一种氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒及其制备方法与应用，属于纳米材料领域。

背景技术：

自1985年Kroto等人发现C₆₀以来，富勒烯极大地推动了纳米科技的发展。随着富勒烯工业生产的迅速发展以及基于富勒烯材料的纳米技术大量涌现，人们对于富勒烯及其衍生物效应给予了极大的关注。富勒烯和内嵌金属富勒烯由于其独特的结构和化学物理性质，在生物医学领域有非常广泛的应用。现有的研究结果表明，富勒烯/金属富勒烯具有抗病毒作用、抗氧化活性和细胞保护作用、抗菌活性、药物/基因输运载体、磁共振成像和抑制肿瘤生长等多方面的特性。但是由于富勒烯自身在水中难以溶解，这在很大程度上制约了其在生物领域的应用。目前主要通过亲水性高分子材料，如PEG、PVP等包覆或在碳笼表面修饰亲水性基团，如羟基、氨基等增加其在水中的溶解度。

目前，在金属富勒烯碳笼表面修饰氨基酸可以在碳笼上引入羧基等官能团，作为后续生物应用的中间体，而且据报道其本身也是一种良好磁共振成像造影剂。目前在碳笼表面修饰氨基酸的方法主要是用富勒烯的甲苯溶液与氨基酸的碱性水溶液进行反应，反应过程中用到有机溶剂不符合简单经济、绿色环保的主旨。因此，开发一种绿色环保、简单易行的制备氨基酸修饰的富勒烯水溶性纳米颗粒具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒及其制备方法与应用，本发明纳米颗粒能溶于水，其制备方法简单、绿色环保。

本发明提供的氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒，它的结构通式为metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；

其中，metallofullerene为金属富勒烯；

0≤x<50；0≤y<20；

Amino Acid为水溶性氨基酸。

上述结构通式表示羟基和水溶性氨基酸均连接于金属富勒烯上。

上述的纳米颗粒中，所述金属富勒烯包括；M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_mA_3-mN@C_2n中的至少一种；其中，M、A均为金属元素，所述M、A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的至少一种，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均为整数；

所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。

本发明中，镧系金属元素为镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)；

所述稀土金属具体可为Gd，所述金属富勒烯具体可为Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。

上述的纳米颗粒中，所述纳米颗粒的水合粒径可为1～1000nm，具体可为10～300nm。

本发明还提供了上述的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将所述水溶性氨基酸的碱溶液与所述金属富勒烯混合，进行亲核加成反应，即得到所述氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒。

本发明中，所述金属富勒烯是用高效液相色谱结合富勒烯/内嵌金属富勒烯专用色谱柱Buckyprep/Buckyprep-M纯化得到的。

本发明制备方法同样适用于空心富勒烯，即将所述金属富勒烯用空心富勒烯替换进行反应；所述空心富勒烯包括C₆₀或C₇₀。

上述的制备方法中，所述水溶性氨基酸的碱溶液中碱的质量分数可为10～50％，具体可为14％或10～30％；所述水溶氨基酸与所述碱的摩尔比可为1：1～10，具体可为1：2或1：1～8；所述水溶性氨基酸的碱溶液使用的碱溶液具体可为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；

所述水溶性氨基酸与所述金属富勒烯的摩尔比可为1～1000：1，具体可为1000：1或50～1000：1。

上述的制备方法中，所述亲核加成反应的温度可为50～100℃，具体可为50℃；所述亲核加成反应的时间可为1～48h，具体可为1.5h、2h、4h、24h、1.5～24h或1～30h。

上述的制备方法中，在所述亲核加成反应之后还包括过滤除去杂质的步骤。

本发明中，所述过滤除去杂质具体包括：先过滤除去未反应的所述金属富勒烯固体颗粒，然后用透析袋透析除去未反应的所述水溶性氨基酸，再用微孔滤膜过滤；具体使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子杂质(具体为水溶性氨基酸和碱)、220nm微孔滤膜过滤。

本发明制备的水溶性富勒烯纳米颗粒，表面修饰的羧基残基便于进一步与生物配体偶联，为后续生物应用提供了更多的可能。

本发明具有以下优点：

1、本发明通过固液法制备的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；0≤x<50；0≤y<20具有水溶性。

2、本发明不需有机溶剂的介入，无需分离中间产物，无需无水无氧等条件，具有制备方法简单经济、绿色环保等优点。

3、本发明巧妙利用氨基酸中氨基的亲核性，经过一步反应大量制得氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒。本发明制备方法同样适用于C₆₀、C₇₀等空心富勒烯，Y₃N@C₈₀、Lu₃N@C₈₀等内嵌富勒烯；以及赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸等水溶性氨基酸，因而，具有一定普适性和便于实现规模化生产等优点。

4、本发明制备的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y金属富勒烯纳米颗粒具有粒径分布小、窄等特点。

