一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，将经过热处理的大豆蛋白在高速搅拌条件下利用氧化海藻酸钠交联后，冷冻干燥制得基于大豆蛋白的生物活性组织工程支架，该方法制备的多孔支架具有较大的孔径和孔隙率及良好的生物相容性，并具有一定的生物活性，能够促进细胞基质的分泌和干细胞的定向分化，可作为细胞的理想载体应用于组织工程领域。
【专利说明】一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程学【技术领域】，尤其涉及一种以大豆蛋白为主要原料的具有生 物活性的组织工程支架的制备方法。
【背景技术】
[0002] 组织工程支架是能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，在一定程度上是 细胞外基质的暂时替代物，是组织工程化组织的最基本构架。以胶原蛋白、丝素蛋白、角蛋 白等为代表的动物性来源蛋白以其优异的生物相容性和生物可降解性等优点，在组织工程 中得到广泛应用。然而，动物性蛋白作为支架材料也存在着明显的缺陷，包括不同来源的蛋 白性质存在较大差异、较差的湿态强度以及一定的免疫原性，尤其是其可能携带有动物病 毒的风险，例如由牛组织提取的胶原蛋白可能携带有疯牛病病毒和口蹄疫病毒等，在植入 体内后是否带来危害仍没有明确的科学定论。
[0003] 大豆蛋白是一种在材料领域被广泛应用的植物性蛋白，与胶原等动物性蛋白一样 具有优异的细胞亲和性，且其不含有动物病毒，作为支架材料使用更为安全。此外，提取的 大豆蛋白中仍含有微量的异黄酮组分，这种植物雌激素已被证实能够促进细胞基质的分泌 及诱导干细胞的定向分化，因此具有一定的生物活性。但未经改性的大豆蛋白是一类球状 蛋白，其水溶性及力学性能等均不理想，这极大的限制了其在组织工程领域的应用。大豆蛋 白的改性方法有很多，其中热处理被认为是最简单而又有效的方式，研宄显示一定条件下 的热处理能够破坏大豆蛋白间的非共价键，形成可溶性聚集体，从而提高大豆蛋白的溶解 度，同时能够提高大豆蛋白基材的机械强度。
[0004] 英文文献《Novel soy protein scaffolds for tissue regeneration ：Material characterization and interaction with human mesenchymal stem cells〉〉公开了以经 过热处理的大豆蛋白为主要原料，通过转谷氨酰胺酶的交联作用并冷冻干燥后得到的一种 多孔组织工程支架，支架的降解速率可通过酶用量进行调控。但利用此方法制备的支架的 孔径偏小，普遍分布在1〇~125 μ m之内，不利于细胞的进入与增殖。
[0005] 申请号为201310641686. 8的中国专利《软骨组织工程支架材料及其制备方法》则 公开了一种以海藻酸钠和壳聚糖为基材，通过活化海藻酸钠的羧基，与壳聚糖氨基发生交 联反应形成凝胶，将凝胶冻干后形成的三维多孔支架。其不足之处在于：活化羧基所使用的 碳二亚胺盐酸盐（EDC)和N-琥珀酰亚胺（NHS)有一定的细胞毒性，若不能完全去除将对支 架的生物相容性造成影响；制备的支架缺乏生物活性，无法对细胞行为进行调控，此外这个 方法并没有对支架的具体性能进行详细的说明。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有生物活性的组织工程支架 的制备方法，该组织工程支架具有较好的孔径孔隙率及良好的生物相容性。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现： 一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，将热处理后的大豆蛋白在高速搅拌条 件下利用氧化海藻酸钠交联后，冷冻干燥制得基于大豆蛋白的生物活性组织工程支架。
[0008] 具体的，所述的热处理步骤如下：将大豆蛋白分散于水中配成质量浓度为1~5%的 悬浊液，在80~120°C恒温下搅拌0. 5~2h后过滤除去不溶组分，滤液经冷冻干燥后得到热处 理后的大豆蛋白。
[0009] 热处理的目的是使大豆蛋白在经过一定时间的处理后变性形成可溶性聚集结构， 从而在一定程度上增强大豆蛋白的溶解性，发明中需用到的大豆蛋白要为均匀浓溶液，不 溶物的存在会降低制备的支架的强度，而未经此热处理步骤的大豆蛋白溶解性不理想。
