专利名称：制备核苷酸混合物的方法
技术领域：
本发明涉及医药，更确切地说涉及制备核苷酸混合物的方法。核苷酸混合物可用医疗实践，作为治疗视网膜毯细胞层营养不足(тапеторетиналъных абиотро
ий)和其它疾病的药剂。
视网膜毯细胞层营养不足是一种人类遗传疾病，它导致弱视和失明。这种类型疾病十分普遍，每1000居民中就有0.2至5人。然而，至今为止还没有治疗视网膜毯细胞层营养不足的有效方法和药剂。
已知一种制备具有医疗性质的核苷酸混合物的方法(“实验生物学和医学通报”，1969(莫斯科)，№9，32～26页)。上述方法是在45℃，用胰核糖核酸酶处理浓度为5～10毫克/毫升的核糖核酸一小时。
上述方法的特点是其目的产物的质量不高。所得核苷酸混合物含蛋白质杂质(高分子热原质)，因而，只能将它局部用于外敷绷带。口服上述制剂可能导致制剂中所含核苷酸的深度裂解，从而不能保证它的治疗效果。
还知道一种制备核苷酸混合物的方法(全苏医学科学院公报，1971，医学，№7，63～69页)。此方法在于用胰核糖核酸酶使酵母核苷酸进行水解，然后渗析所得的水解物，接着分离并浓缩目的产物。目的产物的产率为40～43(重量)%。
上述方法的特点是目的产物的收率低，并由于存在低分子和高分子的热原质化合物而使产品不纯。在肌肉内注射上述制剂时会表现出强的病态，相当数量的病人会体温升高，过敏反应，而结膜下用药会导致眼球结膜充血和水肿，同时耳下淋巴结增大和有病态。
本发明的任务是采用不同的工艺操作而建立新方法，该方法可以增加目的产物的收率，提高质量，并排除其发热性(Пироченностъ)。
任务是这样解决的，在本申请的核苷酸混合物的制备方法中，通过用胰核糖核酸酶水解酵母核糖核酸，从所得水解物中分离出核苷酸部分，接着从该部分中分离目的产物。根据本发明，水解酵母核糖核酸是在PH4.5～5.5时进行的，而从水解物中分离核苷酸部分是在孔径为50～150
的薄膜上进行的。
为增加目的产物的收率，水解最好在62～65℃温度下进行。
在温度低于62℃时用胰核糖核酸酶水解进行得慢，而在温度高于65℃时部分酶变性，水解进行不完全。
为了在分离核苷酸部分之前，除去生成的微生物群落，最好在水解物中加入乙醇，其量为水解物体积的15～30%。如果加入水解物中的乙醇少于15(体积)%，则并不能减慢水解物中微生物群落的形成，而加入的乙醇大于30(体积)%时，会导致核苷酸部分沉淀。
在薄膜上分离核苷酸部分最好是在20～30℃温度，0.15～0.4兆帕(МПа)条件下进行。在压力低于0.15兆帕，温度低于20℃条件下过滤混合物时，实际上延长了操作过程，而并不增加制剂的产率，在这种情况下可能播下微生物群落。在压力高于0.4兆帕，温度高于30℃时，则可能导致改变制剂的结构和组成，并破坏薄膜。根据本发明，分离目的产物是采用8～10倍体积的乙醇以沉淀核苷酸部分，除去溶剂并干燥目的产物。分离目的产物也可以用8～10倍体积的乙醇沉淀核苷酸混合物，除去溶剂，将混合物溶于0.55～0.65%的氯化钠溶液中，直至其浓度达到3.3～3.7(重量)%，于78～98千帕(КПа)通过孔径为2000～2200
的薄膜以过滤所得溶液。用少于8倍体积的乙醇沉淀核苷酸混合物不可能完全除去低分子的热原化合物，用大于10倍体积的乙醇沉淀也不会增加正效果。
在制备浓度大于3.7(重量)%的核苷酸制剂时，观察到明显的发热性，使用浓度低于3.3(重量)%的制剂，则会导致输入的液体量的体积增加，这对病人来说是非常不欢迎的。
通过孔径小于2000
的薄膜进行再次过滤时，操作进行较慢，而通过孔径大于2200
的薄膜过滤时，则制剂成为发热的并不合格。
本发明方法与已知方法相比，可以增加目的产物的产率8～15%，同时还提高目的产物的质量，并排除其发热性。
本发明方法是按下述实现。