附图说明

图1为本发明实施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆热重分析热重及微商热重曲线。

图2为本发明实施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的红外光谱图。

图3为本发明实施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的紫外-可见吸收谱图。

图4为本发明实施例1所制备的金属富勒烯Gd@C₈₂纳米颗粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7时平均水合半径。

图5为本发明实施例1所制备的金属富勒烯Gd@C₈₂纳米颗粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7时Zeta电位。

图6为本发明实施例1所制备的金属富勒烯Gd@C82纳米颗粒在0.5T磁场下用反转-恢复序列测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图。

图7为本发明实施例2和3所制备的金属富勒烯Gd@C₈₂不同氨基酸纳米颗粒在pH＝7时平均水合半径。

图8为本发明实施例4所制备的空心富勒烯C₇₀纳米颗粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的热重及微商热重曲线。

图9为本发明实施例4所制备的空心富勒烯C₇₀纳米颗粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7时平均水合半径。

图10为本发明实施例5所制备的空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸纳米颗粒在pH＝7时平均水合半径。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，金属富勒烯(M@C_2n)是用高效液相色谱结合富勒烯/内嵌金属富勒烯专用色谱柱Buckyprep/Buckyprep-M纯化得到的。

实施例1、

把约10mg Gd@C₈₂固体加入10ml单口瓶中，加入6mlNaOH质量分数为14％的β-丙氨酸碱溶液(氨基酸与氢氧化钠的摩尔比具体为1：2；β-丙氨酸与Gd@C₈₂的摩尔比为1000：1)，50℃下剧烈搅拌1.5h，黑色固体逐渐溶解生成棕黑色溶液。过滤除去未反应的少量固体粉末，滤液使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子杂质，使用220nm微孔滤膜过滤后得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

表1β-丙氨酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒元素分析结果

对本发明β-丙氨酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒进行元素分析所得碳、氮、氢元素比，如表1所示。由表1可知，根据热重曲线分析可以得出原固体粉末中含10.9％的水，经过计算约为13个H₂O分子(如图1)，再结合元素分析，进一步推测得到该物质的平均分子式为Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

图2为红外光谱在3300cm^-1左右的强的吸收峰归属为O-H的伸缩振动，在1740和1630cm^-1处中等的吸收峰归属为C＝O的伸缩振动、N-H的弯曲振动，在1568，1400和1300cm^-1处的强峰分别为C＝C的伸缩振动、)O-H的弯曲振动以及C-O、C-N的伸缩振动峰。由图2可知，本发明β-丙氨酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒中含有上述的亲水基团，即本发明是水溶性。

由图3可知，本发明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在400nm波长以内有强吸收。

由图4可知，本发明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒径为127.7±0.5nm。

由图5可知，本发明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中Zeta电位为-44.7mV。

由图6可知，本发明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在0.5T磁场下纵向弛豫率r₁为65.53mM^-1s^-1，是临床使用Gd－DTPA的10倍以上。

实施例2、

用经过提纯的10mg Gd@C₈₂固体与6mL NaOH质量分数为14％的L-赖氨酸碱溶液(L-赖氨酸与NaOH的摩尔比为1:2)混合，50℃下剧烈搅拌2h，黑色固体逐渐溶解生成棕黑色溶液，其余条件同本发明实施例1。

实施例3、

用经过提纯的10mg Gd@C₈₂固体与6mL NaOH质量分数为14％的L-丝氨酸碱溶液(L-丝氨酸与NaOH的摩尔比为1:2)混合，50℃下剧烈搅拌4h，黑色固体逐渐溶解生成棕红色溶液，其余条件同本发明实施例1。

如图7所示，为Gd@C₈₂不同氨基酸纳米颗粒在pH＝7的水中的粒径分布曲线。由图7和表2可知，赖氨酸反应产物的平均粒径最小，分布最宽；丝氨酸反应产物的平均粒径最大，分布最窄。

表2 Gd@C₈₂不同氨基酸纳米颗粒在pH＝7的水中的平均粒径及Z电势

实施例4、

用经过提纯的10mg C₇₀固体与6ml NaOH质量分数为14％的β-丙氨酸碱溶液(β-丙氨酸与NaOH的摩尔比为1:2)混合，50℃下剧烈搅拌24h，黑色固体逐渐溶解生成棕红色溶液，其余条件同本发明实施例1。

表3 C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆元素分析结果

由图8和表3可知，由热重曲线分析推测出原固体粉末中含11.0％的水，经过计算约为14个H₂O分子(如图8)，经推算，该纳米颗粒的平均分子式为C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

由图9说明C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒径为139.8±0.8nm。

实施例5、

用经过提纯的10mg C₆₀固体与6mlNaOH质量分数为14％的β-丙氨酸碱溶液(β-丙氨酸与NaOH的摩尔比为1:2)混合，50℃下剧烈搅拌24h，黑色固体逐渐溶解生成棕红色溶液，其余条件同本发明实施例1。

由图10说明空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸纳米颗粒在pH＝7时平均水合半径为139.8±1.0nm。