[0010] 具体的，所述的在高速搅拌状态下利用氧化海藻酸钠交联的步骤如下： 521 :将热处理后的大豆蛋白溶于浓度为0. 2~1%的氯化钙溶液中配制成浓度为8~15% 的溶液； 522 :将S21中配制的溶液进行高速搅拌处理使溶液充分起泡，在保持同等搅拌速率 下，滴加浓度为〇. 5~2%的氧化海藻酸钠溶液并继续反应l~2h，通过交联作用形成多孔凝 胶。
[0011] 一定浓度的氯化钙溶液能够促进大豆蛋白的溶解并能增强制备的支架的机械强 度；通过大豆蛋白的氨基与氧化海藻酸钠上的醛基发生席夫碱反应，随着反应的进行，交联 度逐渐增加，反应液逐渐形成一种不流动的凝胶状态，这时反应液中由于高速搅拌而形成 的气泡就会被固定，反应液会形成一种富含气泡的凝胶，而这些气泡在随后的制备条件中 被冻干后会形成支架的多孔结构。
[0012] 所述的交联后的冷冻干燥条件为先于_4~ -20°C冷冻12~24h，后在冻干机中冷冻 干燥 12~24h。
[0013] 将交联后的多孔凝胶冷结成冰，然后置于冻干机中冷冻干燥，其目的是为了制备 多孔支架，冷冻温度对孔径和孔隙率虽有一定的影响，但是在实际实验中发现其影响是极 小的，本发明中支架的孔结构主要来源于多孔凝胶中的气泡，所以冷冻温度、时间、冻干机 的温度、冻干时间等对支架中的孔径及孔隙率影响不是很大，本发明并没有采用定向冷冻 技术，由于其只是在冷冻时采取了一些特殊的措施，为了满足一些组织工程的一些特殊的 需要，而本发明并不必要采用这个技术就能达到目的。
[0014] 所述的过滤为抽滤，因溶液粘度较高，抽滤方式能有效的除去不溶组分。
[0015] 所述的热处理步骤中的冷冻干燥为将滤液置于_4~ -20°C冷冻12~24h，后在冻干 机中冷冻干燥12~24h。
[0016] 首先将热处理并过滤后的大豆蛋白溶液进行冷冻处理，优选地，可以将大豆蛋白 溶液放进冰箱中冻结成冰，然后再置于冷干机中冷冻干燥，这一步骤能将溶液中的水分除 去，以获得具有可溶性结构的大豆蛋白原料，此时的冰箱的冷冻温度、冷冻时间、冻干机的 温度和冻干时间等参数对形成的大豆蛋白原料质量是没有多大影响的。
[0017] 所述的高速搅拌的速率为1000~3000rpm。
[0018] 不经过高速搅拌，单纯将溶液交联后形成的凝胶冻干后也可以形成多孔结构，但 仅利用冻干方法形成的孔径较小且不规则，而结合高速搅拌，大豆蛋白溶液形成的气泡直 径大且规则，最终制备的支架的孔径大，孔隙率高。
[0019] 所述的大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为10~100:1。
[0020] 氧化海藻酸钠是通过强氧化剂对海藻酸钠进行氧化，使海藻酸钠部分醛糖单元的 羟基转变成醛基而得到的一种生物交联剂，与其它交联剂相比，其生物毒性较低。
[0021] 所述的氧化海藻酸钠的氧化度为20~80%。不同的氧化度对交联反应及制备的支 架的强度有一定影响。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1、本方法以植物来源的大豆蛋白为制备支架的主要原料，与传统的胶原、丝素蛋白、白 蛋白等动物性蛋白作为原料相比，其蛋白性质更为均一，并且不会携带有动物性病毒，使用 更为安全。
[0023] 2、本方法操作简单，反应在水溶液中进行，所采用试剂均无毒无害，不会污染环 境，也可避免支架植入体内后由于有毒化学物质残留而带来的生物危害。
[0024] 3、本方法制备的大豆蛋白支架孔隙率在80%以上，孔径大小为200~400 μ m并分布 均匀，支架具有良好的细胞亲和性并具有一定促进干细胞定向分化的生物活性。
【具体实施方式】
[0025] 为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明作进一步 阐述。
[0026] 实施例1 : 一种基于大豆蛋白的生物活性组织工程支架的制备方法，包括如下制备步骤： 51. 热处理：将大豆蛋白分散于水中配成质量浓度为1%的悬浊液，在80°C恒温下搅拌 0. 5h后抽滤除去不溶组分，滤液置于-20°C冷冻12h，后在冻干机中冷冻干燥12h得到热处 理后的大?蛋白； 52. 氧化海藻酸钠交联：将热处理后的大豆蛋白溶于浓度为0. 2%的氯化钙溶液中配 制成浓度为8%的溶液，后将配制的溶液以IOOOrpm的搅拌速率进行搅拌以使其充分起泡， 在保持同等搅拌速率下，滴加浓度为〇. 5%的氧化海藻酸钠溶液并继续反应lh，通过交联作 用形成多孔凝胶，所述氧化海藻酸钠氧化度为20%，大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为 10:1 ； 53. 冷冻干燥：将S2中的多孔凝胶先于-20°C冷冻12h，后在冻干机中冷冻干燥12h即 得多孔支架。
