质)构成，可应用不同的化合物例如明胶、阿拉伯胶、淀粉、玉米醇溶蛋白(玉米的一种蛋白质)等等来制备。在制备壳材时，还可加入其它化合物以帮助保持所得制剂的形状、结构、稳定性或其它需要的特性。这类化合物可包括乳化剂，山梨醇，抗氧化剂如TBHQ或2-[1，1-二甲基]-1，4-苯二酚，或胶凝剂如角叉菜胶。将纯的或部分纯化的玉米黄质溶于适当溶剂如乙醇、丙酮或THF中。一旦成为溶液，即可将溶解的玉米黄质加入水而形成直径小于10微米的微晶。如果在加入期间，在乳化剂例如Tween80的存在下对于水、玉米黄质在溶剂中的结晶进行高频超声处理，则可改善该操作效果。一旦形成微晶，就将壳材加入水、玉米黄质和溶剂的混合物。对于例如明胶的某些壳材，有必要将60℃这样高的混合物温度保持达2小时。等壳材完全溶解，就将整个混合物置于超声发生器中达5-10分钟，以便再乳化该晶体。微胶囊的形成是通过应用合适的干燥方法如喷雾干燥，或者采用Sparks等在美国专利No.4,675,140中描述的旋转盘干燥法来干燥芯和壳材的混合物而完成的。喷雾干燥器被广泛用于食品和饲料工业。旋转盘是这样一种仪器，即它包括在控制的条件下能维持在一定温度的一个盘(直径约为4”)。它能在每分钟1,000-10,000转(rpm)范围内的不同速度下操作。当盘以例如4000rpm的速度旋转时，将芯和壳材混合物加到盘的中央。当该液体与受热的旋转盘接触时就形成微胶囊。微胶囊受离心力作用从中央抛射出去，并被收集在预涂有“收集”剂或“捕捉”剂例如疏水性淀粉或糊精的平表面。然后通过大小筛分法从捕捉剂中分离出微胶囊。将微胶囊置于容器内避光和空气并于冷藏条件下贮存直至称入胶囊供口服。因此，本文显示和描述了生产含供人吸收的R-R玉米黄质的药剂的新型和实用的方法；以及含微生物合成的R-R玉米黄质的调和物，以用于预防或治疗黄斑变性。虽然通过参照某些具体实施方案对本发明进行了举例阐释和描述，但本领域技术人员应明白，阐释性实施例的各种修饰、更改和等同是有可能的。受本文启示而直接得出的任何这种改变，和未偏离本发明的实质和范围的任何改变，都应认为属于本发明的范围。参考文献Bauernfeind，J.C.(编辑)，作为着色剂和维生素A前体的类胡萝卜素技术和营养应用(AcademicPress，NewYork，1981)Bone，R.A.，“黄斑色素在检测偏振光中的作用，”VisionResearch20213-220(1980)Bone，R.A.等，“人黄斑色素的初步鉴定，”VisionRes.251531-1535(1985)Bone，R.A.等，“HPLC法分析黄斑色素视网膜分布和年龄研究，”Invest.Opthalmol.Vis.Sci.29843-849(1988)Bone，R.A.等，“黄斑类胡萝卜素的立体化学，”Invest.Opthalmol.Vis.Sci.342033-2040(1993)Bone，R.A.等，“黄斑色素立体异构体在包括年龄相关性黄斑变性(AMD)的各种眼中的分布，”ARVOAbstractsInvest.Ophthalmol.Vis.Sci.351502(1994)diMascio，P.等，“作为最有效生物类胡萝卜素单线态氧猝灭剂的番茄红素，”ArchivesofBiochemistryandBiophvsics274532-538(1989)Dorey，C.K.等，“衰老和AMD眼中的脂褐质，”inRetinalDegeneration(Hollyfield等人编辑，PlenumPress，NewYork，1993)EyeDiseaseCaseControlStudyGroup，“抗氧化剂状态和新血管的年龄相关性黄斑变性，”Arch.Ophthalmol.11104-109(1993)EyeDiseaseCaseControlStudyGroup，“新血管的年龄相关性黄斑变性的危险因素，”Arch.Ophthalmol.101701-1708(1992)Foote，C.S.等，“单线态氧的化学性质。XI.单线态氧引起的类胡萝卜素的顺反异构化作用和可能的猝灭机制，”J.Amer.Chem.Soc.925218-5219(1970)Foote，C.S.等，“单线态氧的化学性质。X.类胡萝卜素猝灭相当于生物保护作用，”J.Amer.Chem.Soc.925216-5218(1970)Gallyas，F.，ActaNeuropathologica79620(1990)Gerster，H.，“综述老化黄斑的抗氧化剂保护作用，”AgeandAging20060-69(1991)Gittinger，J.W.，眼科学临床疑难手册(Little-Brown，Boston，1988)Haegerstrom-Portnoy，G.，“短波敏感性视网膜锥的灵敏度随老化而降低黄斑色素的保护作用？”J.Opt.Soc.Am.A52140-2144(1988)Ham，W.T.Jr.等“哺乳动物视网膜中产生光化学损伤时的基本原理，”CurrentEyeResearch3165-174(1984)Handelman，G.J.和Dratz，E.A.，“抗氧化剂在视网膜和视网膜色素上皮中的作用以及原氧化剂引起的损伤的性质，”Adv.inFreeRadicalBiology&Medicine21-89(1986)Handelman，G.J.等，“人黄斑和整个视网膜中的类胡萝卜素，”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.29850-855(1988)Jialal，I.等，“β-胡萝卜素抑制低密度脂蛋白的氧化修饰，”BiochimicaetBiophysicaActa1086134-138(1991)Khachik，F.等，“用高效液相色谱法分离、鉴定和定量分析水果、蔬菜和人血浆中的类胡萝卜素，”PureandAppliedChemistrv6371-80(1991)Kirschfield，K.，“类胡萝卜素色素它们在保护眼和感光细胞以抗光氧化中的作用，”Proc.R.Soc.Lond.B21671-85(1982)Malinow，M.R.等，“猴子中与食物相关的黄斑反常现象，”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.19857-863(1980)Pease，P.L.等，“人黄斑色素的光密度，”VisionRes.27705-710(1987)Peto，R.等，“食物的β-胡萝卜素能大为降低人癌率吗？”Nature290201-208(1981)Schalch.W.，“视网膜中的类胡萝卜素-它们在预防或限制由光和氧引起的损伤中的可能作用的综述，”EXS62280-298(1992)Seddon，J.M.等，“食物的类胡萝卜素，维生素A，C和E，和晚期年龄相关性黄斑变性，”JAMA2721413-1420(1994)Snodderly，D.M.等“黄斑色素，I.吸收光谱，定位，以及同灵长目动物视网膜中其它黄色色素的差别，”InvestOphthalmol.Vis.Sci.25660-673(1984)Sperduto.R.D.等，“对于年龄相关性白内障或黄斑变性有营养疗法吗？”Arch.Ophthalmol.1081403-1405(1990)Taylor，A.等，“氧化作用和老化对视力的影响，”JournalofToxicologyandIndustrialHealth93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