将酵母核糖酸悬浮在蒸馏水中，用碱将PH值调到4.5～5.5。然后在核糖核酸溶液中加入酶-胰核糖核酸酶，将溶液加热至62～65℃，并在此温度下进行核糖核酸的水解。水解完成后将水解物冷却，向其中加入乙醇并进行搅拌。为分离加入乙醇后形成的细分散沉淀，将混合物进行微量过滤。然后用超滤法，最好在20～30℃温度，0.15～0.4兆帕下，通过孔径为50～150
的薄膜将澄清液分出。将滤液分离后，向浓缩物中加入蒸馏水，而得到附加量的滤液。向超滤液的总量中在搅拌下加入乙醇。将混合物澄清后倾析上清液，用小量乙醇洗涤目的产物沉淀，然后滤去乙醇，干燥沉淀。目的产物可以以干燥形式或溶液形式制得。为此，将用8～10倍体积的乙醇沉淀后而分离出的核苷酸混合物溶于0.55～0.65%的氯化钠溶液，直至其浓度为3.3～3.7(重量)%。将所得溶液在78～98千帕压力下通过孔径2000～2200
的薄膜而进行过滤。
所得目的产物是白色的或略带黄色的白色非晶形粉末，易溶于水、氯化钠水溶液中，不易溶于乙醇中，不溶于丙酮和乙醚中。制剂是单一寡核苷酸(包括至七聚物)的混合物，其主要成分(达40(重量)%)为双核苷酸。
按照本发明方法所制得的核苷酸混合物在严格控制下，在医院里进行了疗效试验，包括研究视场、网膜电图、对黑暗的适应性和视觉的清晰度。一共对2500个患者进行了试验。疗程为10～15天。肌肉内注射制剂每月150～200毫克，分两次，间隔4～6小时。
2500个患者中有467人进行了长期治疗和观察(4至14年或更长)。
分析长期观察所得的结果，表明60%的病人表现稳定或稳定并改善这种严重的与日俱增的疾病过程。患者主观地注意到，无论在关闭场所还是在户外，都具有改善移动时确定目标的能力。列出下列实施本发明的实施例以更好地理解本发明。
实施例1将70克酵母核糖核酸溶于430毫升蒸馏水中，并用2N NaoH将溶液的PH值调到5.1加入140毫克胰核糖核酸酶，于65℃水解5小时。水解物的总体积为465毫升。然后冷却至25～35℃，加入120毫升乙醇，过滤所生成的细分散沉淀，在0.4兆帕压力，30℃温度条件下，通过孔径为100
的醋酸纤维薄膜(薄膜工作表面为100厘米2)将滤液进行超滤。得到360毫升滤液。向剩余物中加入两次，每次70毫升水，得到附加的140毫升滤液。将滤液(500毫升)与5升酒精(10倍体积的酒精)混合。将所得悬浮液冷至0～(+4)℃，在该温度下保持4小时。析出的沉淀用过滤法分离，用0.360升乙醇洗涤，在真空干燥箱中干燥。目的产物的产量为36克。
当λ＝260nm，PH＝2时，比消光EI%Icm＝240。当PH为7、波长为230nm，260nm;280nm时，光吸收比(A)为A 260/230 3.15A 260/280 1.60所得目的产物的组成，重量%核苷 1.5单核苷酸 25.6双核苷酸 28.1三核苷酸 23.8四核苷酸 12.8五核苷酸和更高的寡核苷酸 余量实施例2将67克酵母核糖核酸溶于400毫升蒸馏水中，用2N NaoH将溶液的PH值调到4.5。加入130毫克胰核糖核酸酶，于62℃水解5小时。水解物总体积为430毫升。在冷却至25～35℃后在430毫升水解物中加入64.5毫升乙醇并过滤。在0.3兆帕压力20℃温度下，通过孔径为150
的醋酸纤维薄膜(薄膜工作表面为100厘米2)进行超滤分离。于6小时期间得到380毫升滤液。在剩余物中加入65毫升水，得到附加的65毫升滤液。将总体积为445毫升滤液与3.6升乙醇混合。滤出沉淀，用0.3升乙醇洗涤，在真空干燥箱中干燥。目的产物的产量为39克。
在λ＝260nm，PH＝2时，比消光EI%Icm＝240，在PH为7，波长为230nm，260nm，280nm时，光吸收比(A)为A 260/230 3.90A 260/280 1.70目的产物的组成，重量%核苷 4.8单核苷酸 19.3双核苷酸 23.1三核苷酸 20.2四核苷酸 16.9五核苷酸和更高的寡核苷酸 余量实施例3将77克酵母核糖核酸溶于460毫升蒸馏水中，用2N NaoH将溶液的PH值调到5.5。加入150毫克胰核糖核酸酶，在65℃水解5小时。水解物总体积为500毫升。然后冷却至25～35℃，加入150毫升乙醇。滤出所生成的细分散沉淀。在0.2兆帕，25℃温度下，将滤液通过孔径为50