[0027] 实施例2 : 一种基于大豆蛋白的生物活性组织工程支架的制备方法，包括如下制备步骤： 51. 热处理：将大豆蛋白分散于水中配成质量浓度为5%的悬浊液，在120°C恒温下搅 拌2h后抽滤除去不溶组分，滤液置于-4°C冷冻24h，后在冻干机中冷冻干燥24h得到热处 理后的大?蛋白； 52. 氧化海藻酸钠交联：将热处理后的大豆蛋白溶于浓度为1%的氯化钙溶液中配制成 浓度为15%的溶液，后将配制的溶液以3000rpm的搅拌速率进行搅拌以使其充分起泡，在保 持同等搅拌速率下，滴加浓度为2%的氧化海藻酸钠溶液并继续反应2h，通过交联作用形成 多孔凝胶，所述氧化海藻酸钠氧化度为80%，大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为100:1 ; 53. 冷冻干燥：将S2中的多孔凝胶先于-4°C冷冻24h，后在冻干机中冷冻干燥24h即 得多孔支架。
[0028] 对比例I 除氯化钙浓度为0. 05%外，其它条件同实施例1。
[0029] 对比例2 除氯化钙浓度为5%外，其它条件同实施例2。
[0030] 对比例3 除S2中大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为5:1外，其它条件同实施例1。
[0031] 对比例4 除S2中大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为300:1外，其它条件同实施例2。
[0032] 对比例5 除S2中搅拌速率为500rpm外，其它条件同实施例1。
[0033] 对比例6 除S2中搅拌速率为5000rpm外，其它条件同实施例2。
[0034] 对卖施例1~2和对比例〗~6讲行忡能测试，所得结里如下：
【权利要求】
1. 一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在于，将经过热处理的大豆 蛋白在高速搅拌条件下利用氧化海藻酸钠交联后，冷冻干燥制得基于大豆蛋白的生物活性 组织工程支架。
2. 根据权利要求1所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的热处理步骤如下：将大豆蛋白分散于水中配成质量浓度为1~5%的悬浊液，在 80~120°C恒温下搅拌0. 5~2h后过滤除去不溶组分，滤液经冷冻干燥后得到热处理后的大 ii蛋白。
3. 根据权利要求1所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的在高速搅拌条件下利用氧化海藻酸钠交联的步骤如下： 521 :将热处理后的大豆蛋白溶于质量浓度为0. 2~1%的氯化钙溶液中配制成质量浓度 为8~ 15%的溶液； 522 :将S21中配制的溶液进行高速搅拌处理使溶液充分起泡，在保持同等搅拌速率 下，滴加质量浓度为〇. 5~2%的氧化海藻酸钠溶液并继续反应l~2h，通过交联形成多孔凝 胶。
4. 根据权利要求1所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的交联后的冷冻干燥条件为先于_20~ _4°C冷冻12~24h，后在冻干机中冷冻干燥 12?24h〇
5. 根据权利要求2所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的过滤为抽滤。
6. 根据权利要求2所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述热处理步骤中的冷冻干燥为将滤液置于_20~ _4°C冷冻12~24h，后在冻干机中冷冻 干燥 12~24h。
7. 根据权利要求1或3所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征 在于，所述的高速搅拌的速率为l〇〇〇~3000rpm。
8. 根据权利要求3所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的大豆蛋白与氧化海藻酸钠的质量比为1〇~1〇〇:1。
9. 根据权利要求1所述的一种具有生物活性的组织工程支架的制备方法，其特征在 于，所述的氧化海藻酸钠的氧化度为20~80%。
【文档编号】A61L27/56GK104491926SQ201410833234
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】徐红蕾, 田冶, 何晓帆 申请人:广东省医疗器械质量监督检验所