的醋酸纤维薄膜(薄膜的工作表面为100厘米2)而进行超滤四小时。将滤液(560毫升)与4.5升乙醇(8倍的体积)混合，将所得的悬浮液冷至0～(+4)℃，在该温度下保持4小时。析出的沉淀用过滤法分离，0.4升乙醇洗涤，并在真空干燥箱中干燥。
目的产物的产量为40克在λ＝260nm，PH＝2时，比消光EI%Icm＝228在PH为7，波长为230nm，260nm，280nm时，光吸收比A 260/230 4A 260/280 1.55目的产物的组成，重量%核苷 2.1单核苷酸 12.6双核苷酸 25.2三核苷酸 24.2四核苷酸 18.5五核苷酸和更高的寡核苷酸 余量实施例4按实施例1所述的方法，将酵母核糖核酸进行水解并分离核苷酸部分。将析出的沉淀(36克干燥混合物)溶于0.6%的氯化钠的蒸馏水溶液(958毫升)中，并搅拌至完全溶解。将所得黄色溶液通过棉布滤器过滤。然后于98千帕压力下通过孔径为2000 的薄膜。于无菌条件下将核苷酸溶液分灌入3毫升的中性玻璃的安瓿中，在高压釜中，于119℃处理34分钟。目的产物中的核苷酸浓度为3.3%，比重为1.01克/厘米3。进行全部上述操作可保证得到无毒、无菌、不发热的目的产物，其组成与实施例1相似。
实施例5按实施例2所述方法，将酵母核糖核酸进行水解，并分离核苷酸部分。将析出的沉淀(39克干燥混合物)溶于0.55%的氯化钠的蒸馏水溶液(995毫升)中，并搅拌至完全溶解。将所得的黄色溶液通过棉布滤器过滤，然后于78千帕压力下通过孔径2200 的薄膜。于无菌条件下将核苷酸溶液分灌入3毫升的中性玻璃安瓿中，在高压釜中，于122℃处理32分钟。目的产物中的核苷酸浓度为3.7%，比重为1.008克/厘米3。所得目的产物是无毒、无菌的，使用它不会产生发热性效果，其组成与实施例2相似。
权利要求
1.用胰核糖核酸酶水解酵母核糖核酸，从所得水解物中分离核苷酸部分，接着从其中分离目的产物而制备核苷酸混合物的方法，其特征在于，水解酵母核糖核酸是在PH为4.5～5.5下进行，从水解产物中分离核苷酸部分是在孔径为50～150
的薄膜上进行的。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，水解是在62～65℃时进行的。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于，在分离核苷酸部分之前，在水解物中加入水解物体积的15～30%的乙醇。
4.按照权利要求1的方法，其特征在于，在薄膜上分离核苷酸部分是在0.15～0.4兆帕压力，20～30℃温度条件下进行的。
5.按照权利要求1的方法，其特征在于，通过用8～10倍体积的乙醇沉淀核苷酸部分，除去溶剂，并干燥目的产物而进行分离目的产物。
6.按照权利要求1的方法，其特征在于，通过用8～10倍体积的乙醇沉淀核苷酸部分，除去溶剂，将混合物溶于0.55～0.65%的氯化钠溶液中，直至其浓度为3.3～3.7(重量)%，于78～98千帕的压力下，通过孔径2000～2200
的薄膜而过滤所得溶液而进行分离目的产物。
全文摘要
制备核苷酸混合物的方法，在pH为4.5-5.5时，用胰核糖核酸酶将酵母核糖核酸进行水解，然后在孔径为50-150的薄膜上从所得水解物部分中分离核苷酸部分，接着纯化，并从其中分离出目的产物。
文档编号A61K31/7115GK1053090SQ8910280
公开日1991年7月17日 申请日期1989年4月3日 优先权日1988年6月14日
发明者鲍瑞斯·波利索维奇·弗克斯, 玛利娜·伊夫格尼弗娜·沙巴诺娃, 斯维阿托斯拉夫·尼科拉维奇·费德罗夫, 朱利·米克哈罗维奇·科拉斯诺帕尔斯基, 尤尔弟斯·亚诺维奇·米克斯代思, 伊夫格尼·德米德里维奇·俄莫利夫, 玛拉·奥古斯托夫娜·嗄鲁玛 申请人:苏联医学科学院人体形态研究所, 眼显微外科跨部门科学技术综合所, 苏联科学院百欧拉科学制造联合公司